萘醌磷酰胺类化合物及其在作为细胞铁死亡诱导剂中的用途的制作方法

本发明涉及萘醌磷酰胺类化合物及其在作为细胞铁死亡诱导剂中的用途。此外，本发明还涉及用此种化合物以及药物组合物通过诱导细胞发生铁死亡在疾病的治疗中的用途。
背景技术：
：铁死亡(ferroptosis)是2012年dixo等[dixonsj,lembergkm,lamprechtmr,etal.ferroptosis:aniron-dependentformofnonapoptoticcelldeath.cell,2012,149(5):1060-1072]新提出的一种由铁依赖的氧化损伤引起的细胞死亡模式，在形态学、生物化学和遗传学等方面与凋亡、坏死和自噬有较大区别。凋亡典型的特征包括细胞皱缩、核浓缩、染色质边集、dna降解、膜起泡、核和胞浆断裂成凋亡小体，后被邻近的细胞吞噬和降解。坏死的形态学特征是细胞和细胞器肿胀、膜破裂、核染色体溶解而不是固缩，线粒体受损，随后细胞溶解。自噬典型的特征为细胞内出现大量泡状结构，即双层膜结构的自吞噬泡，吞噬泡内为胞质及细胞器，高尔基器、核糖体、内质网等均先于核的改变而被降解，但细胞骨架成分却大部分保存。而铁死亡的特征为线粒体嵴消失及膜密度增加，同时表现为细胞质以及脂质活性氧自由基增多。铁死亡主要是由铁依赖的氧化损伤引起，涉及一系列复杂的生化反应、基因表达和信号传导。dixon等最早发现这种细胞死亡模式与小分子诱导的ras肿瘤细胞死亡有关。新的研究(friedmannaj,schneiderm,etal.inactivationoftheferroptosisregulatorgpx4triggersacuterenalfailureinmice,natcellbiol.2014,16(12):1180-91.)指出铁死亡通路还与许多病理过程有关，包括神经退行性疾病、肾功能衰竭、心血管疾病和糖尿病等。而铁死亡诱导剂的发现对深入研究铁死亡通路的生化机制，探讨其在不同疾病模型中的作用，对相关疾病治疗靶点的确证以及治疗药物的研究具有重要意义。目前已发现的铁死亡诱导剂较少，主要包括以下两类(caojy,dixonsj,mechanismsofferroptosis,cellmollifesci.2016,73(11-12):2195-209.)，a类抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运体(systemxc-)，b类抑制谷胱甘肽过氧化酶4(gpx4)。本发明人发现了一种新型铁死亡诱导剂-萘醌磷酰胺类化合物，此类化合物诱导铁依赖的细胞死亡方式，表现为活性氧增多，线粒体嵴消失及膜密度增加，同时发明人在动物体内也证实了此类化合物诱导铁死亡的发生。技术实现要素：本发明的目的是提供一类新型铁死亡诱导剂-萘醌磷酰胺类化合物，以及这些化合物作为细胞铁死亡诱导剂在疾病治疗中的用途。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：本发明的一种具有通式i的化合物及其溶剂化物、盐、复合物、同质多形体、晶型、外消旋混合物、非对映体、对映非对映体、互变非对映体、同位素标记形式、前药及其组合：其中，n为1-3的整数；r1为氢，c1-4烷基、c1-4烷氧基、卤素、c1-4卤代烷基、羟基、氰基、巯基、硝基或氨基；r2和r3满足下述两种情形之一：(1)r2和r3各自独立地选自氢、烷基、卤代烷基、环烷基、烯基、炔基和芳基所组成的组；或者(2)r2和r3连同二者所连接的n原子共同形成5-6元杂环，所述5-6元杂环选自吗啉基、硫吗啉基、噻唑烷基、噁唑基、异噁唑基、咪唑烷基、哌啶基、吡咯烷基；所述杂环任选被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自由烷基、烯基、炔基和苯基所组成的组；r4为氢，c1-4烷基、c1-4烷氧基、卤素、c1-4卤代烷基、羟基、氰基、巯基、硝基或氨基。在本发明中，优选的，通式i中：n为1；r1为氢，甲基或卤素；r2和r3为满足下述两种情形之一，(1)r2和r3各自独立地选自烷基、卤代烷基，或者(2)r2和r3连同二者所连接的n原子共同形成吗啉基、硫吗啉基、噻唑烷基、噁唑基、异噁唑基、咪唑烷基、哌啶基、吡咯烷基；r4为氢、c1-4烷基、c1-4烷氧基、卤素或羟基。更优选的，所述的具有通式i的化合物及其溶剂化物、盐、复合物、同质多形体、晶型、外消旋混合物、非对映体、对映非对映体、互变非对映体、同位素标记形式、前药及其组合选自于由下述化合物所组成的组：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-溴乙基)氨基磷酸-2-(1,4-萘醌)甲酯、氨基吗啉基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-溴-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲巯基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二甲氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n-甲基哌嗪基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(7-甲基-1,4萘醌)甲酯，及其溶剂化物、盐、复合物、同质多形体、晶型、外消旋混合物、非对映体、对映非对映体、互变非对映体、同位素标记形式、前药及其组合。进一步的，本发明还提出了所述的具有通式i的化合物及其溶剂化物、盐、复合物、同质多形体、晶型、外消旋混合物、非对映体、对映非对映体、互变非对映体、同位素标记形式、前药及其组合在制备调节细胞脂质过氧化药物中的应用。所述的具有通式i的化合物及其溶剂化物、盐、复合物、同质多形体、晶型、外消旋混合物、非对映体、对映非对映体、互变非对映体、同位素标记形式、前药及其组合在制备诱导细胞线粒体损伤药物中的应用。所述的具有通式i的化合物及其溶剂化物、盐、复合物、同质多形体、晶型、外消旋混合物、非对映体、对映非对映体、互变非对映体、同位素标记形式、前药及其组合在制备铁死亡诱导剂中的应用。