本发明属于有机合成领域，涉及一种吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其治疗胃癌的用途。本发明通过高通量筛选及后续结构修饰改造，发现了一系列以吡唑并[1,5-a]嘧啶为基本骨架，具有优良trpc6抑制效果，同时对胃癌细胞及胃肿瘤均有良好抑制效果的化合物。
背景技术：
根据世界卫生组织的最新报道，胃癌的发病率居于全球恶性肿瘤发病率的第5位，其死亡率更是高居第3位，仅次于肺癌与肝癌。中国每年胃癌新发病例占世界新发病例40％以上，相比欧美地区较低的胃癌发病率及日韩地区较高的早期胃癌诊断率，我国面临着十分严峻的抗击胃癌形势。在我国，超过80％的新发病例一经诊断已达进展期，而我国各地胃癌诊疗水平参差不齐，难以达到统一的规范化标准治疗，因此，如何提高进展期胃癌治疗的疗效并保证治疗的安全性将是未来相当长一段时间内面临的艰巨任务。
近年来，尽管外科手术放化疗介入治疗、生物治疗等多学科治疗方法在胃癌的综合性治疗中有了长足的发展，但药物治疗方案仍是大多数胃癌患者，尤其是晚期患者的主要治疗方案。胃癌药物治疗的目的是缓解症状、控制肿瘤生长、提高生活质量和延长患者的生存时间，目前新辅助化疗、多药联合化疗以及姑息性化疗等构成了胃癌药物治疗的主要治疗手段。特别是晚期胃癌的治疗并没有重大进展。大部分对化疗的反应仍是部分和短期缓解，中位生存期也只有7-9个月，2年生存者不到10％。总体效果仍然很差。胃癌治疗亟需有新的疗效更好的治疗药物。
肿瘤细胞的一个特性就是不可控制的增殖。除了大量分泌细胞分裂原之外，肿瘤细胞还可以改变细胞膜受体和离子通道的功能表达，接受外来信号，从而对细胞分裂原超敏。钙离子内流是这个过程中必须的。细胞分裂原诱导钙内流，而钙内流的减少可使细胞生长终止。钙离子与trp通道有着重要的联系。大量研究报道表明，胃癌的发生发展与离子通道密切相关。
瞬时受体电位(transientreceptorpotential,trp)通道发现于果蝇的一种突变体中，当给予光刺激后，细胞内的钙离子会瞬时升高。trp通道广泛存在于细胞膜上，是一种非选择性的阳离子通道蛋白，具有调节感觉传导、参与细胞信号传递及调节发育等重要作用，是目前离子通道领域研究的热点之一。trp通道蛋白广泛表达于多种生物、组织及细胞中。包括7个相互关联的亚家族：trpc、trpv、trpm、trpn、trpa、trpp和trpml，trp作为一种细胞内外的分子传感器。哺乳动物trp通道的激活，除了各种内源性和外源性化学配体外，trp通道可以调节各种各样的刺激，如机械力(渗透压力、体积、伸展、和振动)、温度、ph值、膜电位、细胞的氧化还原、能量状态和二价阳离子。trp通道可能是由相同的或不同的亚基四聚体组成，每个亚基由六个跨膜螺旋结构和细胞内的n-和c-末端组成。并且已经发现它们在质膜和细胞器膜上有表达。
作为一种传统型的trp通道，trpc是第一个被研究分离出的trp通道蛋白。相对于其他通道来说，trpc通道与trp通道最相似，即为最初发现的果蝇突变体的trp蛋白，包括7个亚型，trpc(1-7)，其中trpc3和trpc6其氨基酸一致程度高达70％-80％，在结构、功能上都非常接近，在药理学性质和信号调节功能方面也比较相似，是trpc亚家族中非常具有代表性的一个亚型，也是目前研究中颇受关注的2个亚型。
trpc6是一种非选择性的钙离子可通过的阳离子通道，它是选择性最强的通道蛋白。trpc6定位于染色体11q212q22，共132287个碱基(基因库：nc000011)，含13个外显子。trpc6的转录产物mrna含4564个碱基，其中5’未翻译区是第1-427位，编码区为第428-3223位，3’未翻译区是第3224-4564位(基因库：nm004621)。trpc6可特异性的被磷脂酶c(plc)激活，通过g-蛋白偶联受体(gpcr)介导的信号传导通路使配体与膜受体结合，激活磷脂酶c生成1,4,5-三磷酸肌醇，后者与受体结合促使内质网释放ca2+。钙离子在机体内保持稳态，对维持机体功能有重要作用。细胞内钙离子浓度的增加主要来源于细胞外钙离子内流和细胞内钙源的的释放。钙的内流和释放被细胞的各种调控系统精密控制。细胞内游离ca2+升高，激活一些蛋白磷酸酶，使底物蛋白磷酸化，将外界信号级联放大，进入核内，影响dna复制，导致细胞恶变及肿瘤细胞的增殖分化。细胞内ca2+直接参与调控肿瘤的生长，侵袭，转移和分化。所以，trpc6抑制剂有望成为治疗癌症的新药物。
