piRNA‑514核苷酸类似物及其反义核苷酸的应用和应用其的产品的制作方法

本发明涉及医学工程技术领域，尤其是涉及一种pirna-514核苷酸类似物及其反义核苷酸的应用和应用其的产品。

背景技术：

世界卫生组织发布的《全球疾病负担》报告指出，心血管疾病已经成为全球人类死亡的主要原因。据我国2014年的统计数据，我国患心血管疾病的人数已超过2.7亿，每年300万人死于心血管疾病。心血管疾病在中老年人群的发病率和死亡率显著升高，因此，面对我国人口老龄化的现状，对心脏疾病进行发病机制和临床研究具有重要的理论和实践意义。

心肌肥大是心肌细胞针对血液动力学增加的一种应答反应，通常表现为组织水平上心肌组织的增厚和细胞水平上心肌细胞体积的增大，是许多心血管疾病(高血压、急性心肌梗塞、先天性心脏疾病等)发生发展过程中共有的病理变化。诱发心肌肥大的刺激因素主要包括机械张力和多种神经体液因子，如血管紧张素ii(angiotensinii,angii)、异丙肾上腺素(isoproteronol,iso)、胰岛素样生长因子-1(igf-1)、白介素-1(il-1)等。

pirna(piwi-interactingrna)是继sirna和mirna两类小rna之后，2006年首次在雄性生殖细胞中发现的一类新的非编码小rna，长度通常在26～31nt，5’端具有强烈的尿嘧啶偏向性，种类超过50,000个。

过去的研究曾一度认为pirna是生殖细胞所特有，因此主要集中于生殖细胞中pirna的功能研究，已有的研究结果表明pirna主要参与生殖细胞的发育、转座子的沉默、异染色质的形成和生殖细胞dna完整性的维持等过程。2012年，在cell杂志发表的一项研究发现了在海兔大脑中表达的pirna，通过调控creb蛋白的dna甲基化来调控神经细胞的记忆功能。由此，吸引了研究人员对于pirna在非生殖细胞中进行功能研究的兴趣。

目前，在心脏肥厚和心肌纤维化等心脏疾病中的关键pirna现在尚无报道，其所发挥的功能是对该领域科研人员的挑战。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供mirna-485-5p核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用；本发明的第二个目的在于提供一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物；本发明的第三个目的在于提供一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒；本发明的第四个目的在于提供mirna-485-5p反义核苷酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用；本发明的第五个目的在于提供一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，以缓解现有技术中存在的对在心脏肥厚和心肌纤维化等心脏疾病中的关键pirna研究尚属空白的技术问题。

本发明提供了pirna-514核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用；

所述pirna-514核苷酸类似物含有seqidno.1所示的序列。

进一步地，所述产品为药物或试剂盒。

进一步地，所述pirna-514核苷酸类似物的核苷酸序列中每个碱基均进行了化学修饰。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物，所述药物包括有效剂量的pirna-514核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测pirna-514核苷酸类似物的引物。

本发明还提供了pirna-514反义核苷酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用；

所述pirna-514反义核苷酸含有seqidno.2所示的序列。

进一步地，所述产品为药物。

另外，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，所述药物包括有效剂量的pirna-514反义核苷酸。

进一步地，所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。

进一步地，所述心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血压和心衰的一种或多种。

本发明提供的pirna-514核苷酸类似物通过实验发现，在肥大的心肌细胞中表达显著下调，过表达pirna-514能显著抑制由iso诱导的心肌细胞表面积增大。以上说明，pirna-514能够抑制心肌肥大的发生。这意味着pirna-514可作为一种早期诊断和早期预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物。因此，通过检测外周血血浆中pirna-514核苷酸的表达水平，用于对许多心脏疾病具有诊断和/或预后评估的潜在价值。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的使用异丙肾上腺素(iso)诱导的心肌肥大疾病模型小鼠与对照小鼠的心脏中，pirna-514表达水平的变化结果图；

图2为本发明实施例2提供的心脏肥大刺激及异丙肾上腺素(iso)诱导的心肌细胞肥大过程pirna-514表达水平的变化结果图；

图3为本发明实施例3提供的原代心肌细胞转染pirna-514核苷酸类似物后对心肌细胞表面积的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了pirna-514核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用，pirna-514类似物苷酸的序列如下(seqidno.1)：

5’-aaucagauuugcaccacucaucuugguga-3’。

其中，pirna-514核苷酸类似物的生物活性功能片段或变体，例如可以为，但不限于如下(1)-(3)：

(1)含有pirna-514核苷酸类似物的编码基因的重组载体；

(2)含有pirna-514核苷酸类似物的编码基因的重组病毒；

(3)含有pirna-514核苷酸类似物的编码基因的重组病毒载体。

在本发明中，产品为药物或试剂盒。

在本发明中，pirna-514核苷酸类似物的核苷酸序列中每个碱基均进行了化学修饰。

其中，化学修饰例如可以为，但不限于核糖修饰，碱基修饰或磷酸骨架修饰。

在一个优选的实施方式中，pirna-514核苷酸类似物的核苷酸序列中每个碱基均进行了2’-甲氧基修饰。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物，包括有效剂量的pirna-514核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，包括用于特异性检测pirna-514核苷酸类似物的探针或引物。

