一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法与流程

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种用于扩增人间充质干细胞的培养基，本发明还涉及利用该培养基扩增人间质干细胞的方法。

背景技术：

细胞治疗己成为生物治疗领域中最活跃的一个部分，规范化的细胞治疗研究已成为现代医学的重要组成。当前我国细胞治疗中常用的细胞类型是成体来源的细胞，如免疫细胞、骨髓干细胞、脐血和脐带来源的造血或间充质干细胞等。

间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)来源广泛，也较易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，无道德伦理问题的限制，所以在免疫治疗和基因治疗方面有着巨大的应用前景。如自体或异基因骨髓或脐血造血干细胞移植用于治疗血液病、恶性肿瘤等；或骨髓和脐带来源的间充质干细胞经移植后转化为肝样细胞、成骨细胞、心肌细胞、汗腺细胞等。

目前，用于间充质干细胞的培养和扩增的培养基主要是在基础培养基的基本上添加一定浓度的动物血清如胎牛血清（fbs），动物血清含有异种蛋白质，使用动物血清培养和扩增的自体间充质干细胞在用于临床治疗时，可致受者体内产生抗体，从而引起免疫反应。因此，不含血清的培养基成为人们研究的热点。如中国专利“一种间充质干细胞无血清培养基”（申请号为201110420539.9，公告号为cn102433302a）公开了一种主要由碱性成纤维细胞生长因子、人表皮细胞生长因子、重组人胰岛素、人血白蛋白、亚硒酸钠、左旋卡尼丁和白藜芦醇等组分组成的培养基，该培养基不含血清，含有多种生长因子，并且通过加入左旋卡尼丁和白藜芦醇可有效改善间充质干细胞生长状态。但是，该无血清培养基只能将脐带间充质干细胞数目扩增大约1000倍，其专利说明书中也只提及了使用该培养基用于脐带间充质干细胞最多经过10次传代培养时，能够保证脐带间充质干细胞的生物学特性不变。

与上例相同，目前可见的间充质干细胞无血清培养培养技术普遍存在着培养成本高、扩增数量有限[扩增数量一般可在(1-2)×10⁸]、扩增时间长、干细胞易分化等不足，直接影响临床应用的安全性。保持人间充质干细胞的干性（即原始未分化性），并大量扩增，从而应用于临床研究是细胞治疗研究的重要内容之一。但是为能够实现该方法的临床有效应用，对该人间充质干细胞的有效的规模化培养并保持其干性则成为了主要难题。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于扩增人间充质干细胞的无血清培养基，该无血清培养基能提高人间充质干细胞的纯化效率、扩增速度、减少扩增时间，并能始终保持干细胞的干性。

本发明所采用的技术方案如下：

一种用于扩增人间充质干细胞的培养基，所述扩增培养基是在培养干细胞培养基的基础上，加入以下组分：

亚油酸（la）；

人源ab型血清；

血小板衍生生长因子（pdgf）；

以及表皮细胞生长因子（egf）；

所述培养干细胞培养基组分包括基础培养基、mcdb、胰岛素铁硒传递蛋白（its）、人血清白蛋白（hsa）、青链霉素（pen/strep）、地塞米松（dex）；所述基础培养基为dmem培养基。

上述扩增培养基以1升计算，各组分的用量如下：

mcdb20~100ml、胰岛素铁硒传递蛋白50~400μl、人血清白蛋白50~100μl、青链霉素0.5~2ml、地塞米松5~20μl、亚油酸1~10ml、人源ab型血清1~10ml、血小板衍生生长因子10~100μl、表皮细胞生长因子50~100μl、余下为基础培养基。

上述扩增培养基以1升计算，各组分的用量进一步优选如下：

mcdb50ml、胰岛素铁硒传递蛋白200μl、人血清白蛋白60μl、青链霉素1ml、地塞米松10μl、亚油酸6ml、人源ab型血清5ml、血小板衍生生长因子50μl、表皮细胞生长因子60μl、余下为基础培养基。