自发现trpc6通道以来，有大量研究报导了trpc6与肿瘤的关系。结果证明，trpc6与胃癌、肝癌、食管癌、胶质瘤等这些发病率和致死率都很高的疾病有着重要的联系。不过关于trpc6抑制剂的报道寥寥无几。最早关于trpc6的抑制剂是王以政等发现的化合物skf96365为代表。该化合物对胃癌细胞mkn45和ags都有较好的抑制作用，该化合物能将细胞生长抑制在g2/m期，对接种胃癌的裸鼠也有一定的疗效，但是起效慢，周期长，需要连续给药7周才能看出效果。davidg.w.在2013年报道了trpc3和trpc6的抑制剂，他们合成的化合物对htrpc3和htrpc6的ic50值可以达到纳摩尔级别，但是在体内试验中，发现该系列药物口服利用度很低，体内清除率过高，虽然经过一系列的结构改造，但是仍然无法找到活性和口服利用率均处于较好的水平的一种结构。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物。本发明还提供上述化合物的细胞水平及靶点水平的活性筛选结果及其抗肿瘤应用。
本发明涉及的一种吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物，具有通式1所示的结构：
其中，
r1为氢、烷基、芳基；
r2为氢、烷基、芳基；
r3为烷基、芳基、烷胺基、芳胺基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基；
r4为氢、卤素、硝基、氨基或者氨基的衍生基团，所述氨基的衍生基团如烷胺基、芳胺基、酰胺基、磺胺基、烯胺基等；
r5为羟基、氯；
x1为碳或者氮；
x2为碳或者氮；
所述烷基为链状、环状或者笼状烷基，如甲基、烯丙基、氯乙基、正壬基、异丁基、叔丁基、环己基、环庚基、金刚烷基等；
所述芳基为苯基、烷基取代的苯基、杂环芳基、烷基取代的杂环芳基；
所述烷氨基为链状、环状或者笼状烷基取代的氨基；
所述芳氨基为芳基取代的氨基如苯胺、苄胺等；
所述烷氧基为链状、环状或者笼状烷基取代的含氧基；
所述芳氧基为芳基取代的含基如苯氧、苄氧等；
所述烷硫基为链状、环状或者笼状烷基取代的含硫基；
所述芳硫基为苯硫、苄硫等；
所述的卤素为氟、氯、溴、碘。
本发明提供通式1所示化合物或其药学上可接受的盐酸盐。
本发明中所采用的述语“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益/风险比例，通常是水或油的或可分散的，并可有效的用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可用的并与通式1化合物的化学性质相容的。
有效量的通式1的化合物或其药学上可接受的盐酸盐的用途，用于治疗胃癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌或结肠癌等疾病或病症；本发明通式1的化合物或其药学上可接受的盐酸盐的用途，用于制备肿瘤抑制剂，优选用于制备trpc6抑制剂的用途。
本发明还提供通式1所示的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的制备方法。
本发明还提供对所述化合物的细胞水平的相关实验。细胞水平包括对trpc6通道的抑制实验和对胃癌细胞的生长抑制活性。
实验表明，相比上述现有技术，本发明的化合物具有如下技术效果。
1)结构新颖，合成简洁；
2)对trpc6通道的抑制效果优于现有技术；
3)对胃癌细胞具有很好的体外抗增殖作用。
具体实施方式
下述中阿拉伯数字1-13均指代具体化合物，
其中，化合物1为
化合物2为
化合物3为
化合物4为
化合物5为
化合物6为
化合物7为
化合物8为
化合物9为
化合物10为
化合物11为
化合物12为
化合物13为
并且，r1、r2、r3、r4、r5、x1、x2与发明内容中所述指代相同。
本发明中涉及到的具体化合物8-1，9-2，9-3，12-1，13-2，13-3为通式1所示的结构，其结构式如下表所示：
借助高通量筛选，经过一系列的优化改造，我们发现吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物这类化合物是优良的trpc6抑制剂，通过药理实验得出，尤其是化合物13-2能有效抑制胃癌细胞的增殖，是潜在的治疗胃癌的药物。
具体实施方式按照如下制备方法操作。
(1)当r1＝r2＝h时，按如下路线制备：
1)化合物4的制备：将化合物1，2溶于少量二氯甲烷，在100℃下回流反应8－24小时后，冷却到室温，再将此反应液加入到溶于50％etoh的盐酸肼溶液中，80℃回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和nahco3溶液碱化，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶，得白色至浅黄色固体，即化合物4。
2)将化合物4与化合物5溶于无水乙酸，加热回流，反应8-24小时后结束。冷却至室温，旋干溶剂，加入去离子水，并用1mnaoh溶液调至ph为8，再用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物6。
3)将化合物6用少量乙醇溶解，向其中滴加0.5m-5m的koh溶液，50-100℃反应8-40小时后结束，冷却至室温，用去离子水淬灭，二氯甲烷萃取，分出水相，水相用1mhcl调节ph为3，过滤出白色沉淀，残渣用水洗，烘干，即为化合物7。
