本发明法涉及一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法。
背景技术：
目前胶原蛋白主要从猪皮、牛皮、鱼皮及动物骨骼中提取。动物皮肤来源的胶原蛋白受污染几率高，动物骨骼来源胶原蛋白提取率低。现有提取体系：有机酸溶液体系、胃蛋白酶-酸溶液体系和中性盐溶液体系，其中胃蛋白酶-酸溶液体系获取率最高。常见的提纯方式只是简单的利用一步柱层析进行，此方法存在生产周期长、分离效率低、产物纯度不高等缺点。长的分离周期和低的分离效率不仅增加了胶原蛋白的生产成本，而且使很多资源无法得到有效的利用。
技术实现要素：
本发明法的目的是提供一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，可以从牦牛跟腱中分离纯化i型胶原蛋白，该方法具有高效性、高选择性和易放大性。
为解决上述技术问题，本发明法采用如下技术方案：
一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
a、前处理：新鲜牛跟腱去除软组织、剔除筋膜、脂肪后，粉碎机粉碎至0.2～0.5mm大小组织块，后经质量分数20%nacl溶液浸泡5min，质量分数5%nahco3溶液浸泡30min，去掉血清等成份，消毒，以后操作全部在无菌操作下完成；将用蒸馏水洗涤后的组织小块放入氯仿与乙醇体积比为2:1的溶液对其进行脱脂，脱脂2-6h，双蒸水洗涤3次；用含4.5mol/lnacl的0.05mol/ltris-hcl缓冲液（ph7.5）充分洗涤12-36h，以去除脂质及血清等成分，低温离心；
b、抽提：将沉淀加入1l含胃蛋白酶500mg的0.5mol/l冰醋酸，搅拌并维持在低温，提取72h，每10000g离心10min，去除沉淀；
c、沉淀：在上清液中加入0.5mol/l冰醋酸，使溶液ph为2.5～3.0，通常每升提取液中加入30ml的冰醋酸，用磁力搅拌器充分搅拌，离心后弃沉淀；
d、盐析：在上清液中加入nacl至4.4mol/l，搅拌过夜，低温离心，将沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐级用2.4mol/l、1.7mol/l及1.0mol/l的nacl溶液反复盐析酸溶，最后得到的上清液即为胶原粗提液；
e、将胶原粗提液冷冻干燥得到胶原粗提物冻干品，于低温下保存
f、高效液相色谱纯化：将胶原冻干品用超纯水溶解，经滤膜过滤，取滤液上样进行色谱分离。
进一步的，所述步骤a中低温离心条件为8000r/min，30min，4℃。
进一步的，所述步骤f中色谱条件为：zorbax300sb-c18半制备色谱柱，9.4mm×25cm，流动相：a为水（85%），b为甲醇（15%）；采用线形梯度洗脱；流速：1ml.min-1；进样量：500ul；检测波长：220nm；柱温：室温，收集主峰，用于理化性质鉴定。
进一步的，所述步骤f中滤膜为0.45um滤膜。
进一步的，所述步骤a中脱脂时间为4h。
进一步的，所述步骤a中用含4.5mol/lnacl的0.05mol/ltris-hcl缓冲液（ph7.5）充分洗涤时间为24h。
进一步的，所述步骤b中搅拌并维持的低温温度为4℃。
进一步的，所述胃蛋白酶1mg含2500个活性单位。
进一步的，所述缓冲液的制备方法为：将6.06重量份的tris溶解在40重量份的ddh2o中，用4mol/lhcl调节ph至7.5，再加10重量份ddh2o，4℃保存。
本发明还提供了一种牛跟腱胶原蛋白海绵，其制备方法包括如下步骤：
（1）将步骤f中高效液相色谱纯化后的胶原戴白搅拌均匀，离心除去气泡，调节ph值至6，稀释，以1g耗牛跟腱制成50-70ml的胶原蛋白胀液为准；
（2）将胶原蛋白胀液倒入模具中，-50℃下预冻24h，经-30℃至-50℃冷冻干燥24h得胶原蛋白海绵；
（3）将胶原蛋白海绵60co辐射消毒，封装，-4℃保存备用。
优选的，步骤（1）中1g耗牛跟腱制成60ml的胶原蛋白胀液；步骤（2）中，经-40℃冷冻干燥24h得胶原蛋白海绵。