本发明用于人间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：

1）人间充质干细胞原代分离培养

自人脐带分离出人间充质干细胞后，或自骨髓血或脐带血分离出单个核细胞后，于上述组分的培养干细胞培养基中进行分离纯化培养；

2）扩增多次传代培养

将步骤1）原代分离培养得到的间充质干细胞，于如下上述组分的扩增培养基进行扩增传代培养。

在上述技术方案的基础上，上述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自人脐带分离人间充质干细胞，釆用贴壁法，包括如下步骤：

1）将剪碎的间距在0.2~0.5cm的脐带小块均匀平铺在培养皿中；翻转培养瓶置37℃4~6h；

2）4~6h后正置培养瓶，培养12h过夜；

3)7~10天时观察细胞爬出情况，换液1~2次将组织块弃去，补足培养基继续培养至可传代。

上述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自人脐带分离人间充质干细胞，釆用酶消化法，包括如下步骤：

1）将剪碎的脐带装入血清瓶中，加ⅱ型胶原酶2ml、pbs2ml，混匀后封口，置37℃过夜，过夜期间每隔2~6混匀；

2）次日，取消化好的组织块，取上清移置于新管；

3）加1ml0.25%胰酶，置37℃消化5min；

4）加1ml培养干细胞培养基终止消化，补pbs至10ml；

5）3000~4000rpm离心10min；

6）弃去上清，加1ml培养干细胞培养基重悬沉淀，接种到培养皿/瓶，补足培养基培养；

7）每两天观察，每3天半量更换培养基，培养至可传代。

另外，上述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养也可为脐带华通氏胶来源的间充质干细胞的分离培养，可釆用上述的贴壁法或酶消化法。

上述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自骨髓血或脐带血分离单个核细胞，釆用梯度离心法，包括如下步骤：

1）采集人骨髓血或健康脐带血50ml，利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞；

2）置于培养干细胞培养基，调整细胞浓度为3×10⁶/ml，37℃、5％co2孵育24小时后收集贴壁细胞即得到分离纯化的间充质干细胞。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

本发明的无血清培养基将多种细胞因子合理联合使用，在培养干细胞的培养基中加入la、人源ab型血清、pdgf和egf，不仅提高了间充质干细胞的纯化效果，而且流式结果显示，即使传代30代，人间充质干细胞的形态仍均一，表明多种细胞因子能够协同保持间充质干细胞的原始性，避免了分化，从而保证了人间充质干细胞的安全性，提高了细胞的扩增速度，减少了扩增时间，降低了成本。

本发明的无血清培养基可用于自体骨髓血、脐带血或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞的分离纯化处理以及传代扩增，从而提高了该三种来源的人间充质干细胞对相关疾病的治疗作用。

附图说明

图1为分离第7天的原代脐带华通氏胶来源间充质干细胞的形态结构图；

图2为培养第7天的自体骨髓血来源的原代间充质干细胞的形态结构图；

图3为培养第7天的脐带血来源的原代间充质干细胞的形态结构图；

图4为培养第60代的人间充质干细胞的形态结构图；

图5为第2代的cd29、cd45的流式细胞鉴定图；

图6为第2代的的cd34、c44的流式细胞鉴定图；

图7为第30代的人间充质干细胞cd29、cd45的流式细胞鉴定图；

图8为第30代的的cd34、c44的流式细胞鉴定图。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练入员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。除非另外说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。

本文中所用的术语“人间充质干细胞”是不同来源的人间充质干细胞，包括：人自体骨髓血来源，人脐带血来源，人脐带华通氏胶来源的细胞，在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到体内导致的免疫反应等方面均非常相似。

实施例1

人骨髓源间充质干细胞的分离、纯化培养

1、材料与试剂

淋巴细胞分离液(ficoll)(天津灏洋生物科技有限公司)；培养基dmem(hyclone公司)、人ab血清(中心血站)；细胞计数试剂盒(cck-8)(日本dojindo公司)；凋亡试剂盒(日本dojindo公司)；表皮生长因子（egf）、血小板衍生生长因子（pdgf）、地塞米松（dex）、青链霉素（pen/strep）、胰岛素铁硒传递蛋白（its）、人血清白蛋白（hsa）均为peprotech公司产品；荧光标志的鼠抗人pe-cd29、fitc-cd34、pe-cd44、fitc-cd45抗体(美国ebioscience公司)；fc500流式细胞仪和相应软件(美国beckmancoulter公司)。

