一种浒苔芽孢杆菌Y15‑8及其抗肿瘤活性蛋白的制作方法

本发明属于海洋生物资源和生物医药技术领域，具体地涉及一种浒苔芽孢杆菌y15-8及其抗肿瘤活性蛋白。

背景技术：

当今社会，恶性肿瘤一直严重威胁着人类生命和健康，是中国乃至全人类社会的第一大杀手。现如今，临床上治疗恶性肿瘤的手段多是采用综合疗法，以手术切除、放疗、化疗和免疫治疗相结合。在癌症化疗领域，许多微生物来源的天然产物虽具有较强的药效，但其分子量大，水溶性较低，毒性较强，副作用大等因素导致许多天然产物无法继续应用，因此，寻找有效的抗肿瘤药物与方法仍是全球的研究热点。

海洋微生物作为抗肿瘤活性物质的新来源，已经受到了全世界海洋研究工作者的关注。随着研究的深入，海洋微生物来源的天然抗肿瘤药物研究取得了较多成果，具有良好的发展优势:①微生物发酵产生的较多次级代谢产物化学结构独特且复杂，难以人为合成，为新药开发利用提供了唯一且宝贵的来源；②许多微生物代谢产物化合物分子量小，水溶性强，毒性弱，可直接作为药物使用，不仅具有潜在的治疗活性，且具有临床发展需要的药物代谢动力学属性；③微生物具有生长周期短、代谢过程易控制、菌种易选育的特点，可通过大规模发酵培养而实现工业化生产。

浒苔作为一种重要的海洋资源，含有丰富的碳水化合物、氨基酸、微量元素、维生素、脂肪酸等营养物质，具有降血糖、抗菌消炎、抗肿瘤活性、提高免疫力的作用。我国浒苔资源十分丰富，仅青岛沿海2016年的爆发量就在50万t以上，目前来看对浒苔的研究已比较成熟，但是多数未实现规模化利用，整体利用率不高，造成浒苔资源的大量浪费。同时浒苔中还含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今为止还没有被充分挖掘和利用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供一种浒苔芽孢杆菌y15-8及其抗肿瘤活性蛋白，克服现有技术的不足，提高海洋资源的利用率。

一种浒苔芽孢杆菌y15-8(bacillussp.y15-8)，该浒苔芽孢杆菌y15-8于2016年12月12日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为cctccm2016744。

本发明还提供一种所述浒苔芽孢杆菌y15-8发酵产生的浒苔芽孢杆菌蛋白,所述蛋白具有抗肿瘤活性；所述浒苔芽孢杆菌y15-8的发酵培养条件为：发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏2～6g/l、蛋白胨7～12g/l、氯化钠2～6g/l，ph6.0～9.0，在1.05kg/cm²，115～121℃，15～35min的条件下灭菌，在150～250r/min，25～37℃的条件下在恒温震荡摇床中培养48～80h。

本发明还提供一种浒苔芽孢杆菌y15-8抗肿瘤活性蛋白的制备方法，步骤如下：

(1)发酵培养

将浒苔芽孢杆菌y15-8发酵，发酵条件：发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏2～6g/l、蛋白胨7～12g/l、氯化钠2～6g/l、ph6.0～9.0，在1.05kg/cm²，115～121℃，15～35min的条件下灭菌，在150～250r/min、25～37℃的条件下在恒温震荡摇床中培养48～80h；

(2)超滤截留

将浒苔芽孢杆菌y15-8发酵培养所得到的发酵液，在8000～10000rpm，10～25min条件下离心，收集上清液，用分子量为3kda和50kda的超滤膜超滤，获得分子量3～50kda之间的组分；

(3)硫酸铵沉淀

将步骤(2)分子量3～50kda的活性组分轻轻搅拌，缓慢地添加硫酸铵粉末，使其质量百分比浓度达到60％，期间控制温度3～6℃，全部溶解后冰箱静置10～12h，在10000～12000rpm，25～35min的条件下离心，收集上清，将得到的上清液继续添加硫酸铵粉末，使其质量百分比浓度达到75％，期间控制温度3～6℃，全部溶解后冰箱静置10～12h，在10000～12000rpm，25～35min的条件下离心，收取沉淀，使用两倍于沉淀体积的20～50mmph7.5～8.5tris-hcl溶解，再用截留分子量为3.5kda的透析袋透析20～24h；

(4)阴离子交换层析(q或deae)