以及具有通式i的化合物及其溶剂化物、盐、复合物、同质多形体、晶型、外消旋混合物、非对映体、对映非对映体、互变非对映体、同位素标记形式、前药及其组合在制备抗肿瘤药物中的应用。综上，本发明提出了一种新的铁死亡的诱导剂，该诱导剂能够诱导细胞发生铁死亡，进而达到抑制细胞，特别是肿瘤细胞增殖的目的，本发明的提出为肿瘤疾病的治疗提供了一种新的技术手段。附图说明图1为加入化合物1或化合物1+铁鳌合剂dfx作用6小时以及12小时后显微镜下观察的细胞状态；图2为加入化合物1或化合物1+铁鳌合剂dfx作用6小时后加入二氢乙啶(dhe)的显微镜下观察的细胞状态；图3为化合物1对线粒体形态的影响；图4为对照组和给药组小鼠的ptgs2mrna水平测定结果；图5为对照组和给药组小鼠的肿瘤大小。具体实施方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例1：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(1)的制备反应条件：(a)pocl3,net3,ch2cl2,0℃-rt；(b)ch3i,k2co3,丙酮,回流；(c)liaih4,thf,回流；(d)lin(tms)2,,nh3,thf,-78℃至-20℃；(e)ce(nh4)2(no3)6,ch3cn,h2o,rt.按照以上路线合成得到目标化合物，该目标化合物为黄色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.11(m,2h,arh),7.77(m,2h,arh),7.06(s,1h,ch＝c-o),4.99(m,2h,ch2o),3.07(m,4h,2ch2ch2ch3),2.74(bs,2h,nh2),1.58(m,4h,2ch2ch2ch3),0.91(m,6h,2ch2ch2ch3)。实施例2：氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯(2)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-3-甲基-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到黄色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.11(m,2h,arh),7.76(m,2h,arh),5.06(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.47(dt,4h,2ch2ch2cl),3.02(bs,2h,nh2)，2.34(s,3h)。实施例3：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯(3)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-3-甲基-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到白色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.13(m,2h,arh),7.76(m,2h,arh),5.03(m,2h,ch2o),3.02(m,4h,2ch2ch2ch3),2.77(bs,2h,nh2),2.35(s,3h,c＝cch3),1.56(m,4h,2ch2ch2ch3),0.89(m,6h,2ch2ch2ch3)。实施例4:氨基-n,n-二-(2-溴乙基)氨基磷酸-2-(1,4-萘醌)甲酯(4)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到黄色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.10(m,2h,arh),7.77(m,2h,arh),7.03(t,1h,ch＝c-o),5.05(m,2h,ch2o),3.55(m,8h,2ch2ch2cl),2.98(bs,2h,nh2)。实施例5:氨基吗啉基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(5)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到褐色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.08(m,2h,arh),7.78(m,2h,arh),7.03(t,1h,ch＝c-o),5.01(m,2h,ch2o),3.68(t,4h,2ch2ch2o),3.23(dt,4h,2ch2ch2o),2.89(bs,2h,nh2)。实施例6:氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-溴-1,4-萘醌)甲酯(6)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-3-溴-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到黄色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.18(m,2h,arh),7.80(m,2h,arh),5.21(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.48(dt,4h,2ch2ch2cl),2.97(bs,2h,nh2)。实施例7：氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲巯基-1,4-萘醌)甲酯(7)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-3-甲巯基-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到黄色油状物。