增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法与流程

本发明涉及的是生物医药领域，具体说是一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法，主要通过在珍贵束丝放线菌atcc31280中，利用红霉素抗性基因启动子增强pks基因ansa9的表达水平，从而增强安丝菌素的生物合成能力，进而提高安丝菌素产量。

背景技术：

安丝菌素是微生物来源的美登素类分子，属于i型聚酮化合物，由珍贵束丝放线菌（actinosynnemapretiosum）产生，具有很强的抗肿瘤活性，在其多个组分中，安丝菌素p-3活性最强。目前，安丝菌素的多种抗体偶联分子已经进入不同的临床实验阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的trastuzumabemtansine（即t-dm1）已经成药上市。鉴于其重要的医用价值，安丝菌素产量的提高受到了广泛研究。

通过文献调研，我们发现聚酮酶（pks）的活性会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类化合物的最终产量，而通过对生物合成途径中的限速酶表达基因进行过量表达是提高抗生素产量的一种常用策略。由前期转录数据分析我们发现，ap-3生物合成基因簇中的pks基因ansa9转录水平很低，可能为ap-3生物合成瓶颈。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株、该菌株其制备方法以及利用该菌株生产安丝菌素的方法。该突变菌株基于珍贵束丝放线菌（atcc31280）基因组中的安丝菌素生物合成pks基因ansa9上游插入组成型强启动子-红霉素抗性基因启动子，使安丝菌素生物合成途径中的限速步骤基因加倍，增强聚酮合酶的表达水平，从而提高安丝菌素的产量。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株，其技术要点是：基因ansa9起始密码子前插入红霉素抗性基因启动子。

进一步的，出发菌株为atcc31280。

另一方面，本发明提供了本发明提供了该增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株的制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：

步骤1），设计并扩增用于同源重组的同源左臂右臂，以及用于加强基因表达的组成型强启动子perme*；

步骤2），设计并构建用于通过同源重组在ansa9起始密码子前插入红霉素抗性基因启动子的质粒；

步骤3），将上述构建得到的质粒通过接合转移导入受体菌珍贵束丝放线菌atcc31280中进行同源重组；

步骤4），通过抗性筛选和pcr验证获得过量表达ansa9基因的突变株。

进一步的，质粒由pjtu1278的saci/hindiii位点插入左右同源臂，并利用xbai/bglii酶切位点插入启动子序列。

进一步的，启动子为红霉素抗性基因启动子。更进一步的，启动子的序列为：

gcttgggctgcaggtcgactctagtatgcatgcgagtgtccgttcgagtggcggcttgcgcccgatgctagtcgcggttgatcggcgatcgcaggtgcacgcggtcgatcttgacggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatgctgttgtgggcacaatcgtgccggttggtaggatccacatatgttgggga。

进一步的，用于通过同源重组插入启动子的同源臂左臂序列为：

gcggacagcagcagcggcagcgcgcccgccggacgccgctcccccggcccggtcggcgcgtcgccctcctccacgaccaggtgcgcgttggtcccgctcatgccgaacgcggacaccgccgcgcgccgggaccgctccccgcgcggccacggcgcgggctcggtcagcacccgcagcgcgccggagccccagtcgacctcgggggtgagccggtcggcgtgcagggtgcgcggcgccacgccgtggcgcagcgcctgcacgaccttgaccagccccagcaccccggccgcgccctgggcgtgcccgatgttggacttgagcgagccgagcagcagcggcctgccccctggcctggcgcgcccgtaggtggcctggagcgccgccgcctcgatcgggtcgccgaggcgggtgccggtgccgtgcgcctccagcaggtccacgtcggacggccgcagccccgcgtcctccagcgccgcctcgatgacgcgctgctgcgcggccccgttcggcgcggtcagcccgttggacgcgccgtcggagttgaccgcgctgccccggaccaccgccagcaccggccgcccggcgcggcgcgcgtccgagagccgctccagcagcaccacgccgacgccctcgccccacgccgtgccgtcggcgtcggcggagaacgccttgcagcggccgtccggggacagtccgcgctgccgggcgaactcgacgaacacgtccgacaggggcatgaccgtcgcgccgcccgccagcgccatcgcgcactcgccgcgccgcagcgactgcgcggccaggtggatcgcgaccagcgacgacgagcaggcggtgtccacggtgagcgcgggcccgtgcaggccgagcgcgtaggcgacccggccggaggcgacgctgccggagctgccgatggccaggtggccctcgaactcctcggcgacgcgccgccggttgccgtagttctggtagaccacgccggagaagacgccggtgccggtgccgcgcagcgacagcgggtcgatgcccgcgcgctcgaccgcctcccaggaggtctccaggagcatccggtgctgcgggtcgatcgtgacggcctcgcgcgggccgatgccgaagaacccggcgtcgaactcggcggcgtcgtgcaggaacccgccctcgcgggtgtagcaggtgcccggccgggtcgggtcggggtcgtagagcccggccaggtcccagccgcggtcggtggggaacccggtgatcgcgtcgacgccgccgtccaccagttcccacagcgcttccggggtgcggacgccgccgggggcgcggcaggccaggccggtgatcgcgatcggctcgtggcccgccgactccaggtcggcgagcttgcgccgcgtctcgtgcaggtcggcggtgacccaccggaggtagtcgaccagcttctcgtgggtcccgtcggtcat；

