一种基于CD30的嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于cd30的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点cd30为基础的嵌合抗原受体t(car-t)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体car由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，car包含抗体的单链片段可变(singlechainfragmentvariable，scfv)区或对肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen,taa)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与t细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与t细胞效应物功能触发(例如cd3ζ)部分串联的t细胞共刺激结构域。car介导的过继性免疫疗法允许car-移植的t细胞以非hla限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的taa。

大多数患有淋巴细胞恶性肿瘤，包括霍奇森氏淋巴瘤(hodgkin’slymphoma)，b细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞性白血病(bcelllymphomaandbcellacutelymphocyticleukemia,leukemia,b-all)和慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia,cll))的患者将由于其疾病而死亡。治疗这些患者的一种方法是通过car的表达，对t细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。car是经设计以人白细胞抗原(humanleukocyteantigen,hla)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达car的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。

cd19分子是治疗b淋巴细胞系肿瘤潜在的靶点，也是car研究中的热点，cd19的表达局限于正常和恶性b细胞，是广泛接受的用来安全测试的car靶标。靶向cd19分子的嵌合抗原受体基因修饰的t细胞(cd19car-t)在治疗多发性、难治性的急性b淋巴细胞白血病上取得巨大成功，而在难治性、复发性慢性b淋巴细胞白血病和b淋巴细胞系淋巴瘤的治疗中疗效明显较差。

cn104788573a公开了了一种嵌合抗原受体hcd19scfv-cd8α-cd28-cd3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人cd19单克隆抗体hi19a轻链和重链可变区(hcd19scfv)、人cd8α铰链区、人cd28跨膜区和胞内区、以及人cd3ζ胞内区结构串联构成，该专利中的cd19在进行一次car-t细胞回输后，cd19的表达量会降低，容易逃过免疫机制。

因此，制备一种嵌合抗原受体能够解决cd19存在的易突变和表达量降低的问题显得尤为重要。

技术实现要素：

针对目前car-t技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响car-t技术治疗效果的情况，本发明提供一种基于cd30的嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体通过将cd30靶点进行基因改造，从而提高了靶点的免疫效果，增强了car-t细胞的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种基于cd30的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、cd3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成；

其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为cd30。

本发明中，通过将抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原cd30，再通过对抗原结合结构域即针对肿瘤表面抗原cd30的单链抗体进行特定的人源基因码优化改造，从而使得肿瘤表面抗原cd30能够特异的结合在本申请的嵌合抗原受体上，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得car-t细胞的免疫效果增强。

根据本发明，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原cd30的单链抗体(scfv)，所述针对肿瘤表面抗原cd30的单链抗体的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述针对肿瘤表面抗原cd30的单链抗体氨基酸序列(seqidno.1)如下：

qiqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyyitwvrqapgqglewmgwiypgsgntkynekfkgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycanygnywfaywgqgtlvtvssgstsgsgkpgssegstkgdivmtqspdslavslgeratinckasqsvdfdgdsymnwyqqkpgqppklliyaasnlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqsnedpwtfgqgtkveik.

本发明中，所述针对肿瘤表面抗原cd30的单链抗体进行了特异性改造，使得改造后的序列表达出来的抗体的抗原-抗体结合力更强。

根据本发明，所述抗原结合结构域还包括针对肿瘤表面抗原cd30的突变体的单链抗体，所述针对肿瘤表面抗原cd30的突变体的单链抗体的氨基酸序列与seqidno.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。

根据本发明，所述跨膜结构域为cd28跨膜结构域和/或cd8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。

根据本发明，所述共刺激信号传导区为cd28信号传导结构域、cd27信号传导结构域和cd137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，优选为cd28信号传导结构域、cd137信号传导结构域和cd27信号传导结构域的组合，所述cd28信号传导结构域、cd137信号传导结构域和cd27信号传导结构域的排列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，cd28信号传导结构域、cd27信号传导结构域和cd137信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本申请优选采用cd28-cd27-cd137的顺序组合。

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列(seqidno.4)如下：

gsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas.