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.10(m,2h,arh),7.75(m,2h,arh),5.21(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.46(dt,4h,2ch2ch2cl),2.97(bs,2h,nh2)，2.74(s,3h，ch3s)。实施例8：氨基-n,n-二甲氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(8)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到黄色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.01(m,2h,arh),7.73(m,2h,arh),7.04(t,1h,ch＝c-o),5.20(m,2h,ch2o),2.96(bs,2h,nh2)，2.82(s,6h，2nch3)。实施例9:氨基-n-甲基哌嗪基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(9)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到黄色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(m,2h,arh),7.80(m,2h,arh),7.01(t,1h,ch＝c-o),5.03(m,2h,ch2o),3.38(t,4h,2ch2ch2n),3.05(dt,4h,2ch2ch2n),2.89(bs,2h,nh2)，2.73(s，3h，nch3)。实施例10:氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(7-甲基-1,4萘醌)甲酯(11)的制备该目标化合物以1,4-二羟基-7-甲基-2-萘甲酸为原料，参照实施例1方法制备，得到黄色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.57-8.01(m,3h,arh),7.02(s,1h,ch＝c-o),4.99(m,2h,ch2o),3.12(m,4h,2ch2ch2ch3),2.77(s，3h，ch3)，2.70(bs,2h,nh2),1.56(m,4h,2ch2ch2ch3),0.92(m,6h,2ch2ch2ch3)。实施例11：对所合成通式i类化合物进行细胞毒作用评价1)实验方法：细胞株：hct116结肠癌细胞筛选方法：mtt法作用时间：48h2)结果细胞毒测试结果如下表1所示。表1：细胞毒测试结果(10μm化合物对细胞生长的抑制率)化合物编号抑制率化合物编号抑制率189.5％699.2％280.7％796.1％356.6％890.8％492.3％978.3％570.4％1088.1％由以上数据可以看出，通式i化合物对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用。通过研究发现这种杀伤作用与化合物诱导铁死亡相关。实施例12：化合物1诱导的细胞死亡方式具有铁依赖性1)实验方法：将5×105个hct116细胞/孔铺于6孔板中，待细胞生长至80％，分两组，第一组加入化合物1(10μm)，第二组加入化合物1(10μm)同时加入铁鳌合剂dfx(100μm)。作用6小时以及12小时后显微镜下观察细胞状态。2)实验结果：加入化合物1或化合物1+铁鳌合剂dfx作用6小时以及12小时后显微镜下观察的细胞状态如图1所示。由图1可知，铁鳌合剂的加入可以抑制化合物1对hct116肿瘤细胞的杀伤作用，说明化合物1诱导的死亡方式具有铁依赖性。实施例13：化合物1诱导的细胞死亡方式与氧自由基ros积累有关1)实验方法：将5×105个hct116细胞/孔铺于6孔板中，待细胞生长至80％，分两组，第一组加入化合物1(10μm)，第二组加入化合物1(10μm)同时加入铁鳌合剂dfx(100μm)。作用6小时后，加入二氢乙啶(dhe)，dhe可以被细胞内ros氧化为氧化乙啶插入dna中产生红色荧光，荧光强度与细胞内ros的量正相关。染色30分钟后，pbs漂洗两次，每次5分钟去除背景后荧光显微镜下观察。2)实验结果：加入化合物1或化合物1+铁鳌合剂dfx作用6小时后加入二氢乙啶(dhe)的显微镜下观察的细胞状态如图2所示。由图2可知，化合物1促进了细胞氧自由基ros的积累，而dfx的加入可抑制化合物1诱导的ros积累，说明化合物1诱导的细胞死亡方式与氧自由基ros积累有关。实施例14：化合物1诱导细胞线粒体嵴消失及膜密度增加1)实验方法：将5×105个hct116细胞/孔铺于6孔板中，待细胞生长至80％，分两组，第一组加入溶剂dmso，第二组加入化合物1(10μm)。作用8小时后收取细胞pbs洗两次，加入戊二醛细胞固定液固定过夜后切片，透射电镜观察。2)实验结果：化合物1对线粒体形态的影响如图3所示。由图3的透射电镜结果可以看出，化合物1使细胞线粒体嵴消失且线粒体双层膜密度增加。综合以上化合物1诱导hct116细胞发生的死亡在形态及生化基础上都与铁死亡完全吻合。实施例15：化合物1诱导体内肿瘤细胞发生铁死亡1)实验方法：取15只balb/c裸鼠(♀16-18g)，于右侧背部肩胛骨处种植2×106个hct116细胞制作药效检测的小鼠模型，6-7天后成瘤，等待瘤体长到50-100mm3大小后随机分组给药。设置：对照组和给药组(腹腔注射15mg/kg的化合物1)。2)实验结果：ptgs2为铁死亡发生的重要分子标志物，其mrna水平的上调则预示细胞将发生铁死亡。对对照组和给药组小鼠的ptgs2mrna水平进行测定，结果如图4所示，图4结果表明，给药组肿瘤组织中ptgs2的量显著高于对照组，说明化合物1诱导体内肿瘤细胞发生铁死亡。图5为对照组和给药组小鼠的肿瘤大小，由结果推测化合物1诱导肿瘤细胞发生铁死亡，降低了肿瘤生长速度。当前第1页12