同源臂右臂序列为：

gggtgcgcgcgtctccaaggctcgggcggggcaggcggggcaggcggggtcgtcgggcagcggttcgtcaggcggcgggtcggcgggcggtgggtcgtcaggcggcgggtcgtcgggcggcgggtcggcgggtgggtgggcagcaggtgggtgggcagcaggtgggtgggcagcaggtgggtgggcagcaggtgggtgggcagcgggtggtcaggcgggggtggtcaggtcggcgtgcagggtggtgggcaggtcggtgcggtgggtgacgcgcagcttgcggaacaccctggtcaggtgctgctcgacggtgctcggggtgacgaacagcttctcggcgatctgccggttggtgaggccggtgacggccagcgcggcgaccttgcgctcggagccggtgaggccgctggtgtcgtgcgcgacggggtcggccgcgtccggttccaggcgcgcgcacagcggtcgcgcgccgcacgccctggccaggtgccaggccctgcgcagcacggcgcgggcgcggcggtggtcgccgagggcgtggtgcgccgcgccgaggcaggcgagggtggcggccagctcgtagcggtcgccgcagcgctccagcgcgtcggcggcctcggcgagcaggtgcgggcggcgggtcggcgggctgagcggggcgagcgcgcgcagcgccagcgccctggggcggcccgcgtcggcgccggtcgtggcgagctggtcgaacaccagccgccgggctcggtcgtggttgcccaggcgggtccacgcctcggcggccccggtgcgccacggcgcgaggcccggcaggtcgaggccccaggagcgcaggaggtcgccgcacgccaggaagtcggcgagcgccgcgtggtcccgcccggacgcgaggtggtggtggccgcgcgcgtgcaggtagtgcggggcggcggggccgtcgaagagggcgtccggcacgggcgcggtgacgtgccgcccggcctcccgccgccgcccgcgcagggtgtcggcgaggatcagcgagcccagcggcagcccgacgcccgcgccccagccgtgcgcggggacggcgtcgagcgcggcgcgggcgtgcccggctgcgcccgcgaggtcgccgagccgcagcgcgatcaccgaggcggcggcggcgaaggaggcgacccaggtgggcgcgcgccgggagcgcgcctcgtcgagcagccgcgcgcaggcccggtcggcctcgacggcgcggtcggcgcgcaccagggcgagcagcgcgagcagcgcgggttcctcggaccagggggaggtgtggctgagctgggcgtggcgcaggtagtgcgcggcctcggcggcggctcggcgctggtccccgaggacgaacccgccgaccaggctggcggcctcgcgcaaccacgggtcgacgcggctcgagggcggggtggtggggttgagggccgcggggtgggggtgccgcgctggtgggcagcggtgcgagaagcggaggtgtgcggggcgtt。

此外，本发明还提供了一种采用上述突变株制备安丝菌素的方法，其技术要点是，包括以下步骤：将活化后的ansa9基因过量表达突变株的菌丝体在一级种子培养基中，30℃、220r/min条件下培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220r/min的转速下培养24h；按10%的接种量转接至发酵培养基中，发酵7d后收集发酵液并进行萃取。