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2a序列与cd3ζ信号传导结构域相串联，所述2a序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过注入激活剂，从而使得可诱导自杀融合结构域激活，从而导致嵌合抗原受体失去作用。

根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽可以为任何一个分泌蛋白基因的信号肽，本发明所述信号肽为secretory信号肽，所述secretory信号肽的氨基酸序列如seqidno.5-6所示。

优选地，所述secretory信号肽为cd8a基因的信号肽，所述secretory信号肽的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述seqidno.5所述的氨基酸序列如下：malpvtalllplalllhaarp。

优选地，所述secretory信号肽为gmcsfr基因的信号肽，所述secretory信号肽的氨基酸序列如seqidno.6所示，所述seqidno.6所述的氨基酸序列如下：mlllvtslllcelphpafllip

本发明的嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、cd3ζ信号传导结构域、2a序列和可诱导自杀融合结构域串联而成。

作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为secretory信号肽、cd30抗原结合结构域，cd8α和/或cd28跨膜结构域，cd28信号传导结构域、cd27信号传导结构域和cd137信号传导结构域，cd3ζ信号传导结构域、2a序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：

secretory-cd30-cd28-cd27-cd137-cd3ζ-2a-fbkp.casp9。

根据本发明，所述嵌合抗原受体secretory-cd30-cd28-cd27-cd137-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列(seqidno.2)如下：

mlllvtslllcelphpafllipqiqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyyitwvrqapgqglewmgwiypgsgntkynekfkgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycanygnywfaywgqgtlvtvssgstsgsgkpgssegstkgdivmtqspdslavslgeratinckasqsvdfdgdsymnwyqqkpgqppklliyaasnlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqsnedpwtfgqgtkveikaaaievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsasggggsggggsqrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacspggggsggggstsggggsggggsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelggggsggggsggggsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprtsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas.

根据本发明，所述嵌合抗原受体secretory-cd30-cd28-cd27-cd137-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列(seqidno.3)如下：

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgccttcctgctgatcccccagatccagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacaccttcaccgactactacatcacctgggtgagacaggcccccggccagggcctggagtggatgggctggatctaccccggcagcggcaacaccaagtacaacgagaagttcaagggcagagtgaccatgaccagagacaccagcatcagcaccgcctacatggagctgagcagactgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcgccaactacggcaactactggttcgcctactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgacatcgtgatgacccagagccccgacagcctggccgtgagcctgggcgagagagccaccatcaactgcaaggccagccagagcgtggacttcgacggcgacagctacatgaactggtaccagcagaagcccggccagccccccaagctgctgatctacgccgccagcaacctggagagcggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcaggccgaggacgtggccgtgtactactgccagcagagcaacgaggacccctggaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaaggccgccgccatcgaggtgatgtacccccccccctacctggacaacgagaagagcaacggcaccatcatccacgtgaagggcaagcacctgtgccccagccccctgttccccggccccagcaagcccttctgggtgctggtggtggtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggccttcatcatcttctgggtgagaagcaagagaagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgacccccagaagacccggccccaccagaaagcactaccagccctacgccccccccagagacttcgccgcctacagaagcgccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccagagaagaaagtacagaagcaacaagggcgagagccccgtggagcccgccgagccctgccactacagctgccccagagaggaggagggcagcaccatccccatccaggaggactacagaaagcccgagcccgcctgcagccccggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgtggtgaagagaggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgcagctgcagattccccgaggaggaggagggcggctgcgagctgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgacgtgctggacaagagaagaggcagagaccccgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagagaagaagaggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagaaccagcggcagcggcgccaccaacttcagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggccccatgggcgtgcaggtggagaccatcagccccggcgacggcagaaccttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactacaccggcatgctggaggacggcaagaaggtggacagcagcagagacagaaacaagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagccccgactacgcctacggcgccaccggccaccccggcatcatccccccccacgccaccctggtgttcgacgtggagctgctgaagctggagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcgccatggtgggcgccctggagagcctgagaggcaacgccgacctggcctacatcctgagcatggagccctgcggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgcagagagagcggcctgagaaccagaaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgagaagaagattcagcagcctgcacttcatggtggaggtgaagggcgacctgaccgccaagaagatggtgctggccctgctggagctggccagacaggaccacggcgccctggactgctgcgtggtggtgatcctgagccacggctgccaggccagccacctgcagttccccggcgccgtgtacggcaccgacggctgccccgtgagcgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcaccagctgccccagcctgggcggcaagcccaagctgttcttcatccaggcctgcggcggcgagcagaaggaccacggcttcgaggtggccagcaccagccccgaggacgagagccccggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggagggcctgagaaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatcttcgtgagctacagcaccttccccggcttcgtgagctggagagaccccaagagcggcagctggtacgtggagaccctggacgacatcttcgagcagtgggcccacagcgaggacctgcagagcctgctgctgagagtggccaacgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgcccggctgcttcaacttcctgagaaagaagctgttcttcaagaccagcgccagctga.