其中，用于特异性检测pirna-514核苷酸类似物的引物序列为：

反转录引物：

5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagtcaccaag-3’(seqidno.3)；

上游引物：5’-cgggcaatcagatttgcaccactcatct-3’(seqidno.4)；

下游引物：5’-tggtgtcgtggagtcg-3’(seqidno.5)。

另外，本发明还提供了pirna-514反义核苷酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用，pirna-514反义核苷酸的序列如下(seqidno.2)：

5’-ucaccaagaugaguggugcaaaucugauu-3’。

在本发明中，产品为药物。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，包括有效剂量的上述的pirna-514反义核苷酸。

在本发明中，用于预防和/或治疗心脏疾病的药物还包括药学上可接受的载剂或辅料。

其中，载剂或辅料例如可以为，但不限于壳聚糖、胆固醇、脂质体、环糊精、微球、微囊中的一种或多种。

在本发明中，用于预防和/或治疗心脏疾病的药物的给药方式，包括口服给药或注射给药。

其中，注射给药的方式例如可以为，但不限于静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射和心肌注射。

在本发明中，心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血压和心衰的一种或多种。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为本领域常规的分子生物学操作方法，涉及的试剂均为分析纯级试剂，涉及的试剂或仪器均可从正规渠道商购获得。

除非特别指出，以下各实施例中涉及的各种实验方法和操作，包括细胞培养，rna的提取，rcr扩增，荧光定量pcr，细胞染色等等，均可参见以下文献：wangk,etal,mir-361-regulatedprohibitininhibitsmitochondrialfissionandapoptosisandprotectsheartfromischemiainjury.celldeathdiffer.2015jun；22(6):1058-68.w.-q.tan,etal,foxo3ainhibitscardiomyocytehypertrophythroughtransactivatingcatalasejbiolchem.2008october31；283(44):29730-29739；wangk,etal,mir-9andnfatc3regulatemyocardinincardiachypertrophy,jbiolchem.2010apr16；285(16):11903-12；linz,etal,mir-23afunctionsdownstreamofnfatc3toregulatecardiachypertrophy,pnas,2009,106(29):12103-12108).上述文献在此全文引入作为参考。

实施例1使用异丙肾上腺素(iso)诱导的心肌肥大疾病模型小鼠与对照小鼠的心脏中，pirna-514表达水平变化的检测

选取c57bl/6j公鼠20只，分成对照组和模型组，通过植入式胶囊渗透泵分别渗透iso和生理盐水，构建心肌肥大的小鼠模型。分别提取两组小鼠心脏的总rna，实时荧光定量pcr技术检测pirna-514的表达水平，结果见图1。

从图1中可以看出，iso诱导的心肌肥大模型组小鼠心脏中，pirna-514表达下调，说明通过检测pirna-514表达水平的变化可作为心肌肥大临床诊断的依据。

实施例2异丙肾上腺素(iso)诱导的心肌细胞肥大过程pirna-514表达水平变化的检测

对于心肌细胞肥大模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，对心肌细胞用10μm异丙肾上腺素进行处理，在培养的不同时间，提取细胞的总rna，实时荧光定量pcr技术检测pirna-514的表达水平。本实施例采用对原代心肌细胞分别进行异丙肾上腺素处理0小时、8小时、16小时、24小时后，检测pirna-514在心脏中不同时间点的表达水平。提取心脏的总rna(用trizol试剂盒)，实时荧光定量pcr检测pirna-514的表达水平，结果见图2。

从图2中可以看出，在iso处理0、8、16、24小时后，pirna-514的水平以时间依赖的方式逐渐下降，进一步说明pirna-514可作为心肌肥大临床诊断的潜在标志物。

实施例3过表达pirna-514抑制原代心肌细胞细胞肥大的实验

本实施例中将实施例2提供的原代心肌细胞分为四组，分别为空白组，iso处理组，对照组及实验组，每组三个重复(细胞量约为1×10⁶)。

其中，空白组原代心肌细胞只使用正常细胞培养液进行培养。

iso处理组原代心肌细胞用10μm异丙肾上腺素进行处理。

实验组对原代心肌细胞用10μm异丙肾上腺素进行处理后，进行pirna-514核苷酸类似物(其序列为5’-aaucagauuugcaccacucaucuugguga-3’，seqidno.1，委托上海吉玛制药技术有限公司合成)的转染。

对照组与实验组的处理方法相同，仅将pirna-514核苷酸类似物替换为无意义序列的阴性对照rna(agomir-control)。

从图3中可以看出，pirna-514agomir诱导的pirna-514过表达能够降低iso诱导增加的细胞表面积。

综上所述，pirna-514能够抑制心肌肥大的发生，可作为一种早期诊断和早期预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物。因此，通过检测外周血血浆中pirna-514的表达水平，用于对许多心脏疾病具有诊断和/或预后评估的潜在价值；通过检测抑制pirna-514的表达水平，用于对许多心脏疾病具有预防和/或治疗的潜在价值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>青岛大学

<120>pirna-514核苷酸类似物及其反义核苷酸的应用和应用其的产品

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aaucagauuugcaccacucaucuugguga29

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ucaccaagaugaguggugcaaaucugauu29

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagtcaccaag44

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgggcaatcagatttgcaccactcatct28

<210>5

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tggtgtcgtggagtcg16