4)将化合物7与不同的胺或醇或其它能与羧基反应的小分子化合物进行缩合即得到化合物8。
5)将化合物8溶于三氯氧磷，在封管中于100℃条件下反应，10-20小时后，停止加热，将反应液倒入冰水混合物中，过滤，残渣用水洗，烘干，即可得化合物9。
(2)当r1，r2至少有一个不为h时，按如下路线制备：
1)化合物4的制备：将化合物1，2溶于少量二氯甲烷，在100℃下回流反应8－24小时后，冷却到室温，再将此反应液加入到溶于50％etoh的盐酸肼溶液中，80℃回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和nahco3碱化，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色至浅黄色固体，即化合物4。
2)将化合物4与化合物5溶于无水乙酸，加热回流，反应8-24小时后结束。冷却至室温，旋干溶剂。加入去离子水，并用1mnaoh溶液调至ph为8，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，饱和食盐水洗，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物6。
3)将化合物6溶于dmf，0℃下加入nah,半小时后加入卤代烷，使自然恢复到室温，反应8-20小时后结束，在冰浴条件下加入去离子水淬灭，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，过硅胶柱，分离得到化合物10。
4)将化合物10用少量乙醇溶解，向其中滴加0.5m-5m的koh溶液，50-100℃反应8-40小时后结束，冷却至室温，用去离子水淬灭，二氯甲烷萃取，分出水相，水相用1mhcl调节ph为3,过滤出白色固体，即为化合物11。
5)将化合物11与不同的胺或者醇或者其它能与羧基反应的小分子化合物进行缩合即得化合物12。
6)将化合物12溶于三氯氧磷，在封管中于100℃条件下反应，10-20小时后，停止加热，将反应液倒入冰水混合物中，过滤，残渣用水洗，烘干，即可得盐酸盐13。
通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。
实施例1
化合物8-1的制备：r1＝r2＝h，
(1)化合物4的制备：将化合物1(43.2ml)，2(43.8ml)溶于二氯甲烷(20ml)后在100℃下回流反应24小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50％etoh(100ml)的盐酸肼溶液中，80℃回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和nahco3碱化，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色固体，即化合物4(44.6g,82％)
(2)将化合物4(45.8g)与化合物5(36.4ml)溶于无水乙酸(300ml)，加热回流，反应24小时后结束。冷却至室温，旋干溶剂。加入去离子水(300ml)，并用1mnaoh溶液调至ph8，乙酸乙酯(3*200ml)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物6(60.5g,90％)。
(3)将化合物6(33.0g)用乙醇(200ml)溶解，向其中滴加1m的koh溶液(120ml)，70℃反应15小时后结束，冷却至室温，用去离子水(400ml)淬灭，二氯甲烷(3*100ml)萃取，分出水相，水相用1mhcl调节ph3,过滤出白色固体，残渣用水洗，真空干燥箱干燥，得化合物7(26.7g,89％)。
(4)将化合物7(900mg),1-叔丁氧羰基哌嗪(727mg)溶于二氯甲烷(5ml),加入dmap(440mg),edci(750mg),室温搅拌过夜，加入去离子水5毫升淬灭，二氯甲烷(3*5ml)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，用dcm:meoh＝100:1作洗脱剂，分离得黄色固体8-1(1.16g,82％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.26(s,2h),7.02(d,j＝4.1hz,2h),5.60(s,1h),3.78(s,1h),3.48(dd,j＝52.0,27.9hz,4h),2.30(d,j＝3.9hz,2h),1.46(d,j＝6.3hz,5h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ167.0,160.5,157.0,154.4,151.4,146.8,138.4,130.3(s,0h),130.2,103.2,97.0,80.7,45.8,41.8,34.7,28.4,13.0.
