本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
背景技术：
：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体之间通过α-氨基和β-羧基形成肽键之后生成的同聚酰胺(γ-L-PGA，γ-D-PGA，γ-DL-PGA)，通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，分子质量一般在100～1000kD。γ-PGA是一种水溶性和可生物降解的生物高分子物质，对人体和环境无毒害作用，在食品、化妆品、医药和水处理等领域具有非常广泛的用途。γ-PGA的生产方法主要有化学合成法、提取法和发酵法等。化学法合成路线长，副产物多，而且化学合成的γ-PGA在土壤中分解速度慢，因此被列为环境污染的原因之一。早期日本生产γ-PGA多采用提取法，用乙醇将纳豆中的γ-PGA分离提取出来。提取法获得的γ-PGA浓度较低，且有波动，工艺复杂，生产成本高，因此也不能被广泛接受。目前主要采用微生物发酵法生产γ-PGA。微生物发酵法生产γ-PGA具有生产过程容易控制，发酵产量稳定，提取率高，目标产物产量较高，以及产物分子量适宜，环境友好等优点，是大规模生产γ-PGA的主要方法，正成为国内外γ-PGA行业的研究热点。生产成本是制约γ-PGA应用的关键因素之一。现有生产工艺中的氮源和各种生物素大大提高了γ-PGA的生产成本。降低成本的两条途径，一为降低培养基成本，二为提高菌株的生产能力。目前虽然菌种的生产能力有很大的提高，但其生产成本高、周期长、生产效率地，均是工业化规模生产γ-PGA的障碍。因此，寻找高效、低成本的γ-PGA生产菌株及其工艺条件仍是今后研究的方向。技术实现要素：本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2，已于2016年05月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNO.12426。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2简称为枯草芽孢杆菌KH2。本发明保护枯草芽孢杆菌KH2在生产γ-聚谷氨酸中的应用。本发明还保护一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：培养枯草芽孢杆菌KH2。本发明还保护一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2。所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在7L发酵罐中进行。所述培养的培养条件为：37℃培养48小时(第0-24小时转速为500rpm，第25-48小时转速为700rpm)，整个过程通气量为1L/min。所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在5L发酵罐中进行。所述培养的培养条件为：37℃培养48小时(第0-24小时转速为500rpm，第25-48小时转速为300rpm)，整个过程通气量为1L/min，旋转半径为33mm。所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在三角瓶中进行。所述培养的培养条件为：32.5-37℃，220rpm培养48小时。所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在三角瓶中进行。所述培养的培养条件为：32.5℃，220rpm培养48小时。所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在三角瓶中进行。所述培养的培养条件为：37℃，220rpm培养48小时。本发明还保护一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤(a)和步骤(b)：步骤(a)：采用种子培养基培养枯草芽孢杆菌KH2，得到种子液；步骤(b)：将步骤(a)的种子液接种至发酵培养基进行培养。本发明还保护一种培养枯草芽孢杆菌KH2的方法，包括如下步骤：采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2。本发明还保护一种枯草芽孢杆菌KH2的方法，依次包括如下步骤(a)和步骤(b)：步骤(a)：采用种子培养基培养枯草芽孢杆菌KH2，得到种子液；步骤(b)：将步骤(a)的种子液接种至发酵培养基进行培养。以上任一所述步骤(b)可在7L发酵罐中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：37℃培养48小时(第0-24小时转速为500rpm，第25-48小时转速为700rpm)，整个过程通气量为1L/min。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝10-14。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶5。以上任一所述步骤(b)可在5L发酵罐中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：37℃培养48小时(第0-24小时转速为500rpm，第25-48小时转速为300rpm)，整个过程通气量为1L/min，旋转半径为33mm。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝10-14。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶5。以上任一所述步骤(b)可在三角瓶中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：32.5-37℃，220rpm培养48小时。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝7-12。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶100。以上任一所述步骤(b)可在三角瓶中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：37℃，220rpm培养48小时。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝7-12。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶100。以上任一所述步骤(b)可在三角瓶中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：32.5℃，220rpm培养48小时。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝7-12。