进一步的，上述安丝菌素的制备方法中：

一级种子培养基包括tsb3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖5w/v%；

或者二级种子培养基包括tsb3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖2.5w/v%，异丁醇0.05v/v%，异丙醇0.05v/v%，淀粉1w/v%；

或者发酵培养基包括酵母提取物0.8w/v%，麦芽提取物1w/v%，蔗糖1.5w/v%，异丁醇0.5v/v%，异丙醇1.2v/v%，淀粉2.5w/v%，mgcl22mmol/l。

本发明具有以下效果：现有技术中，通常采用菌株为a.pretiosumatcc31565，并通过培养条件优化策略以提高ap-3产量。而本专利中所用菌株为atcc31280，主要通过pks基因过量表达的遗传改造手段来提高ap-3产量，其增产效果明显大于现有技术。

综上所述，为方便插入红霉素抗性基因启动子序列，在右臂序列5’端引入bglii/xbai的酶切位点。本发明通过同源双交换，将红霉素抗性基因启动子插入到基因组的ansa9基因上游，利用强启动子加强ansa9的表达水平，进而提高安丝菌素生物合成中聚酮链延伸途径效率，使安丝菌素在发酵中的产量得到明显的提高，为安丝菌素工业化规模的扩大和生产成本的降低提供有效的参考。

附图说明

图1为红霉素抗性基因启动子过表达ansa9突变株构建示意图；

图2为过表达突变株中ansa9转录水平示意图；

图3为ansa9基因加倍突变株与野生型菌株安丝菌素发酵产量示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。虽然以下给出了本发明优化的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例1

本实施例为制备基因ansa9过量表达的突变株的具体过程。具体包括以下步骤：

步骤1），构建质粒plq593：以质粒pib139为dna模板，使用引物erme-f/r通过pcr扩增得到红霉素抗性基因启动子片段（216bp），在启动子序列两端引入xbai/bglii酶切位点；以珍贵束丝放线菌atcc31280基因组dna为模板，分别使用两组引物ansa9-l-f/r和ansa9-r-f/r通过pcr扩增得到ansa9起始密码子上下游的两段序列作为启动子插入的同源臂，其中，左臂（1445bp）5’端和3’端分别引入saci和bglii酶切位点，右臂（1499bp）5’端和3’端分别引入bglii/xbai和hindiii酶切位点，通过基因测序确认序列的正确性。在质粒pjtu1278的saci/hindiii的位点插入左臂（saci/bglii）和右臂（bglii/hindiii），得到的质粒用xbai/bglii进行酶切后，与红霉素抗性基因启动子片段（xbai/bglii）进行连接，得到质粒plq593。

*步骤1）中基因片段制备所采用的pcr体系及条件：

pcr反应体系：dna模板30ng，引物30pmol，50%dmso3ml，25mmmg²⁺2ml，缓冲液3ml，kod聚合酶1个单位，加纯水补齐至30ml；

pcr条件：95℃5min；95℃30s；60℃30s；68℃2min；循环30次；68℃10min。

*本发明涉及的各内切酶识别位点（酶切位点）如下：

*步骤1）中所用到的引物序列为：

步骤2），将用于同源交换的质粒plq593导入野生型菌株atcc31280，并通过pcr筛选得到红霉素抗性基因启动子插入的突变株，突变株表征了限速酶表达基因ansa9的加倍。

具体步骤如下：将已构建完成用于启动子插入的质粒plq593转化进入宿主et12567（含有puz8002质粒）中。取et12567于含有amp、kan和chl三种抗生素的lb中于37°c过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10%的比例转接一次并培养2.5h，然后用新鲜的lb溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。于此同时制备野生型菌株atcc31280的新鲜菌丝体（约16h培养物），用lb溶液漂洗2~3次之后，将其与之前制备的宿主菌et12567混合(菌丝体细胞和宿主菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mm镁离子的ymg平板，待平板吹干后转移至37°c培养箱倒置培养12h后取出平板，分别取硫链丝菌素和萘啶酮酸两种抗生素的储存液30ml和40ml加入1.5ml无菌水中混匀后覆盖在ymg平板上，将平板晾干后转移至30°c培养箱中培养。一般3~5d后可见平板上有单菌落接合子长出，将其通过平板涂布于含有硫链丝菌素和萘啶酮酸两种抗生素的ymg平板扩大培养（此时生长的一般为单交换接合子），将平板扩大培养的接合子挑取少量至无抗的tsby溶液进行两轮松弛，采用ansa9-yz-f/r为引物，通过菌丝体pcr验证接合子。