将上述步骤(3)获得的具有抗肿瘤活性的组分过0.22μm微孔滤膜；过q或deae阴离子交换层析柱，每次上样量为5～50ml，洗脱液为含1～2mol/lnacl的20～50mmol/l、ph7.5～8.5的tris-hcl，洗脱液以0-100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3-6ml/min，检测波长为280nm，收集穿透峰q1，q1组分脱盐后进行真空冷冻干燥，得到浒苔共生微生物活性蛋白，将其命名为浒苔芽孢杆菌蛋白(proteinfrombacillussp.y15-8，简称pby15-8)。

进一步，上述步骤(4)中的洗脱液中nacl的浓度优选为1mol/l。

进一步，上述步骤(4)中的洗脱液的流速优选为2.0ml/min。

进一步，上述步骤(4)中每次上样量优选为5ml。

本发明还提供一种治疗或预防人肝癌细胞hepg2、人肺腺癌细胞a549、或人肺癌细胞nci-h460的药物，所述药物包括所述的浒苔芽孢杆菌蛋白。

本发明还提供所述浒苔芽孢杆菌蛋白在治疗或预防人肝癌细胞hepg2、人肺腺癌细胞a549或人肺癌细胞nci-h460药物中的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果：该菌株与浒苔共附生，其产生的代谢产物活性蛋白对多种肿瘤细胞具有细胞毒性，具有较好的研究价值和应用前景。

附图说明

图1y15-8在牛肉膏蛋白胨培养基上的形态特征图；

图2硫酸铵沉淀活性组分过q阴离子交换层析图谱；

图3pby15-8对人肝癌细胞bel-7402形态变化的影响；

图4pby15-8对人肺腺癌细胞a549形态变化的影响；

图5pby15-8对人大细胞肺癌细胞nci-h460形态变化的影响；

图6pby15-8对人肝癌细胞bel-7402增殖的抑制；

图7pby15-8对人肺腺癌细胞a549增殖的抑制；

图8pby15-8对人大细胞肺癌细胞nci-h460增殖的抑制。

浒苔芽孢杆菌y15-8，拉丁文名称为bacillussp.y15-8，2016年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号为cctccm2016744。

具体实施方式

下面通过实例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实例任何形式的限制。并不限于下列实例：

实例1浒苔芽孢杆菌y15-8的筛选分离过程

(1)活性初筛

从青岛海域捞取新鲜浒苔，将其研磨粉碎成原浆，分别采用海水基础培养基2216e、lb培养基和牛肉膏蛋白胨培养基nrg等不同培养基对浒苔样品进行多次选择性的涂布、划线和分离培养，共获得27株单菌落。对这27株浒苔共生微生物的发酵产物进行抗肿瘤活性初筛，结果发现，对肝癌细胞bel-7402的抑制率达到50％以上的有2株。

(2)菌株复筛

测定上述2种活性菌株发酵液对其他肿瘤细胞，包括人肝癌细胞hepg2、人肺腺癌细胞a549和人肺癌细胞nci-h460的增殖抑制作用。结果表明，其中有一株菌y15-8的发酵液对以上肿瘤细胞均具有较好的细胞增殖抑制作用，其中对人肝癌细胞hepg2、人肺腺癌细胞a549和人肺癌细胞nci-h460的抑制率达53.2％、58.9％、55.6％。

实例2浒苔芽孢杆菌y15-8的形态特征与生理生化特征

(1)形态特征

对菌株进行革兰氏染色，为革兰氏阴性菌。菌株y15-8具有芽孢杆菌属的杆菌形态和产芽孢能力这两种重要特征，在牛肉膏蛋白胨培养基nrg上培养36h后，菌落呈圆形，表面干燥粗糙，粘稠，不易挑起，菌落质地均匀，正反面、边缘以及中央部分的颜色很均一，菌落颜色为乳白色(如图1)。

该菌为好氧菌，在ph值为7.5，培养温度为30℃时生长良好。

(2)生理生化反应特征

主要根据《普通细菌学方法手册》和《常见细菌系统鉴定手册》的方法，采用api20e肠杆菌和其它革兰阴性杆菌鉴定系统和api20n非肠道革兰阴性杆菌鉴定系统和氧化酶试纸测定生理生化特征，根据说明书进行具体操作，测定部分生理生化特征，结果为阴性：β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、h2s产生、脲酶、色氨酸脱氢酶、吲哚实验、明胶酶、氧化酶试验；阳性：鸟氨酸脱羧酶、vp实验。发酵利用阴性：甘露醇、肌醇、蔗糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖；阳性：葡萄糖、山梨醇、鼠李糖、蜜二糖。同化实验阴性：柠檬酸。