本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为ef1a、cmv-tar或cmv中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到t细胞中表达。

根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mrna序列中的任意一种或至少两种的组合转染到t细胞，优选为通过病毒载体转染到t细胞。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pnhp和phef-vsvg共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞，293t细胞或te671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体t细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病和/或实体瘤，所述肿瘤疾病选自但不限于白血病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的嵌合抗原受体通过对cd30肿瘤表面抗原进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原-抗体结合力更强；

(2)本发明的嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原cd30，cd30在白血病及淋巴瘤中表达量高，且嵌合抗原受体上的针对肿瘤表面抗原cd30的单链抗体不容易发生突变，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得car-t细胞的免疫效果增强，增强了car-t细胞的治疗效果；

(3)本发明的嵌合抗原受体在进行car-t细胞回输后，肿瘤表面cd30的表达量不会降低，不容易逃过免疫机制，能够更好的进行治疗。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体的合成基因序列图谱；

图2为原发性淋巴瘤细胞中cd30抗体流式细胞分析结果图，其中，灰色区域为同型阴性对照；

图3(a)为免疫组化阴性对照的流式细胞分析结果图；图3(b)为原发性淋巴瘤细胞的cd30抗体染色流式细胞分析结果图；

图4(a)为alcl肿瘤(间变性大细胞淋巴瘤)靶细胞的流式细胞分析结果图，图4(b)为alcl肿瘤靶细胞的细胞凋亡结果图；

图5(a)为一般t细胞与alcl肿瘤靶细胞共培养的流式细胞分析结果图，图5(b)为一般t细胞与alcl肿瘤靶细胞共培养的细胞凋亡结果图；

图6(a)为gd2car-t细胞与alcl肿瘤靶细胞共培养的流式细胞分析结果图，图6(b)为gd2car-t细胞与alcl肿瘤靶细胞共培养的细胞凋亡结果图；

图7(a)为cd30嵌合抗原受体与alcl肿瘤靶细胞共培养的流式细胞分析结果图，图7(b)为cd30嵌合抗原受体t细胞与alcl肿瘤靶细胞共培养的细胞凋亡结果图；

图8为共培养12天后的gfp染色结果图，其中，每个结果图中右侧图的绿色荧光表示原发性淋巴瘤细胞的存活细胞，第一列为原发性淋巴瘤细胞的gfp染色图和gd2car-t细胞毒杀后的原发性淋巴瘤细胞的gfp染色图，第二列为经一般t细胞毒杀后的原发性淋巴瘤细胞的gfp染色图和制备的cd30cart毒杀后的原发性淋巴瘤细胞的gfp染色图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：嵌合抗原受体的构建