pcr若只有一条带（448bp），为回复成野生型的菌株；若含有664bp的一条条带，则为双交换突变株；若含有448bp和664bp两条带，则为单交换突变株。其中，双交换突变株即为ansa9基因加倍的突变株。

*步骤2）中所用到的引物序列为：

*步骤2）中基因片段制备所采用的pcr体系及条件：

pcr体系：dna模板10~100ng，引物30pmol，50%dmso3ml，缓冲液3ml，taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至30ml；

pcr条件：95℃5min；95℃30s；58℃30s；72℃1min；循环30次；72℃10min。

实施例2

本实施例为通过基因ansa9过量表达的突变株生物合成安丝菌素的发酵过程。具体步骤如下：将过量表达的菌株涂布于固体ymg培养基活化，30℃培养2d后，挑取少量菌丝体接种至一级种子培养基，30℃、220r/min培养24h后按4%接种量转接于二级种子培养基，30℃/220r/min培养24h后按10%接种量转接于发酵培养基，7d后收集发酵液进行萃取和化合物检测。

表1种子培养基及发酵培养基的成分构成

实施例3

本实施例为通过荧光定量pcr测定基因加倍菌株中加倍基因转录水平的方法。用于rna提取的样品一般都保存在redzol溶液中。rna提取过程要求低温，离心过程除特殊说明，均在4°c、12000r/min的条件下进行。

具体步骤为：取已经破碎处理的样品500ml加入100ml氯仿涡旋振荡混匀，离心15min后吸取上清液，加入100ml无水乙醇并混匀后将样品吸入离心柱(北京赛百盛基因技术有限公司)中，静置2min，离心1min，弃液体，用漂洗液（washingbuffer，北京赛百盛基因技术有限公司）漂洗两次，弃液体，将离心柱置于收集管中继续离心2min。换用新的收集管，往离心柱中加入60mldepc处理过的水，离心2min，将rna样品从离心柱上洗脱下来。用nanodrop2000型核酸蛋白分析仪测定rna的浓度和od260/280，提取后的rna样品-80°c保存。rna样品的消化反应体系可参照下表配制：

反应体系置于37°c孵育4h后每个反应体系加入5ml50mmedta后65°c加热10min即可终止消化，消化好的rna样品-80°c保存。rna经过逆转录后就得到cdna，可用于后续的基因转录分析。

得到的cdna利用荧光定量pcr进行检测，所用试剂盒是fermentas公司的maximasybrgreen/roxqpcrmaxtermix(2×)

测定基因转录水平时使用的引物：

图2为基因加倍突变株与野生型菌株对照的加倍基因荧光定量pcr结果。结果表明突变株和野生型对照相比，目的基因在加倍突变株中的转录水平对比对照提高大约60倍，说明ansa9基因已经被成功加倍。

实施例4

本实施例为利用hplc检测安丝菌素的发酵产量的方法。具体为：使用安捷伦公司的agilent1200系列hplc进行色谱分析，采用dad二极管阵列检测器测定236nm下的色谱吸收峰。

其中，hplc参数如下：

色谱柱：agilentzorbaxsb-c18，2.1´150mm，3.5µm；

流动相流速：0.1ml/min；

流动相：水溶液和hplc级甲醇梯度洗脱。

柱温：室温。

图3为基因加倍突变株和野生型菌株atcc31280安丝菌素发酵水平检测。结果表明突变株的产量对比野生型菌株提高125%以上，实验室摇瓶发酵安丝菌素终产量达到99mg/l。

本发明所涉及的质粒pjtu11278已经在sci数据库文献《hey,wangz,bail,liangj,zhoux,dengz:twophz1358derivativevectorsforefficientgeneknockoutinstreptomyces.j.microbiolbiotechnol2010,jan;20(4):678-682.》中公开。