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶100。以上任一所述步骤(a)中，所述培养条件具体可为：37℃，220rpm培养。以上任一所述种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下：葡萄糖10-40g/L，酵母粉2-7g/L，谷氨酸钠5-15g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L；所述溶剂为水。所述种子培养基的pH为6.5-7.0。所述种子培养基的pH具体为7.0。所述所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度具体可为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，谷氨酸钠10g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.25g/L。以上任一所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：碳源20-80g/L，谷氨酸钠20-50g/L，酵母提取物2-15g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，磷酸氢二钾1-3g/L；所述溶剂为水。所述碳源为工业葡萄糖或甘油。所述发酵培养基的pH为6.5-7.5。所述发酵培养基的pH为7.0。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖60g/L，谷氨酸钠30g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖60g/L，谷氨酸钠30g/L，酵母提取物2g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：甘油40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖20g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖60g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖80g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠30g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠50g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物7g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物10g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物15g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。本发明还保护一种用于培养枯草芽孢杆菌KH2的试剂盒，包括以上任一所述发酵培养基。本发明还保护一种用于生产γ-聚谷氨酸的试剂盒，包括以上任一所述发酵培养基。以上任一所述试剂盒还包括以上任一所述种子培养基。本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2。本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2生产γ-PGA，以工业葡萄糖为底物，以0.96-1.20克/升/小时的转化率高效发酵生产γ-PGA，γ-PGA浓度最高可达46.0克/升，其中γ-D-PGA所占比例为84％-86％。本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2生产γ-PGA，生产能力高，培养基成分简单，同时也可以控制γ-PGA的生产成本。附图说明图1为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2生产γ-PGA构型液相检测图。图1A为标准品高效液相色谱图。图1B为枯草芽孢杆菌KH2发酵液水解后的高效液相色谱图。图2为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2生产γ-PGA发酵曲线。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。γ-PGA标准品：喀斯玛商城，货号：94791。L-谷氨酸标准品：喀斯玛商城，货号：LGC.MM133300。D-谷氨酸标准品：喀斯玛商城，货号：D810325。工业葡萄糖：淄博虹宇工业糖有限公司。甘油：山东玉玲化工有限公司。斜面培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在斜面培养基中的浓度如下：蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠10克/升，琼脂粉15克/升；所述溶剂为水。斜面培养基的pH为7.0。121℃灭菌15分钟。种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在种子培养基中的浓度如下：葡萄糖20克/升，酵母粉5克/升，谷氨酸钠10克/升，磷酸氢二钾2克/升，硫酸镁0.25克/升；所述溶剂为水。所述种子培养基的pH为7.0。115℃条件下灭菌20分钟。以下实施例中葡萄糖含量和谷氨酸含量采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。以下实施例中样品溶液中的γ-PGA含量的检测方法为：取2mL样品溶液，加入2mLCTAB溶液，充分震荡并尽量避免反应液产生泡沫，然后静置3分钟，250nm下检测吸光度值。配制不同浓度γ-PGA标准品溶液，采用相同方法进行检测，根据标准曲线计算样品中γ-PGA的含量。以下实施例中样品溶液中γ-L-PGA和γ-D-PGA纯度的测定方法为：(1)取样品溶液，去离子水透析24小时(每4小时换一次水)。(2)将步骤(1)透析后的溶液冷冻干燥，然后将冷冻干燥得到粉末用6MHCl溶液溶解，105℃水解10小时，然后加入6MNaOH溶液中和，得到水解物。(3)将步骤(2)得到的水解物用HPLC检测L-谷氨酸和D-谷氨酸的含量。HPLC检测条件为：手性柱，流动相为2mmol/LCuSO4水溶液，流速0.5mL/min，柱温25℃，进样5μL，紫外检测器检测，检测波长254nm。L-谷氨酸标准品的保留时间为23.05min，在相同条件下出峰位置为±1min以内，可以认定为同一物质。D-谷氨酸标准品的保留时间为15.31min，在相同条件下出峰位置为±1min以内，可以认定为同一物质。γ-L-PGA占比按以下公式计算：L-谷氨酸÷(L-谷氨酸+D-谷氨酸)×100％。γ-D-PGA占比按以下公式计算：D-谷氨酸÷(L-谷氨酸+D-谷氨酸)×100％。