实施例2
化合物12-1的制备：r1＝r2＝-et，
(1)化合物4的制备：将化合物1(43.2ml)，2(43.8ml)溶于二氯甲烷(20ml)后在100℃下回流反应24小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50％etoh(100ml)的盐酸肼溶液中，80℃回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和nahco3碱化，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色固体，即化合物4(44.6g,82％)
(2)将化合物4(21.8g)与化合物5(18.2ml)溶于无水乙酸(150ml)，加热回流，反应20小时后结束。冷却至室温，旋干溶剂。加入去离子水(150ml)，并用1mnaoh溶液调至ph8，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物6(34.5g,91％)。
(3)将化合物6(23.7g)溶于thf(250ml),冰浴条件下分批加入70％nah(8.65g),在该温度下搅拌30分钟后，缓慢加入碘乙烷(17.5ml),使自然恢复到室温，15小时后反应结束，在冰浴条件下加入去离子水淬灭，旋干thf,乙酸乙酯(3*500ml)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得化合物10(17.6g,81％)。
(4)将化合物10(14.5g)用乙醇(70ml)溶解，向其中滴加1m的koh溶液(40ml)，90℃反应15小时后结束，冷却至室温，用去离子水(150ml)淬灭，二氯甲烷(3*100ml)萃取，分出水相，水相用1mhcl调节ph＝3,过滤出白色固体，残渣用水洗，真空干燥箱干燥，得化合物11(11.95g,88％)。
(5)将化合物11(1.22g),1-叔丁氧羰基哌嗪(727mg)溶于二氯甲烷(5ml),加入dmap(440mg),edci(750mg),室温搅拌过夜，加入去离子水5毫升淬灭，二氯甲烷(3*5ml)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，用dcm:meoh＝100:1作洗脱剂，分离得化合物12(1.31g,78％)。
(6)将化合物12(541mg)溶于三氯氧磷(2ml),用封管在100℃下过夜反应，冷却至室温，将反应液倒入冰水混合液中，用nahco3溶液调ph8，二氯甲烷(3*15ml)萃取,饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯重结晶，得黄色盐酸盐12-1(531mg,95％)。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ11.83(s,1h),7.45(dd,j＝8.5,5.6hz,2h),7.34(t,j＝8.9hz,2h),4.68(s,1h),4.59(s,1h),3.95(d,j＝16.3hz,1h),3.81(d,j＝16.5hz,1h),2.82(d,j＝13.8hz,1h),2.58(d,j＝12.7hz,2h),2.51-2.55(q,4h),2.34(s,1h),2.30(s,1h),2.28(s,3h),2.08(d,j＝9.2hz,1h),1.98(d,j＝10.1hz,1h),1.73(dd,j＝15.9,6.5hz,1h),1.66–1.53(m,1h),1.24(s,2h)，0.98(t,j＝12hz,6h).13cnmr(101mhz,d6-dmso)δ182.7,177.7,148.4,142.8,138.1,135.7,128.5,127.6,135.4–124.4(m,6h),102.1(s,2h),99.3(s,2h),54.8(s,2h),48.4(s,1h),37.9(s,2h),35.4(s,7h),32.5(s,5h),31.5(s,3h),30.1(s,3h),14.9(s,1h),8.3(s,2h).
