一种牙鲆弹状病毒PCR检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种牙鲆弹状病毒pcr检测引物及包括该检测引物的检测方法与试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

牙鲆弹状病毒(hiramerhabdovirus,hirrv)于1984年首次在日本兵库县濒死的养殖牙鲆和香鱼中分离得到。随后又分别于1997在韩国南部海域的养殖牙鲆，2008年在中国山东养殖的石鲽鱼，2013年在波兰养殖的淡水鱼河鳟中分离得到hirrv的韩国株(ca-9703)、中国株(sr080113)和欧洲株(j.no.207237)。hirrv分别于2013年在韩国西部海域，2015年在韩国南部海域引起养殖的中国花鲈和黑鲷大规模死亡。流行区域已经由东南亚逐渐扩大到欧洲，易感宿主也由海水鱼过渡到淡水鱼，流行区域和易感种群均有逐年扩大的趋势，严重阻碍了全球水产养殖业特别是海水养殖业的健康发展，造成了巨大的经济损失。人工感染试验结果表明，牙鲆14天累积死亡率为97.8%，花鲈7天累积死亡率高达100%。而且2005年签订的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中明确规定需要对进出口的鲈鱼、真鲷、牙鲆、大菱鲆、鲤鱼和鲫鱼等要进行hirrv的检测。

虽然已经有hirrvdna疫苗和亚单位疫苗具有免疫保护效果的报道，但迄今为止并没有商品化的相关疫苗投放市场。因此目前控制hirrv的唯一方法仍旧是及早发现并采取措施。因此建立hirrv的快速检测方法是非常必要的，目前针对hirrv的检测方法主要有细胞生物学、组织病理学和分子生物学等。综合比较以上三种技术pcr检测技术具有特异型好，操作简便，检测成本低廉等特点，适用于规模化养殖场hirrv病毒的快速检测与研究。核蛋白(n)是hirrv中含量最高的蛋白，具有保守性高、免疫原性强等特点，同时也与hirrv的转录、翻译、复制、抑制宿主细胞基因转录和凋亡有关。本文综合以上几点考虑，选取n蛋白保守序列为目的基因设计特异性引物，建立能特异性检测hirrv的pcr检测技术，以期为口岸安全和水产养殖业中hirrv病的防治提供帮助。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种牙鲆弹状病毒pcr检测引物，能够快速、准确地检测鱼类是否患有牙鲆弹状病毒病。

本发明的第二个目的是提供利用上述引物来检测鉴定牙鲆弹状病毒的方法。

本发明的第三个目的是提供一种检测鉴定牙鲆弹状病毒的试剂盒。

本发明的上述目的可通过采取如下技术方案达到：1、选取含量最为丰富的核蛋白基因为检测目的基因。2、比对不同亚型的hirrv基因组，选取核蛋白基因保守序列为检测目的基因。

上下游引物的核苷酸序列为：

hirrv-n-639-f：5’-atgaggctgagcggaacc-3’(seqidno.1)

hirrv-n-1020-r：5’-ctttttgaccagaaggcgag-3’(seqidno.2)

作为优选，应用pcr检测引物组进行扩增的条件为：

采用20μl的反应体系，包括：pcr-mix10μl；ddh2o7μl；浓度10pmol/μl的上、下游引物各1μl；cdna1μl；

设置如下条件进行反应：预变性95℃，4min；再经95℃变性45s，57℃退火35s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

阳性对照：hirrv病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以hirrv病毒cdna为模板，以hirrv-n引物进行pcr扩增，得到381bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pmd-19t载体，即得pmd-19t-n阳性质粒。

阴性对照：pmd-19t空质粒。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明hirrv病毒pcr检测引物，能够快速、准确地检测鱼类是否患有hirrv病毒病；

2、本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速地对规模化养殖场进行hirrv病毒检测，大大降低了检测hirrv的时间及成本。