(3)16srrna序列分析

吸取1.5ml处于对数生长期的y15-8菌液，4℃，12000rpm，离心10min。弃上清液，加入400μl的te缓冲液，用枪头将沉淀吹打均匀，加入10μl的溶菌酶，混合均匀，置于37℃水浴中90min，4℃，12000rpm，离心10min，保留上清即为dna溶液。采用16srdna通用引物，正向引物：27f5’-agagtttgatcctggtcag-3’，反向引物1492r5’-cggctaccttgttacgactt-3’；16srrna序列的pcr条件是：95℃预变性5min；95℃变性40s，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环30次，72℃延伸10min。pcr反应体系是：反应体系：50μl，模板dna：3μl，上游引物：2μl，下游引物：2μl，mix：25μl，freewater：18μl。

用1.5％的琼脂糖电泳检测pcr扩增产物，以d2000marker为标准分子量对照试剂。将菌株y15-8的16srrnapcr产物送到北京华大基因进行测序。序列见最后，测得菌株y15-8的16srrna序列长度为1430bp。具体序列见seq、no.1

将该16srrna序列在ncbi网站进行blast比对，进行同源序列检索，确定该菌为芽孢杆菌属(bacillus)，可能是一种新的芽孢杆菌，命名为浒苔芽孢杆菌bacillussp.y15-8。该海洋芽孢杆菌y15-8于2016年12月12日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为cctccm2016744。16srrna基因序列在某些位点发生突变的几率有所不同，但在种、属水平上表现出结构和功能的保守性，有“细菌化石”之誉，是生物进化史的计时器。采用16srrna作为分子指标，可以实现对微生物进行快速、准确、微量、简便的分类鉴定。

实例3浒苔芽孢杆菌y15-8的发酵培养

将筛选出的浒苔芽孢杆菌y15-8(拉丁文名称为bacillussp.y15-8，2016年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号为cctccm2016744。接于含4ml种子培养液的试管中，种子培养液：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，以上为各成分的终浓度，ph7.5。置于30℃、200rmp恒温震荡培养箱中培养过夜；做梯度稀释涂布平板，固体培养基：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂20g/l，以上为各成分的终浓度，ph7.5。将涂布的平板置于30℃恒温培养箱中倒置培养18-36h；挑取单菌落接于4ml试管种子培养液中，于30℃、200rmp恒温震荡培养箱培养；待到对数生长期，按照4％接种量接于含50ml发酵培养液的250ml三角瓶中，于30℃、200rmp恒温震荡培养箱培养12h；然后按照4％的接种量接于含400ml发酵培养液2l三角瓶中，发酵培养液：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，以上为各成分的终浓度，ph7.5。将发酵液于9800rmp、25min、4℃离心，收集发酵上清液8l。

实例4浒苔芽孢杆菌y15-8活性蛋白的制备

(1)超滤

将收集到的发酵上清8l进行超滤浓缩。然后用分子量3kda和50kda的超滤膜超滤，获得分子量为3～50kda的活性组分。

(2)硫酸铵沉淀

在3～50kda的组分中慢慢地添加硫酸铵粉末，轻轻搅拌，使其浓度达到60％(质量百分比浓度)，期间控制温度4℃，全部溶解后冰箱静置10～12h；在9800rpm，25min的条件下离心，收取上清，继续添加硫酸铵粉末，使其浓度达到75％(质量百分比浓度)，期间控制温度4℃，全部溶解后冰箱静置10～12h；在9800rpm，25min的条件下离心，收取沉淀，使用两倍于沉淀体积的50mmph8.0tris-hcl溶解，再用截留分子量为3.5kda的透析袋透析22h，然后将样品过0.22μm微孔滤膜。

(3)过q阴离子交换层析柱

将上述硫酸铵沉淀获得的60％～75％(质量百分比浓度)的抗肿瘤活性组分，溶于一定量的上样缓冲液中，上样缓冲液为ph8.0的50mmol/ltris-hcl缓冲液，在15min、12000rmp的条件下离心，并将样品过0.22μm微孔滤膜；过q阴离子交换层析柱，每次上样量为5ml，洗脱液为含1mol/lnacl的ph7的50mmol/ltris-hcl缓冲液，洗脱液以0～100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为2ml/min，检测波长为280nm，收集各个穿透峰(q1、q2)和洗脱峰(r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7)(如图2)，检测各峰组分的抗肿瘤活性，穿透峰q1活性最佳。将穿透峰q1所收集的样品除盐后进行冷冻干燥，即为所制备的浒苔芽孢杆菌y15-8活性蛋白pby15-8。