实施例1、菌种的分离、诱变筛选和鉴定一、菌种的分离从北京某豆制品生产厂附近筛选取得土样，称取5克土样于250ml三角瓶中，加入100ml生理盐水，充分混均后用无菌水稀释10000倍涂布于LB固体培养基上，37℃培养，待长出单菌落后，挑选形态大、黏度高的单菌落，接种于10m1种子培养基中，37℃，220转/分钟震荡培养48小时，测定发酵液中γ-PGA浓度，挑取一株γ-PGA产量最高的菌株，接种于LB培养基斜面上冷藏备用。二、离子束诱变筛选将步骤一得到的菌株接种于LB液体培养基中培养至对数中期(OD600nm＝0.5-0.6)，将培养体系离心后将菌体沉淀用生理盐水悬浮，制成菌悬液。吸取100μL菌悬液涂布于直径为3.5cm的无菌空白培养皿上(涂布直径约1.5cm)，无菌风吹干制成菌膜后进行离子注入，功率为120W，通气量为8slpm，通气时间分别为1分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、4分钟。离子注入后的平皿用1mL生理盐水洗脱。各不同注入剂量分别吸取100μL，稀释后涂布在LB固体培养基上，待长出单菌落后，挑选黏度较大的菌落，接种于10ml发酵培养基中，37℃，200转/分钟震荡培养48小时，测定发酵液中γ-PGA浓度。经过多次筛选，获得一株γ-PGA产量显著提高的菌株，将其命名为菌株KH2。三、菌株KH2的鉴定按照“伯杰细菌鉴定手册”(第九版)中描述的方法对菌株KH2进行形态特征观察和生理生化特性鉴定。菌株KH2为革兰氏阳性菌，有芽孢，细胞直杆状，大小为(0.7-0.9)μm×(1.5-3.0)μm。菌株KH2可利用麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖。不能利用乳糖、木糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖，柠檬酸盐试验阴性。为准确鉴定菌株KH2，对其16SrDNA基因进行测序，将测得的序列与NCBI数据库中的多株枯草芽孢杆菌的16SrDNA序列进行对比，证实菌株KH2为枯草芽孢杆菌，将其命名为枯草芽孢杆菌KH2。枯草芽孢杆菌KH2生理生化特征比较结果见表1。表1中，+表示实验阳性或生长，-表示实验阴性或不生长。表1枯草芽孢杆菌KH2生理生化特征生理生化特征枯草芽孢杆菌KH2淀粉水解试验+明胶水解试验+石蕊牛奶+葡萄糖+果糖+木糖-蔗糖+乳糖-麦芽糖+阿拉伯糖-过氧化氢酶+硝酸盐还原+柠檬酸盐-四、枯草芽孢杆菌KH2的保藏枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2，已于2016年05月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNO.12426。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2简称为枯草芽孢杆菌KH2。五、枯草芽孢杆菌KH2的遗传稳定性将枯草芽孢杆菌KH2进行传代培养以考察其遗传稳定性，每24小时传代一次，传代15代，每一代进行摇瓶发酵测定γ-PGA产量均无明显变化，具有良好的遗传稳定性。实施例2、利用枯草芽孢杆菌KH2在三角瓶中发酵生产γ-PGA一、实验一1、将枯草芽孢杆菌KH2接种至斜面培养基中，37℃静置培养24小时。2、完成步骤1后，在无菌条件下用接种环接2环，置于装有20m1种子培养基的100ml三角瓶中，37℃，220rpm培养12小时，得到种子培养液(OD600nm＝7-12)。3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液接种至装有50ml发酵培养基(1)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。发酵培养基(1)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(1)中的浓度如下：工业葡萄糖40克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(1)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。4、完成步骤3后，取发酵液，6000rpm离心5min，取上清液。向上清液中加入4倍上清液体积的冰乙醇，4℃静置过夜。然后8000rpm、4℃离心12min收集沉淀，将沉淀重新溶解在与发酵液等体积的去离子水中，得到样品溶液。检测样品溶液中的γ-PGA含量和γ-D-PGA所占比例。经过测定，γ-PGA含量为23.4克/升，γ-D-PGA所占的比例为84％-86％(图1)。二、实验二1、同实验一的步骤1。2、同实验一的步骤2。3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液接种至装有50ml发酵培养基(2)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。发酵培养基(2)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(2)中的浓度如下：甘油40克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(2)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量为15.1/升。三、实验三1、同实验一的步骤1。2、同实验一的步骤2。3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液接种至装有50ml发酵培养基(3)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。发酵培养基(3)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(3)中的浓度如下：工业葡萄糖40克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸13.5克/升，氯化铵6.8克/升，硫酸锰0.03克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(3)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量为8/升。四、实验四1、同实验一的步骤1。2、同实验一的步骤2。3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液分别接种至装有50ml发酵培养基(4)-(7)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。发酵培养基(4)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(4)中的浓度如下：工业葡萄糖20克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(4)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。