2、培养基组分

1）培养干细胞培养基

以1升计算，各组分的用量如下：

mcdb50ml、胰岛素铁硒传递蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青链霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl，加dmem培养基至1升。

2）扩增培养基

以1升计算，各组分的用量如下：

mcdb50ml、胰岛素铁硒传递蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青链霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl、亚油酸（la）6ml、人源ab型血清5ml、血小板衍生生长因子（pdgf）50μl、表皮细胞生长因子（egf）60μl，加dmem培养基至1升。

3、培养方法

包括如下步骤：

1）采集人骨髓血50ml，利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞；置于培养干细胞培养基，调整细胞浓度为3×10⁶/ml，37℃、5％co2孵育24小时后收集贴壁细胞即得到分离纯化的间充质干细胞；

2）将经上述步骤1）所得的培养细胞，换用扩增培养基，培养箱中继续扩增培养传代。

实施例2

人脐带人间充质干细胞的分离培养

1、材料与试剂

同于实施例1

2、培养基组分

1）培养干细胞培养基

以1升计算，各组分的用量如下：

mcdb50ml、胰岛素铁硒传递蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青链霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl，加dmem培养基至1升。

2）扩增培养基

以1升计算，各组分的用量如下：

mcdb50ml、胰岛素铁硒传递蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青链霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl、亚油酸（la）6ml、人源ab型血清5ml、血小板衍生生长因子（pdgf）50μl、表皮细胞生长因子（egf）60μl，加dmem培养基至1升。

3、培养方法（贴壁法）

包括如下步骤：

1）将剪碎的脐带均匀平铺（小块间距在0.2-0.5cm）在培养皿中，加培养干细胞培养基，翻转培养瓶置37℃4-6h；

4-6h后正置培养瓶，动作轻柔，培养12h过夜；

7-10天时观察细胞爬出较多时，换液时将组织块弃去，可通过1-2次换液逐步弃去；

2）将经上述步骤1）原代分离培养得到的间充质干细胞，于扩增培养基进行扩增传代培养。

在本实施例的培养过程中，于不同时间点，利用倒置相差显微镜观察人间充质干细胞的生长形态、通过免疫荧光及流式细胞仪检测人间充质干细胞标记基因的表达情况。各种检测结果如下：

人间充质干细胞分离培养的形态结构如图1所示，由图1可以看出，培养贴壁后的人间充质干细胞发生明显形变，呈克隆样生长，初步呈现样人间充质干细胞形态；逐渐的，人间充质干细胞形态较为均一，呈现典型样人间充质干细胞形态。

换用扩增培养基扩增至第2代的流式结果如图5、6所示，再大量扩增至第30代，人间充质干细胞形态仍均一，流式结果如图7、8所示，由此表明，本分离、纯化和扩增技术可以大量扩增人间充质干细胞并能保持人间充质干细胞的未分化性。

实施例3

人脐带人间充质干细胞的分离培养

1、材料与试剂

同于实施例1

2、培养基组分

1）培养干细胞培养基

以1升计算，各组分的用量如下：

mcdb50ml、胰岛素铁硒传递蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青链霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl，加dmem培养基至1升。

2）扩增培养基

以1升计算，各组分的用量如下：

mcdb50ml、胰岛素铁硒传递蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青链霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl、亚油酸（la）6ml、人源ab型血清5ml、血小板衍生生长因子（pdgf）50μl、表皮细胞生长因子（egf）60μl，加dmem培养基至1升。

3、培养方法（酶消化法）

包括如下步骤：

1）将剪碎的脐带装入血清瓶中，加ⅱ型胶原酶2ml，加pbs2ml，混匀后封口，置37℃过夜，期间每隔一段时间混匀；

次日，取消化好的组织块，取上清移置新管（15ml离心管）；

加1ml（0.25%胰酶，置37℃消化5min；

加1ml培养基终止消化，补pbs至10ml；

3000~4000rpm离心10min；

弃去上清，加1ml培养干细胞培养基重悬沉淀，接种到培养皿，补足培养干细胞培养基培养；

每两天观察，每3天半量更换扩增培养基；

2）将经上述步骤1）原代分离培养得到的间充质干细胞，于扩增培养基进行扩增传代培养。

尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。