实例5pby15-8对人肝癌细胞bel-7402形态变化的影响

将pby15-8作用人肝癌细胞bel-7402，浓度为10μg/ml，不同作用时间(0h、12h、24h、48h)对应的细胞形态变化情况，经多肽作用12h，大部分bel-7402细胞变圆，并有少量细胞解体；作用24h，几乎全部bel-7402细胞变圆，并有大量细胞解体；当作用48h，仅存少量活细胞，并处于圆形状态，大量细胞已死亡(如图3)。

实例6pby15-8对人肺腺癌细胞a549形态变化的影响

将pby15-8作用人肺腺癌细胞a549，浓度为10μg/ml，不同作用时间(0h、12h、24h、48h)对应的细胞形态变化情况，经多肽作用12h，大部分a549细胞变圆，并有少量细胞解体；作用24h，几乎全部a549细胞变圆，并有大量细胞解体；当作用48h，仅存少量活细胞，并处于圆形状态，大量细胞已死亡(如图4)。

实例7pby15-8对人大细胞肺癌细胞nci-h460形态变化的影响

将pby15-8作用人大细胞肺癌细胞nci-h460，浓度为20μg/ml，不同作用时间(0h、12h、24h、48h)对应的细胞形态变化情况，经多肽作用12h，大部分细胞正常生长，少量细胞受到抑制；作用24h，大量细胞变圆，并有少量细胞解体；当作用48h，仅存少量活细胞，并处于圆形状态，大量细胞已死亡(如图5)。

实例8pby15-8对人肝癌细胞bel-7402增殖的抑制

以人肝癌细胞bel-7402为作用细胞，通过mtt法，发现pby15-8对bel-7402具有较好的增殖抑制作用，随着多肽浓度的变化呈剂量依赖关系，浓度梯度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml和10μg/ml，作用时间为48h，ic50为6.95μg/ml(如图6)。

实例9pby15-8对人肺腺癌细胞a549增殖的抑制

以人肺腺癌细胞a549为作用细胞，通过mtt法，发现pby15-8对bel-7402具有较好的增殖抑制作用，随着多肽浓度的变化呈剂量依赖关系，浓度梯度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml和10μg/ml，作用时间为48h，ic50为11.48μg/ml(如图7)。

实例10pby15-8对人肺癌细胞nci-h460增殖的抑制

以人肺癌细胞nci-h460为作用细胞，通过mtt法，发现pby15-8对nci-h460具有较好的增殖抑制作用，而且随着多肽浓度的变化呈剂量依赖关系，浓度梯度为2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml，作用时间为48h，ic50为21.13μg/ml(如图8)。

本实施例所述的mtt法：取对数生长期的肝癌细胞bel-7402，弃掉旧培养液，加入0.25％胰酶1.5ml消化2～3min，显微镜下观察，当细胞间质回缩，细胞间隙清楚时，弃去胰酶。加入5ml新鲜的dmem培养液，充分吹打制成单细胞悬液，以4×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每孔180μl，在37℃，5％co2培养箱中预培养12h，然后每孔加入20μl样品，样品溶液应先经过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，并设阴性对照组和空白对照组，均设4个重复孔，继续培养48h；然后，加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，置5％co2培养箱37℃培养4h；终止培养，小心吸出孔中培养液，然后每孔加二甲基亚砜dmso150μl，置摇床上室温低速振荡10min以充分溶解甲瓒结晶，使用酶标仪在570nm下检测各孔吸光度(od)值，计算细胞抑制率(％)＝(对照孔od值－给药孔od值)/对照孔od值×100％。采用excel分析软件计算半数抑制浓度ic50，数据分析采用spss18.0软件完成，以平均值±标准偏差表示，组间比较采用t检验，p<0.05表示两组间差异显著，p<0.0l表示两组间差异极显著。

bacillussp.y15-816srrna序列：

tctgaccaccttcggcggctggctccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgggattggctaaaccttgcggtctcgcagccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagtttcccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgcgagcagttactctcgcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccattaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcatccttgaaccatgcggttcaaggaactatccggtattagctccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatccgggagcaagctcccttctgtccgctcgactgca

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<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>一种浒苔芽孢杆菌y15-8及其抗肿瘤活性蛋白

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