一种人皮肤多能干细胞（SKPs）培养的改良方法与流程

本发明属于细胞培养领域，具体是一种人皮肤多能干细胞(skps)培养的改良方法。

背景技术：

皮肤多能干细胞(skin-derivedprecursors，skps)，它有类似胚胎神经干细胞特性，能够分化成各种神经和中胚层细胞表现型，包括周围神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞、骨、软骨和脂细胞等。

skps经过连续长期传代细胞培养仍具有高度增殖活性和多向分化潜能，提示其性能稳定，可望成为细胞替代治疗较为理想的种子细胞。另皮肤是人体最大的器官，而且也是机体内自我更新和再生修复速度最快的组织之一，取材简单方便，来源充足，对供者无明显不利影响，便于自体移植治疗且无伦理问题的限制。因此，这种skps越来越受到的科学家的关注，被认为有望在脊髓及神经系统疾病治疗发面发挥重要作用。

但是采用现有目前的方法分离培养皮肤多能干细胞，由于其数量少，培养周期长，费用高，研究及应用受限，需要进行改进。如，jeffreyabiernaskie1等，isolationofskin-derivedprecursors(skps)anddifferentiationandenrichmentoftheirschwanncellprogeny，natureprotocolsvol.1，no.6，2006，2803公开了一种皮肤多能干细胞的培养方法，采用该文献公开的方法培养，需要2-4周时间才能培养得到皮肤多能干细胞，且获得细胞数量较少。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的、培养周期短的skps培养方法。

本发明皮肤多能干细胞的培养方法，步骤如下：

(1)取皮肤的真皮层组织，剪碎，胶原酶消化，解离，离心去上清，得细胞；

(2)取步骤(1)得到的细胞，采用贴壁培养基进行贴壁培养细胞，获得成纤维细胞；

(3)取步骤(2)得到的成纤维细胞，悬浮培养基重悬，接种至poly-hema包被的培养瓶中培养，即可。

步骤(1)中，所述取皮肤真皮层组织的方法是：取皮肤，消毒，冲洗，剔除皮下脂肪层，保留真皮及表皮层；剪成小块，用0.25％胰酶在4℃冰箱中过夜；用等体积含10％胎牛血清的dmem高糖培养基终止消化，冲洗，表皮在冲洗的过程中被脱离、洗去，未分离的表皮使用镊子分离去除，得真皮组织。

步骤(1)中，剪碎是剪为2-3mm²/片；

步骤(1)中，所述胶原酶消化采用的是浓度1mg/ml的胶原酶溶液，消化的条件是37℃孵箱中2-3h；所述胶原酶为i型胶原酶。

步骤(2)中，所述获得成纤维细胞的方式是：

培养至细胞融合至80-90％时，胰酶消化，离心去上清，收集细胞，即为成纤维细胞；

或者是，培养至细胞融合至80-90％时，胰酶消化，离心去上清，收集细胞，传代培养，传代次数为2-10次，得细胞悬液，离心去上清，收集细胞，即可。

步骤(2)中，所述获得成纤维细胞的方式是：取前述方法获得的成纤维细胞，冻存，解冻，培养，即可；

所述冻存保存液是含有10％dmso和20％fbs的dmem溶液；

所述解冻是放入37℃水槽，使其在1分钟内全部融化；

所述培养的方式是：取出解冻之细胞悬浮液，加入9倍量的贴壁培养基进行贴壁培养，直至细胞融合至80-90％，胰酶消化。

所述贴壁培养基是添加有1％的青/链霉素双抗和10％胎牛血清的dmem高糖培养基；培养的方法是：置于7℃，5％co2，95％o2条件下培养，每3天换液一次。

胰酶消化是加入0.1％胰酶消化2min，消化的温度37℃；采用10％fbs的dmem培养基终止消化。

步骤(3)中，所述悬浮培养基是dmem高糖培养基+f12营养添加物(3:1)+40ng/mlfgf2+20ng/mlegf+2％b27+1％双抗；

步骤(3)中，每3-4天加一次液，每次加1-2mldmem/f12培养基及所有生长因子添加物，保持培养基中含有40ng/mlbfgf、20ng/mlegf及2％b27。

本发明还提供了前述方法制备得到的皮肤多能干细胞。

本发明还提供了前述皮肤多能干细胞在制备预防光老化的药物、化妆品或者日化用品中的用途。

本方法先扩增真皮中成纤维细胞(fibroblasts，fbs)的数量，再转化培养skps，获得的细胞与传统方法培养的skps有相同形态，表达相同的蛋白标记，且具有多向分化能力，提高了细胞的获得量，缩短了培养周期，降低了费用，有利于skps研究的进一步展开，应用前景广阔。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本方法培养的fbs细胞