序列表

<110>辽宁斯韦尔生物科技有限公司

上海交通大学

<120>增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法

<130>17-0838

<141>2017-09-25

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4794

<212>dna

<213>珍贵束丝放线菌ansa9(actinosynnemapretiosum)

<400>1

atgaccgacgggacccacgagaagctggtcgactacctccggtgggtcaccgccgacctg60

cacgagacgcggcgcaagctcgccgacctggagtcggcgggccacgagccgatcgcgatc120

accggcctggcctgccgcgcccccggcggcgtccgcaccccggaagcgctgtgggaactg180

gtggacggcggcgtcgacgcgatcaccgggttccccaccgaccgcggctgggacctggcc240

gggctctacgaccccgacccgacccggccgggcacctgctacacccgcgagggcgggttc300

ctgcacgacgccgccgagttcgacgccgggttcttcggcatcggcccgcgcgaggccgtc360

acgatcgacccgcagcaccggatgctcctggagacctcctgggaggcggtcgagcgcgcg420

ggcatcgacccgctgtcgctgcgcggcaccggcaccggcgtcttctccggcgtggtctac480

cagaactacggcaaccggcggcgcgtcgccgaggagttcgagggccacctggccatcggc540

agctccggcagcgtcgcctccggccgggtcgcctacgcgctcggcctgcacgggcccgcg600

ctcaccgtggacaccgcctgctcgtcgtcgctggtcgcgatccacctggccgcgcagtcg660

ctgcggcgcggcgagtgcgcgatggcgctggcgggcggcgcgacggtcatgcccctgtcg720

gacgtgttcgtcgagttcgcccggcagcgcggactgtccccggacggccgctgcaaggcg780

ttctccgccgacgccgacggcacggcgtggggcgagggcgtcggcgtggtgctgctggag840

cggctctcggacgcgcgccgcgccgggcggccggtgctggcggtggtccggggcagcgcg900

gtcaactccgacggcgcgtccaacgggctgaccgcgccgaacggggccgcgcagcagcgc960

gtcatcgaggcggcgctggaggacgcggggctgcggccgtccgacgtggacctgctggag1020

gcgcacggcaccggcacccgcctcggcgacccgatcgaggcggcggcgctccaggccacc1080

tacgggcgcgccaggccagggggcaggccgctgctgctcggctcgctcaagtccaacatc1140

gggcacgcccagggcgcggccggggtgctggggctggtcaaggtcgtgcaggcgctgcgc1200

cacggcgtggcgccgcgcaccctgcacgccgaccggctcacccccgaggtcgactggggc1260

tccggcgcgctgcgggtgctgaccgagcccgcgccgtggccgcgcggggagcggtcccgg1320

cgcgcggcggtgtccgcgttcggcatgagcgggaccaacgcgcacctggtcgtggaggag1380

ggcgacgcgccgaccgggccgggggagcggcgtccggcgggcgcgctgccgctgctgctg1440

tccgcgcgcgggggcgcggcgctgcgcgcggcggcggccgacctggtcgagctgccgggg1500

gagccggtggacgtgtgctggtcgctgctcaccggccgcgcccggctggtcgaccgcgcc1560

gtggtggtcgccgccgaccgggccgggttcaccgccgggctccaggcgctggccgccgac1620

cagccctcggccgccgcggtgaccggccgggcggacgtgtcgggccgcacggtgctcgtg1680

ttccccggacagggcggccagtgggtgggcatgggggcccggctgctggacgagtcgccg1740

gtgttcgcggcggccgtggcgcgctgcgcggcggccgtggagcggctggtggacttccgg1800

gtggtggacgtgctgcgcggcggcgacctcggccgggtggacgtggtgcagccggtgtcg1860

ttcgtggtgatggtggcgctggccgacctgtggcgctcgttcggcgtggccccggacgtc1920

gtcgtgggccactcgcagggcgagatcgcggcggcctgcgtggccggggcgctctcgctg1980

gaggacgcggcgcgggtggtcgtgctgcgcagccgggccatcgccgtcggggtgggcggt2040

gcccggctggagggcggcggcatggcgtcgatcccgctgccgcgcgcggaggtcgaggag2100

ctcatcaccggcacgggggtgtccgtggcggcggtcaacggccccggttcggtggtcgtc2160

tccggcgacgtcgacccgctcgtggcgcgggtggagggcgcgcgcaggctgccggtggac2220

tacgcctcgcactcgcccgccgtggacgtgctgcgcgggcgcctgctggccgacctcgcc2280

ccgatcacgccccgacccgcgacggtcccgatgctgtccaccgtcacgggcaagtggctg2340

gacggcgcggagctggacgcggactactggttcgccaacctgcgcgagcccgtccgcttc2400

