同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR引物及其检测方法与流程

文档序号:12056641阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR引物,其特征是引物对如下:

引物ompC:

正向引物F:5’-AACACTGAAA GCTCCAGCGA-3’;

反向引物R:5’-CGTCGGTACG TTTGGAGTGA-3’;

引物ahal:

正向引物F:5’-AGACGGTACC ACTTTCGACG-3’

反向引物R:5’-ATGTGACGCG GGTCTATGTC-3’。

2.权利要求1所述同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的检测方法,其特征是:以引物ompC和引物ahal为靶基因,通过双重PCR方法,以待检样品DNA为模板,以引物ompC和引物ahal扩增靶基因,检测是否存在扩增产物,有对应条带则表明检测结果为阳性。

3.如权利要求2所述同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的检测方法,其特征是具体步骤如下:

(1)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的DNA提取:扩大培养肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌,采用常规细菌基因组DNA抽提试剂盒提取肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌菌液的DNA,溶解在pH7.5的TE缓冲液中,置于-20℃保存备用;

(2)双重PCR反应:引物ompC和引物ahal在同一反应体系中同时进行双重PCR反应,其中取浓度均为100mmol/L的上下游引物各0.5-1μL,

(3)电泳检测:取5-10 µL PCR检测产物,在1%含goldview染色剂的琼脂糖凝胶上电泳检测,结束后将胶放在凝胶成像系统下观察结果并拍照记录;

(4)结果分析:在418bp位置处有扩增条带代表样品中含有肺炎克雷伯氏菌,213bp位置处有扩增条带代表样品中含有豚鼠气单胞菌;若对应位置无扩增条带,表示样品为阴性,待检测样品中不含有肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌。

4.如权利要求3所述同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的同步检测的方法,其特征是:步骤(2)中PCR反应条件及检测体系具体如下:

PCR检测体系:两组浓度均为100mmol/L的上下游引物各0.5-1μL,含Mg2+的10×Buffer 3-4μL,浓度为25g/L dNTP 2-3 μL,Taq酶0.2 µL,DNA模板各1-3 μL,灭菌蒸馏水补齐至25μL;

PCR 反应条件:94℃预变性3-5 min,94℃变性30-45 s、56℃复性30-45 s、72℃延伸30-60 s、30-35个循环,然后72℃温育7min,最后降温至4-12℃。

5.如权利要求3所述同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的同步检测的方法,其特征是:步骤(3)所述电泳检测条件为电压为100-140V,时间为40-60min。

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