图2本方法培养的skps细胞

图3现有方法培养的skps细胞

图4本方法培养的skps表达传统方法培养的skps相关标记物

图5skps成骨诱导分化

图6skps成脂诱导分化

图7传统方法培养的skps相关标记物

图8本发明方法与传统方法不同时间培养的skps的比较

图9本方法skps长期保存

图10不同组别裸鼠皮肤外观及、vc98局部成像、he及masson染色

具体实施方式

主要仪器及试剂：

实施例1本发明皮肤多能干细胞的培养方法

1皮肤真皮贴壁细胞培养及扩增，即fbs的培养和扩增

1.1取新鲜人包皮标本，75％酒精消毒，用pbs冲洗3次后剔除皮下脂肪层，保留真皮及表皮层。

1.2将皮肤剪成5×5mm²/片，用0.25％胰酶在4℃冰箱中过夜。

1.3用等体积含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基终止消化，用pbs冲洗两遍。表皮在冲洗的过程中被脱离、洗去，未分离的表皮使用镊子手工分离去除。

1.4将真皮组织剪为2-3mm²/片，加入1mg/ml的i型胶原酶，置于37℃孵箱中2-3h，致组织几乎完全消化，加入5倍体积的dmem高糖培养基终止消化。

1.5用1000μl枪头反复吹打，机械解离细胞。收集上清液，用40μm的滤网滤过。滤过液以2000rpm的速度离心8分钟。

1.6弃上清，用贴壁培养基(dmem高糖培养基+10％胎牛血清+1％双抗)重悬细胞，按50000个/ml的密度接种细胞于培养板上，置于孵育箱中(37℃，5％co2，95％o2)。

1.724-48小时观察细胞是否贴壁，每3天换液，培养1周左右至细胞融合至80-90％。

1.8弃培养基，用pbs清洗两遍，加入0.1％胰酶消化2min(37℃)，后用等体积含10％fbs的dmem培养基终止消化，收集细胞悬液，以2000rpm的速度离心8分钟，收集沉淀(此处得到的细胞为成纤维细胞[fbs细胞]，其形态如图1所示)；可传代培养，按50000个/ml的密度接种传代，约2-3天细胞融合再传代，可至少传致第10代，传代后得到的细胞悬液，以2000rpm的速度离心8分钟，收集沉淀(得到的细胞为成纤维细胞)。

2贴壁细胞转为悬浮生长细胞，即fbs转化为skps

将步骤1得到的成纤维细胞的细胞沉淀以悬浮培养基(dmem高糖培养基+f12营养添加物(3:1)+40ng/mlfgf2+20ng/mlegf+2％b27+1％p/s)重悬，按20000-40000个/ml的密度接种细胞于poly-hema包被的培养瓶中，每3-4天加一次液，每次加1-2mldmem/f12培养基及所有生长因子添加物，保持培养基中含有40ng/mlbfgf、20ng/mlegf及2％b27。

连续培养1-2周。收集得到皮肤多能干细胞(skps细胞)，其镜下形态如图2所示。

实施例2本发明长期保存

本发明实施例1步骤1中得到的成纤维细胞fbs可以冻存起来，在实际需要的时候解冻，再转化为皮肤多能干细胞(skps细胞)，冻存以及解冻的方法如下：

1将扩增的皮肤贴壁细胞离心后，收集细胞沉淀，加入冻存保存液(10％dmso+20％fbs+70％dmem)中，混合均匀，然后进行冻存。

2取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70％酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

3取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有贴壁培养基之培养皿内(稀释比例为1：9)，混合均匀，放入co2培养箱培养，每3天换液，直至细胞融合至80-90％。后用pbs清洗两遍，加入0.1％胰酶消化2min(37℃)，后用等体积含10％fbs的dmem培养基终止消化，收集细胞悬液，以2000rpm的速度离心8分钟，收集继一代细胞沉淀(得到的细胞为成纤维细胞)。

4将继一代的细胞沉淀以悬浮培养基(dmem/f12培养基(3:1)，含40ng/mlbfgf、20ng/mlegf及2％b27。)重悬，按20000-40000/ml的密度接种细胞于poly-hema包被的培养瓶中，每3-4天加一次液，每次加1-2mldmem/f12培养基及所有生长因子添加物，保持培养基中含有40ng/mlbfgf、20ng/mlegf及2％b27。