gccgacgcggtcaccgagctcgccggggcggactgcgcggtgttcgtggaggtcggggcg2460

cacccggtgctcaccgccgcgatccaggacgtcctgggcgagcggaccgccgtcgtcacc2520

ggcacgctgcgccgcgacgacggcggcctcgaccggttcctgcgctccgccgccgcgctg2580

cacgtgcgcggcgtgcccgtcgactgggccccggtcttcgacggcttggacgcccaccgc2640

gccgacctgcccacctacccgttccagcgcgcccaccactggctccaggaggccgaaccc2700

gccgccaccccggcgggcggcgacgacccgctgtgggcggcggcgcgcgacgccgacggc2760

ctgtgcgccgagctggagctcaccgagcccgaccagcgcgccgcgctgcgcgccgtcctg2820

cccgcgctgaccgcctggcacgagcgcaggagcgagcgggccctgctcgactcctggcgc2880

taccggatcacctggcgcaccctgcccgagccgcccgaggccgacccgcgcggcgactgg2940

ctcgtcgtcgggccgcaccccgacctgctgcccgacctgctgcccggcgtcgcgctcgac3000

cccgaccgcgccgcactcgccgaccgcgccgcactcgccgacctgctccgcccgcacgcc3060

gccgtcgcgggcgtcctggccacgccgggcgccgacgtgctcgccctggtccaggcgctc3120

ggcgacgcgggcgtcaccgcgccgctgtggtgcgccaccaccggggccgtcgcgatctcc3180

ccgcacgacggcccgccggaccccgcccaggccgccacctggggcctgggccgggtcgtc3240

gcgctggagcaccccggccgctggggcgggctggtcgacctcgccgaccccgccgacccg3300

cgccagcgccgcaggctcgccgccgtcctcgccggacccggcgtcgacgacggcggcgag3360

gaccaggtcgccatccgcgcggagggcgtgttcgcgcgcaggctcgtgcgcgccgaaccg3420

caggccccggccgccccgtggaccccgcgcggcacggtcctggtcaccggcggcaccggc3480

ggcgtcgccgcgcacgtggcccgccgcctcgccgccctcggcgccgaccacctcgtcctc3540

accagccgccggggcccgagcgcccccggcgcgcccgcgctcgccgccgacctggaggcg3600

ctgggctcccgcgtcaccaccgccgcctgcgacgtcgccgaccgcgccgcgctcgccgcc3660

ctgctggccgacctggaacgcgcgggcgaccagatcaccgccgtcgtgcacgcggcgggc3720

gccaacgcccagacccccgtcgccgacaccacccccgaggagctcgcgcgcgtccaggcc3780

gccaaggcgctcggcgccgagcacctggacgagctgctgggcgggcgcccgctcgacgcg3840

ttcgtcctgttctcctccaacgcgggcgtgtggggcagcggcggccagtgcgcctacgcc3900

gccgccaacgcccgcctcgacgccctcgcccagcgccgccgcgcgcacggccgcgtcgcc3960

acctccgtcgcctggggcgcctgggacggcggcggcatgtccagcgccaccccggacatc4020

gccgcccagctcgcccaggcgggcctgcgcctgatgcccccggacctggcggtgtccgcg4080

ctgctcgacgccgtcgcccgcgacgagaccaccaccgtcgtcaccgacgtgcgctgggag4140

gcgttcgccgcccggttcaccgccctgcgccgcagccccctgctcgccgacctgcccgag4200

gcccgccctgaaccggtcgccgccgccgacgagcccgaccgggggctcgcgggcgagctg4260

gccgcgctgcccgcgcccgagcggctgcgcaggctcaccgacctggtgcgcgcgcacgcc4320

gccgccgcgctcggccacccagggcccgagtcggtgcccgccgacgtggccttccgcgac4380

ctgggtgtggactcgctggccgccgtcgagctgcgcaaccgcgcctcggccgcgaccggc4440

gcgaggctcacgcccaccgccgtcttcgaccaccccaccccgcgcgcgctcgccgcgcac4500

ctggccgagcacctcgccgccaccaaggacagcggggccccggacgcggccccggacatc4560

caggaccccacggccgcgctgcgcggcctggacgccctcgccgccgccctgcccgccgcc4620

gcgggcgacgacgcgctgcgcgagcgggtcaccgcgcgcctgcgcgaggtgctgggccgc4680

tgggacgagctgaccggcgaccccggcggacccgacgggttcgacctcgaccacatcagc4740

gacgacgagctgttccgcctggccgacagcaggctcggcccgaccggcgcctga4794

<210>2

<211>224

<212>dna

<213>启动子(红霉素抗性基因)

<400>2

gcttgggctgcaggtcgactctagtatgcatgcgagtgtccgttcgagtggcggcttgcg60

cccgatgctagtcgcggttgatcggcgatcgcaggtgcacgcggtcgatcttgacggctg120

gcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatgctgttg180