(1)通过全基因合成secretory信号肽、cd30抗原结合结构域，cd8α和/或cd28跨膜结构域，cd28信号传导结构域、cd27信号传导结构域和cd137信号传导结构域，cd3ζ信号传导结构域、2a序列和胱天蛋白酶9结构域，如图1所示，即secretory-cd30-cd28-cd27-cd137-cd3ζ-2a-fbkp.casp9；

所述嵌合抗原受体的核苷酸序列seqidno.3如下：

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgccttcctgctgatcccccagatccagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacaccttcaccgactactacatcacctgggtgagacaggcccccggccagggcctggagtggatgggctggatctaccccggcagcggcaacaccaagtacaacgagaagttcaagggcagagtgaccatgaccagagacaccagcatcagcaccgcctacatggagctgagcagactgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcgccaactacggcaactactggttcgcctactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgacatcgtgatgacccagagccccgacagcctggccgtgagcctgggcgagagagccaccatcaactgcaaggccagccagagcgtggacttcgacggcgacagctacatgaactggtaccagcagaagcccggccagccccccaagctgctgatctacgccgccagcaacctggagagcggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcaggccgaggacgtggccgtgtactactgccagcagagcaacgaggacccctggaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaaggccgccgccatcgaggtgatgtacccccccccctacctggacaacgagaagagcaacggcaccatcatccacgtgaagggcaagcacctgtgccccagccccctgttccccggccccagcaagcccttctgggtgctggtggtggtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggccttcatcatcttctgggtgagaagcaagagaagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgacccccagaagacccggccccaccagaaagcactaccagccctacgccccccccagagacttcgccgcctacagaagcgccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccagagaagaaagtacagaagcaacaagggcgagagccccgtggagcccgccgagccctgccactacagctgccccagagaggaggagggcagcaccatccccatccaggaggactacagaaagcccgagcccgcctgcagccccggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgtggtgaagagaggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgcagctgcagattccccgaggaggaggagggcggctgcgagctgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgacgtgctggacaagagaagaggcagagaccccgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagagaagaagaggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagaaccagcggcagcggcgccaccaacttcagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggccccatgggcgtgcaggtggagaccatcagccccggcgacggcagaaccttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactacaccggcatgctggaggacggcaagaaggtggacagcagcagagacagaaacaagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagccccgactacgcctacggcgccaccggccaccccggcatcatccccccccacgccaccctggtgttcgacgtggagctgctgaagctggagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcgccatggtgggcgccctggagagcctgagaggcaacgccgacctggcctacatcctgagcatggagccctgcggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgcagagagagcggcctgagaaccagaaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgagaagaagattcagcagcctgcacttcatggtggaggtgaagggcgacctgaccgccaagaagatggtgctggccctgctggagctggccagacaggaccacggcgccctggactgctgcgtggtggtgatcctgagccacggctgccaggccagccacctgcagttccccggcgccgtgtacggcaccgacggctgccccgtgagcgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcaccagctgccccagcctgggcggcaagcccaagctgttcttcatccaggcctgcggcggcgagcagaaggaccacggcttcgaggtggccagcaccagccccgaggacgagagccccggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggagggcctgagaaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatcttcgtgagctacagcaccttccccggcttcgtgagctggagagaccccaagagcggcagctggtacgtggagaccctggacgacatcttcgagcagtgggcccacagcgaggacctgcagagcctgctgctgagagtggccaacgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgcccggctgcttcaacttcctgagaaagaagctgttcttcaagaccagcgccagctga.