5连续培养1周，收集skps细胞。

以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：

实验例1本发明方法与现有方法的比较

1、实验方法

(1)本发明方法：按照本发明实施例1的方法得到的培养多能干细胞，培养时间为1周。

(2)现有方法：按照jeffreyabiernaskie1等，isolationofskin-derivedprecursors(skps)anddifferentiationandenrichmentoftheirschwanncellprogeny，natureprotocolsvol.1，no.6，2006，2803公开的方法培养多能干细胞(将从真皮中分离的原代细胞直接于悬浮培养基中培养)，培养时间2-4周。

2、检测方法

取两种方法培养得到的细胞分别细胞观察，并进行成脂成骨结果检测。

取本发明方法培养的皮肤多能干细胞，与现有方法培养的细胞进行比较检测，包括使用coultercounter粒子计数器计数获得的细胞数、倒置显微镜下观察细胞的形态。

3、检测结果

结果如图2～图8所示：

首先，本发明方法培养得到的多能干细胞skps的形状图如图2所示，现有方法得到的多能干细胞skps的形状图如图3所示，比较可以看出，二者无差异。

第二，本发明培养的skps也可以分化成脂成骨(图4、5)，本发明配方的skps也具有各种干细胞特异性标志物(图6)，与现有方法培养的skps基本一致(图7)。

第三，如图8所示，现有方法培养方法1周无法得到成熟的skps，本发明方法培养1周与现有方法培养2周的效果相同。现有方法培养4周skps出现贴壁等分化现象，而本发明方法培养未出现贴壁现象。

实验结果说明，本发明方法可以培养得到性质优良的多能干细胞skps，而且培养时间短。

实验例2本发明冻存的效果

1、实验方法

取本发明实施例1方法种培养的第一代fbs(p1)及其转化成的skps，以及本发明实施例2方法培养的第八代冻存后解冻的fbs(p8)及其转化成的skps。检测生存状态，包括使用coultercounter粒子计数器计数获得的细胞数、倒置显微镜下观察细胞的形态。

2、实验结果

如图9所示。现有方法培养的第一代fbs(p1)及其转化成的skps(图9上排)，现有方法培养的第八代冻存后解冻的fbs(p8)及其转化成的skps，生存状态基本一致。

实验例3本发明皮肤多能干细胞对光老化的预防作用

1、实验方法

(1)本发明方法：本发明方法培养的skps对光老化有预防作用。

1小鼠分组：将18只balb/c裸鼠随机分为3组，即空白对照组、照射组、10skps组。1组不做任何处理，2组仅照射紫外光，3组于照射前及之后每隔两周臀部分别注射skps。

2uvb照射：用紫外线光疗仪先后对裸鼠背部皮肤进行照射，光源距离背部皮肤垂直距离30cm，每周照射5次，共8周，10j/cm2/1h。

3skps注射：将实施例2所培养的皮肤多能干细胞悬液于3组裸鼠臀部皮肤注射，注射细胞数为1*106/ml，细胞悬液体积为200ul。同时，空白对照组和照射组未进行细胞注射处理。

4活性皮肤表面分析系统评价:在实验终点时，采集小鼠皮肤背侧影像行活性皮肤表面分析系统评价sels皱纹参数中的平滑度参数sesm，ser，sew，sesc。

5组织病理切片：在实验终点时，颈椎脱臼法处死动物，将取下的皮肤组织切成小块，标本大小约为4mm×4mm×2mm，立即投入4％多聚甲醛中固定24小时以上，做成石蜡切片，同时行he染色、masson染色。

2、检测

在实验终点时行，对小鼠背部皮肤行活性皮肤表面分析系统评价；取小鼠背部皮肤做成石蜡切片，同时行he染色测量表皮厚度、masson染色测真皮厚度和胶原含量百分比。

如图10所示，不同组别裸鼠皮肤外观及、vc98局部成像、he及masson染色(a.uv-，b.uv+，c.hanks+uv，d.10⁴skps+uv，e.10⁵skps+uv)，成功构建光老化小鼠模型，将不同浓度skps注入光老化小鼠背部皮肤，以未注射小鼠及hanks液作为阴性对照，临床可见紫外线辐射后，注射高浓度skps的皮肤明显更光滑(图10第1、2、3排)，he染色可见真皮层明显增厚，masson染色可见胶原纤维增多(图10第4、5、6排)。

综上，采用本发明方法可以有效培养得到皮肤多能干细胞，细胞培养周期短，而且细胞取材方便，可长期保存，成本低廉。此外，本发明培养的皮肤多能干细胞对光老化有预防作用，前景良好。