实施例3
化合物13-2的制备：r1＝r2＝-me，
(1)将化合物1(43.2ml)，2(45.2ml)溶于二氯甲烷(20ml)后在100℃下回流反应24小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50％etoh(100ml)的盐酸肼溶液中，80℃回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和nahco3碱化，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色固体，即化合物4(37.6g,85％)
(2)将化合物4(17.7g)与化合物5(18.2ml)溶于无水乙酸(150ml)，加热回流，反应20小时后结束。冷却至室温，旋干溶剂。加入去离子水(150ml)，并用1mnaoh溶液调至ph8，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物6(29.3g,88％)。
(3)将化合物6(20.8g)溶于thf(250ml),冰浴条件下分批加入70％nah(8.65g),在该温度下搅拌30分钟后，缓慢加入碘乙烷(17.5ml),使自然恢复到室温，15小时后反应结束，在冰浴条件下加入去离子水淬灭，旋干thf,乙酸乙酯(3*500ml)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得化合物10(17.6g,81％)。
(4)将化合物10(12.1g)用乙醇(70ml)溶解，向其中滴加1m的koh溶液(40ml)，90℃反应15小时后结束，冷却至室温，用去离子水(150ml)淬灭，二氯甲烷(3*100ml)萃取，分出水相，水相用1mhcl调节ph＝3,过滤出白色固体，残渣用水洗，真空干燥箱干燥，得化合物11(10.4g,93％)。
(5)将化合物11(1.0g),1-叔丁氧羰基哌嗪(727mg)溶于二氯甲烷(5ml),加入dmap(440mg),edci(750mg),室温搅拌过夜，加入去离子水5毫升淬灭，二氯甲烷(3*5ml)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，用dcm:meoh＝100:1作洗脱剂，分离得化合物12(1.04g,72％)。
(6)将化合物12(467mg)溶于三氯氧磷(2ml),用封管在100℃下过夜反应，冷却至室温，将反应液倒入冰水混合液中，用nahco3溶液调ph为8，二氯甲烷(3*15ml)萃取,饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯重结晶，得黄色盐酸盐13-2(438mg,90％)。1hnmr(500mhz,d6-dmso)δ7.55–7.50(m,2h),7.24–7.19(m,2h),7.16–7.11(m,2h),4.06(dt,j＝8.6,6.0hz,1h),3.17-3.10(m,1h),1.99–1.89(m,4h),1.84(dt,j＝13.0,7.0hz,4h),1.78–1.68(m,6h),1.45(s,3h),1.44(s,3h),1.42(s,6h).
实施例4
化合物对trpc6通道的抑制实验
用激动剂m085激活trpc6通道后，加入不同的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物，结果表明，该类化合物能有效抑制trpc6离子通道。
具体实施方式如下：永久转染m5毒蕈碱受体和trpc6离子通道的hek293细胞中，应用激动剂激活通道并检测荧光膜电位。细胞用0μm、10μm、30μm的被测试样品处理3分钟后，加入10μm的激动剂m085，荧光强度增强表示膜电位去极化增加，荧光强度减弱表示膜电位去极化降低。化合物8-1，9-2，9-3，12-1，13-2，13-3全细胞膜片钳检测实验结果如表1所示。
表1：化合物对trpc6通道的抑制实验
结果表明，化合物8-1，9-2，9-3，12-1，13-2，13-3对trpc6通道的抑制效果均在10μm以下，特别是化合物13-2对trpc6通道的ic50值达1.8μm。意味着这类化合物均能明显抑制trpc6通道的活性。
实施例5
化合物对胃癌细胞mkn45和ags抑制实验
本发明采用mtt法来研究化合物对胃癌细胞mkn45和ags的抑制作用。将mkn45/ags细胞种植在96孔板上，密度为4×103/ml，在37度，5％co2培养箱中过夜培养使细胞贴壁。24h后细胞加入不同浓度的被测试化合物进行处理，化合物使用rpmi-1640完全培养基稀释0.01m的储备液进行配置，以含0.1％dmso的rpmi-1640完全培养基溶液为对照。每种化合物每个浓度设3个平行孔，每孔加入带化合物培养基体积为100μl。加完后于37℃，5％co2条件下培养72h。每孔加入10％的浓度为5mg/ml的mtt溶液。37℃静置孵育4h，弃去含mtt的培养基，每孔加入150μldmso溶解沉淀，使紫色结晶完全溶解，于570nm处测定吸光度值a，根据各孔od值计算药物对细胞增殖抑制率。
细胞存活率＝实验组od/对照组od×100％。
化合物8-1，9-2，9-3，12-1，13-2，13-3对mkn45和ags抑制实验的结果如表2所示。
表2化合物对ags和mkn45的抑制效果
结果表明浓度为5μm时，化合物9-2，13-2，13-3对ags细胞的抑制效果达50％左右；浓度为20μm时化合物9-2，9-3，13-2，13-3对ags细胞的抑制率达60％-85％，对mkn45细胞的抑制率达58％-70％。