实施例2：慢病毒包装

(1)用六孔板分别培养293t细胞，1×10⁶个细胞/孔，培养17-18小时；

(2)加入600μl/孔的新鲜的dmem，内含10％的fbs；

(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取75μl的dmem的上清液，2.7μg的helperdnamix(1.8μgpnhp，0.5μgphef-vsv-g，0.2μgphef-gfp)以及0.8μg的ptyfdna载体，漩涡振荡；

(4)从每孔板中央吸取7μl的superfect加至离心管中吹打5次，室温静置7-10分钟；

(5)将离心管中的dna-superfect混合液逐滴加入至每个培养孔中，漩涡打匀；

(6)37℃3％co2培养箱里培养4-5小时；

(7)吸走培养基的培养液，用1.5mlaim-v冲洗培养基，并加入1.5ml的aim-v继续培养；

(8)将培养基放回3％co2培养箱中培养过夜，第二天早上用荧光显微镜观察转染效率。

实施例3：慢病毒的纯化和浓缩

1)病毒纯化

通过离心(1000g，5分钟)除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个0.45微米的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；

通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生10⁶到10⁷转导单位滴定的慢病毒载体。

2)用centricon过滤器浓缩慢病毒载体

(1)在生物安全柜中，取centricon管，用70％酒精消毒1次，然后用无菌pbs清洗3次；

(2)每个centriconp-20过滤管中加入18ml的病毒上清液，然后在2500g下离心30分钟或者直到病毒体积减小到0.5ml；

(3)震荡过滤管，然后在400g下，离心2分钟，收集浓缩的病毒到收集杯中。最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中。

实施例4：car-t细胞的转染

将活化后的t细胞以5×10⁶接种到24孔板，加入50μl的浓缩目标基因的慢病毒，以100g离心力的速度，室温离心100分钟后，置于37℃培养24h，加入1ml的含有2％人血清与细胞培养因子的aim-v基，培养2-3天后，将细胞收获并计数，以1×10⁷接种到12孔板，培养2-3天，用慢病毒载体携带gfp感染靶细胞并用annexinv/pi染色法观察细胞毒杀效果，结果如图2-图3所示。

从图2、图3(a)-图3(b)可以看出，原发性淋巴瘤细胞表面cd30的表达量高，本发明选用的cd30嵌合抗原受体能够用于治疗原发性淋巴瘤。

实施例5car-t细胞的体外肿瘤杀伤

(1)将非专一性的4gs-mesocart细胞、gd2car-t细胞和本申请制备的专一性的4gs-cd30cart细胞与原发性淋巴瘤细胞共培养，置于37度5％co2培养箱共培养18h；

(2)体外评估car-t细胞对靶细胞的识别杀伤功能，靶细胞为钙黄绿素标记或感染lv-gfp；

结果如图4-图8所示所示，从图4(a)、图5(a)、图6(a)和图7(a)对比可以看出，荧光强度为10³以上的细胞为alcl肿瘤靶细胞，挑选图4(a)、图5(a)、图6(a)和图7(a)中荧光强度为10³以上的细胞做进一步分析，从图4(b)可以看出，8.1％的靶细胞濒临凋亡，3.3％的靶细胞凋亡，从图5(b)可以看出，15.4％的靶细胞濒临凋亡，8.1％的靶细胞凋亡，从图6(b)可以看出，15.8％的靶细胞濒临凋亡，10.0％的靶细胞凋亡，从图7(b)可以看出，44.5％的靶细胞濒临凋亡，29.1％的靶细胞凋亡；可见，cd30嵌合抗原受体t细胞的靶细胞濒临凋亡以及靶细胞凋亡数明显高于其他对照组，因此cd30嵌合抗原受体对alcl肿瘤靶细胞有较好的毒杀作用。

通过图8可以看出，原发性淋巴瘤细胞单独培养、原发性淋巴瘤细胞与一般t细胞培养和原发性淋巴瘤细胞与gd2-cart细胞培养12天后的结果，荧光强度变化不明显，原发性淋巴瘤细胞与本申请cd30cart细胞培养12天后，绿色荧光基本消失，即无存活的原发性淋巴瘤细胞，说明cd30嵌合抗原受体对原发性淋巴瘤细胞的毒杀作用有非常好的效果。