tgggcacaatcgtgccggttggtaggatccacatatgttgggga224

<210>3

<211>1445

<212>dna

<213>启动子(同源左臂)

<400>3

gcggacagcagcagcggcagcgcgcccgccggacgccgctcccccggcccggtcggcgcg60

tcgccctcctccacgaccaggtgcgcgttggtcccgctcatgccgaacgcggacaccgcc120

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ccgtggcgcagcgcctgcacgaccttgaccagccccagcaccccggccgcgccctgggcg300

tgcccgatgttggacttgagcgagccgagcagcagcggcctgccccctggcctggcgcgc360

ccgtaggtggcctggagcgccgccgcctcgatcgggtcgccgaggcgggtgccggtgccg420

tgcgcctccagcaggtccacgtcggacggccgcagccccgcgtcctccagcgccgcctcg480

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cgcagcgactgcgcggccaggtggatcgcgaccagcgacgacgagcaggcggtgtccacg840

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<210>4

<211>1499

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<213>启动子(同源右臂)

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cgggtcggcgggtgggtgggcagcaggtgggtgggcagcaggtgggtgggcagcaggtgg180

gtgggcagcaggtgggtgggcagcgggtggtcaggcgggggtggtcaggtcggcgtgcag240

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ggtgacggccagcgcggcgaccttgcgctcggagccggtgaggccgctggtgtcgtgcgc420

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gtgcgccgcgccgaggcaggcgagggtggcggccagctcgtagcggtcgccgcagcgctc600

cagcgcgtcggcggcctcggcgagcaggtgcgggcggcgggtcggcgggctgagcggggc660

gagcgcgcgcagcgccagcgccctggggcggcccgcgtcggcgccggtcgtggcgagctg720

gtcgaacaccagccgccgggctcggtcgtggttgcccaggcgggtccacgcctcggcggc780

cccggtgcgccacggcgcgaggcccggcaggtcgaggccccaggagcgcaggaggtcgcc840

gcacgccaggaagtcggcgagcgccgcgtggtcccgcccggacgcgaggtggtggtggcc900

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ggtgacgtgccgcccggcctcccgccgccgcccgcgcagggtgtcggcgaggatcagcga1020

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cgcgcaggcccggtcggcctcgacggcgcggtcggcgcgcaccagggcgagcagcgcgag1260

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<213>引物(ansa9-l-f)

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<213>引物(ansa9-l-r)

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<213>引物(ansa9-r-f)

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<213>引物(ansa9-r-r)

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<213>引物(erme-f)

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<213>引物(erme-r)

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<213>引物(ansa9-yz-f)

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<213>引物(ansa9-yz-r)

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<210>13

<211>20

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<213>引物(ansa9-rt-f)

<400>13

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<210>14

<211>20

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<213>引物(ansa9-rt-r)

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<213>引物(hrdb-rt-f)

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<213>引物(hrdb-rt-r)

<400>16

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