发酵培养基(5)：将发酵培养基(4)中的工业葡萄糖浓度替换为40克/升，其余组分不变。发酵培养基(6)：将发酵培养基(4)中的工业葡萄糖浓度替换为60克/升，其余组分不变。发酵培养基(7)：将发酵培养基(4)中的工业葡萄糖浓度替换为80克/升，其余组分不变。4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量如表2所示。表2γ-PGA含量五、实验五1、同实验一的步骤1。2、同实验一的步骤2。3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液分别接种至装有50ml发酵培养基(8)-(11)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。发酵培养基(8)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(8)中的浓度如下：工业葡萄糖40克/升，谷氨酸钠20克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(8)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。发酵培养基(9)：将发酵培养基(8)中的谷氨酸钠浓度替换为30克/升，其余组分不变。发酵培养基(10)：将发酵培养基(8)中的谷氨酸钠浓度替换为40克/升，其余组分不变。发酵培养基(11)：将发酵培养基(8)中的谷氨酸钠浓度替换为50克/升，其余组分不变。4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量如表3所示。表3γ-PGA含量六、实验六1、同实验一的步骤1。2、同实验一的步骤2。3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液分别接种至装有50ml发酵培养基(12)-(15)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。发酵培养基(12)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(12)中的浓度如下：工业葡萄糖40克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(12)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。发酵培养基(13)：将发酵培养基(12)中的酵母提取物浓度替换为7克/升，其余组分不变。发酵培养基(14)：将发酵培养基(12)中的酵母提取物浓度替换为10克/升，其余组分不变。发酵培养基(15)：将发酵培养基(12)中的酵母提取物浓度替换为15克/升，其余组分不变。4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量如表4所示。表4γ-PGA含量七、实验七1、同实验一的步骤1。2、同实验一的步骤2。3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液分别接种至装有50ml发酵培养基(16)的250ml三角瓶中，37℃，220rpm培养48小时。发酵培养基(16)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(16)中的浓度如下：工业葡萄糖60克/升，谷氨酸钠30克/升，酵母提取物2克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(16)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量为41.4克/升。实施例3、利用枯草芽孢杆菌KH2在5L发酵罐中发酵生产γ-PGA1、将枯草芽孢杆菌KH2接种至含有20ml种子培养基的100ml三角瓶中，37℃，220rpm震荡培养12小时，取4ml接种至装有400ml种子培养基的1L三角瓶中，37℃，220rpm培养12小时，得到种子液(OD600nm＝10-14)。2、将400ml步骤1得到的种子培养液接种至装有2L发酵培养基(16)的5L发酵罐(上海保兴BIOTECH5升发酵罐)中，37℃培养48小时，前24小时转速为500rpm，后24小时转速为300rpm，整个过程通气量为1L/min。旋转半径为33mm。发酵培养基(16)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(16)中的浓度如下：工业葡萄糖60克/升，谷氨酸钠30克/升，酵母提取物2克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(16)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。3、完成步骤2后，取发酵液，6000rpm离心5min，取上清液。向上清液中加入4倍上清液体积的冰乙醇，4℃静置过夜。然后8000rpm、4℃离心12min收集沉淀，将沉淀重新溶解在与发酵液等体积的去离子水中，得到样品溶液。检测样品溶液中的γ-PGA含量。结果显示，γ-PGA产量达到32.5克/升。生产速率为0.68g/L×h。实施例4、利用枯草芽孢杆菌KH2在7L发酵罐中发酵生产γ-PGA1、将枯草芽孢杆菌KH2接种至20m1种子培养基的100ml三角瓶中，37℃，220转/分震荡培养12小时，然后取6ml接种至装有600m1种子培养基的1L三角瓶中，37℃，220rpm培养12小时得到种子液(OD600nm＝10-14)。2、将600ml步骤1得到的种子培养液接种至装有3L发酵培养基(17)的7L发酵罐(德国艾本德Eppendorf7升发酵罐)中，37℃培养48小时，前24小时转速为500rpm，后24小时转速为700rpm，整个过程通气量为1L/min。发酵培养基(17)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(17)中的浓度如下：工业葡萄糖60克/升，谷氨酸钠30克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(17)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。3、完成步骤2后，取发酵液，6000rpm离心5min，取上清液。检测上清液中的葡萄糖和谷氨酸含量。向上清液中加入4倍上清液体积的冰乙醇，4℃静置过夜。然后8000rpm、4℃离心12min收集沉淀，将沉淀重新溶解在与发酵液等体积的去离子水中，得到样品溶液。检测样品溶液中的γ-PGA含量。结果如图2所示。结果显示，γ-PGA产量达到46.0克/升。生产速率为1.20g/L×h。当前第1页1 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