综上所述，本发明的嵌合抗原受体的针对cd30肿瘤表面抗原的单链抗体不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得car-t细胞的免疫效果增强，增强了car-t细胞的治疗效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>深圳市免疫基因治疗研究院

<120>一种基于cd30的嵌合抗原受体及其应用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>246

<212>prt

<213>人工合成序列

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151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

tyrilethrtrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

354045

glytrpiletyrproglyserglyasnthrlystyrasnglulysphe

505560

lysglyargvalthrmetthrargaspthrserileserthralatyr

65707580

metgluleuserargleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaasntyrglyasntyrtrpphealatyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserserglyserthrserglyserglylysproglyser

115120125

sergluglyserthrlysglyaspilevalmetthrglnserproasp

130135140

serleualavalserleuglygluargalathrileasncyslysala

145150155160

serglnservalasppheaspglyaspsertyrmetasntrptyrgln

165170175

glnlysproglyglnproprolysleuleuiletyralaalaserasn

180185190

leugluserglyvalproaspargpheserglyserglyserglythr

195200205

aspphethrleuthrileserserleuglnalagluaspvalalaval

210215220

tyrtyrcysglnglnserasngluaspprotrpthrpheglyglngly

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thrlysvalgluilelys

245

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<212>prt

<213>人工合成序列

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100105110

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130135140

serglylysproglysersergluglyserthrlysglyaspileval

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180185190

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iletyralaalaserasnleugluserglyvalproaspargpheser

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glyserglyserglythraspphethrleuthrileserserleugln

225230235240

alagluaspvalalavaltyrtyrcysglnglnserasngluasppro

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trpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysalaalaalaile

260265270

gluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglulysserasngly

275280285

thrileilehisvallysglylyshisleucysproserproleuphe

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proglyproserlysprophetrpvalleuvalvalvalglyglyval

305310315320

leualacystyrserleuleuvalthrvalalapheileilephetrp

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valargserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmet

340345350

thrproargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyrala

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proproargaspphealaalatyrargseralaserglyglyglygly

370375380

serglyglyglyglyserglnargarglystyrargserasnlysgly

385390395400

gluserprovalgluproalagluprocyshistyrsercysproarg

405410415

gluglugluglyserthrileproileglngluasptyrarglyspro

420425430

gluproalacysserproglyglyglyglyserglyglyglyglyser

435440445

thrserglyglyglyglyserglyglyglyglyservalvallysarg

450455460

glyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargpro

465470475480

valglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheproglu

485490495

gluglugluglyglycysgluleuglyglyglyglyserglyglygly

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glyserglyglyglyglyserargvallyspheserargseralaasp

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alaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasn

530535540

leuglyargarggluglutyraspvalleuasplysargargglyarg

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aspproglumetglyglylysproargarglysasnproglnglugly

565570575

leutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglualatyrserglu

580585590

ileglymetlysglygluargargargglylysglyhisaspglyleu

595600605

tyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleuhis

610615620

metglnalaleuproproargthrserglyserglyalathrasnphe

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serleuleulysglnalaglyaspvalglugluasnproglypromet

645650655

glyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthrphepro

660665670

lysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleugluasp

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glylyslysvalaspserserargaspargasnlysprophelysphe

690695700

metleuglylysglngluvalileargglytrpglugluglyvalala

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glnmetservalglyglnargalalysleuthrileserproasptyr

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leuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglyglyglyglyser

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glyglyglyglyserglyalametvalglyalaleugluserleuarg

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glyasnalaaspleualatyrileleusermetgluprocysglyhis

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cysleuileileasnasnvalasnphecysarggluserglyleuarg

805810815

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820825830

serserleuhisphemetvalgluvallysglyaspleuthralalys

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lysmetvalleualaleuleugluleualaargglnasphisglyala

850855860

leuaspcyscysvalvalvalileleuserhisglycysglnalaser

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hisleuglnpheproglyalavaltyrglythraspglycysproval

885890895

servalglulysilevalasnilepheasnglythrsercysproser

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