该胶原蛋白海绵是一种可吸收的外科止血、堵漏的辅料，使用安全方便可靠。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：
牛跟腱来源的胶原较皮肤来源的胶原不容易污染，更清洁，且提取率更高；胶原分子的主体部分是杆状三螺旋结构，能高度耐受胃蛋白酶的作用，但分子两端的球蛋白结构能被胃蛋白酶选择性水解。在ph值为2.5～3.0时，胃蛋白酶能顺利地将末端肽从完整的胶原主体分子上切割下来，这样交联的胶原巨型分子结构受到破坏，近似完整的胶原分子便能够从胶原纤维中分离出来而被提取，所以酶解法提取胶原的得率最高；运用高效液相色谱分离纯化i型胶原蛋白的优点是显而易见的，它有着比普通柱层析更高的柱效，灵敏度高，分离条件温和，在分离检测过程中一般没有样品损坏，易于样品回收，而且操作自动化；利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从牦牛跟腱中分离纯化i型胶原蛋白，该方法具有高效性，高选择性和易放大性。
具体实施方式
一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
1、前处理：新鲜牛跟腱去除软组织、剔除筋膜、脂肪后称取100g，粉碎机粉碎至0.2～0.5mm大小组织块，后经质量分数20%nacl浸泡5min，质量分数5%nahco3浸泡30min，去血清等成份，消毒，以后操作全部在无菌操作下完成。将用蒸馏水洗涤后的组织小块放入氯仿/乙醇（2:1）溶液对其进行脱脂，脱脂4h，双蒸水洗涤3次。用含4.5mol/lnacl的0.05mol/ltris-hcl缓冲液（ph7.5）充分洗涤24h，以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4℃）；缓冲液制备方法：将6.06gtris溶解在40ml的ddh2o中，用4mol/lhcl调节ph至7.5，再加ddh2o的总量至50ml（即再加入10mlddh2o），4℃保存。
2、抽提：将沉淀加入1l含胃蛋白酶500mg的0.5mol/l冰醋酸，搅拌并维持在4℃，提取72h，每10000g离心10min，去除沉淀；
3、沉淀：在上清液中加入0.5mol/l冰醋酸，使溶液ph为2.5～3.0，通常每升提取液中加入30ml的冰醋酸，用磁力搅拌器充分搅拌，离心后弃沉淀；
4、盐析：在上清液中加入nacl至4.4mol/l，搅拌过夜，低温离心，将沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐级用2.4mol/l，1.7mol/l及1.0mol/l的nacl反复盐析、酸溶。最后得到的上清液即为胶原粗提液；
5、将胶原粗提液冷冻干燥得到胶原粗提物冻干品，于低温下保存；
6、高效液相色谱纯化：将胶原冻干品用超纯水溶解，经0.45um滤膜过滤，取滤液上样进行色谱分离；色谱条件：zorbax300sb-c18半制备色谱柱（9.4mm×25cm），流动相：a为水（85%），b为甲醇（15%）；采用线形梯度洗脱；流速：1ml.min-1；进样量：500ul；检测波长：220nm；柱温：室温，收集主峰，用于理化性质鉴定。
本发明还提供了一种牛跟腱胶原蛋白海绵，其制备方法包括如下步骤：
（1）将步骤f中高效液相色谱纯化后的胶原戴白搅拌均匀，离心除去气泡，用0.05mol/naoh溶液调节ph值至6，用超纯水稀释，以1g耗牛跟腱制成60ml的胶原蛋白胀液为准；
（2）将胶原蛋白胀液倒入模具中，-50℃下预冻24h，经-40℃冷冻干燥24h得胶原蛋白海绵；
（3）将胶原蛋白海绵60co辐射消毒，封装，-4℃保存备用。
该胶原蛋白海绵是一种可吸收的外科止血、堵漏的辅料，使用安全方便可靠。
以上所述的实施例仅是对本发明法的优选方式进行描述，并非对本发明法的范围进行限定，在不脱离本发明法设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明法的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。