附图说明

图1为rt-pcr产物电泳图，图中m：marker；lane1：阳性质粒；lane2-3：感染hirrv的epc细胞悬液。

lane4:pmd-19t空质粒；lane5-6：正常的epc细胞悬液。；

图2为pcr检测体系灵敏检测电泳图，图中m：marker;lane1：100ng/μl；lane2：50ng/μl；lane3：25ng/μl；lane4：12.5ng/μl；lane5：6.25ng/μl；lane6：3.13ng/μl；lane7：1.57ng/μl；lane8：0.78ng/μl；lane9：0.39ng/μl。

图3为实例检测电泳图，图中m：marker；lane1-10：感染鱼脾脏；lane11：健康鱼脾脏。

具体实施方式

1、pcr引物的设计

hirrv病毒rna基因组的两端为非编码区，中间部分为编码区，编码区有5个结构基因，本发明针对hirrv病毒n基因序列设计引物。经过多轮筛选，发现以下引物能够快速、准确地对hirrv病毒进行鉴别检测。

本发明提供的检测hirrv病毒的pcr引物序列如下：

hirrv-n-639-f:5’-atgaggctgagcggaacc-3’(seqidno.1)

hirrv-n-1020-r:5’-ctttttgaccagaaggcgag-3’(seqidno.2)

2、阳性对照质粒的制备及阴性对照

pmd-19t-n阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以hirrv病毒cdna为模板，以hirrv-n-639-f和hirrv-n-1020-r为引物进行pcr扩增，得到381bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pmd-19t载体，即得。

阴性对照为：pmd-19t空载体质粒。

3、hirrv病毒rna的提取

（1）组织总rna的抽提

分别取200μl病毒悬液和正常的epc细胞悬液至1.5mlep微量离心管中，每管分别加入0.8mltrizol，混匀后室温放置5min；每管加入200μl氯仿，剧烈振荡30s，室温放置15min；4℃，12000r/min离心15min；然后将上层水相移到新的灭菌ep微量离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃放置10min以上，4℃12000r/min离心10min；弃上清液，沉淀加入1.0ml预冷的75%乙醇洗涤一次，12000r/min离心10min；小心弃去上清液、风干沉淀，加入适量体积depc处理水溶解rna，直接用于反转录或-20℃冻存备用。

（2）rna的反转录成cdna

在20μl的反应体系中加入模板rna1μg；5×amvbuffer4μl；浓度2.5mmol/l的dntp4μl；浓度200u/μl的amv1μl；浓度25mmol/l的oligo(dt)181μl，用depc水补至20μl；37℃水浴1h，95℃水浴5min灭活，-20℃冻存备用。

4、pcr扩增方法的建立

（1）pcr反应体系

以步骤3得到的cdna为模板进行pcr扩增，20μl的反应体系包括：pcr-mix(购于takara公司)10μl；ddh2o7μl；从步骤1得到的浓度10pmol/μl的上、下游引物各1μl；cdna1μl。对照分别用步骤2得到的hirrv病毒阳性对照质粒(浓度为100ng/μl)和pmd-19t空质粒(浓度为100ng/μl)，取样分别为1μl。

（2）pcr反应条件

将装有反应体系的pcr管放入pcr仪后，设置如下条件进行反应：预变性95℃，4min；再经95℃变性45s，57℃退火35s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物琼脂糖电泳图(图1)381bp处有阳性条带且阴性对照无条带，表明该pcr引物对hirrv呈阳性反应。

5、pcr检测体系的灵敏度评价

利用不同浓度的阳性质粒对hirrv病毒n蛋白引物做灵敏性检测，将浓度为100ng/μl的pmd-19t-n阳性对照质粒按倍比稀释8次，浓度分别为50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl、6.25ng/μl、3.13ng/μl、1.57ng/μl、0.78ng/μl和0.39ng/μl。分别通过步骤4的条件进行检测，灵敏性检测电泳图分别如图2所示，结果显示浓度为0.78ng/μl以上的样本均有明显的目的条带，因此，本引物的最低检测浓度是0.78ng/μl，表明应用本发明引物建立的检测hirrv病毒pcr反应具有较高的灵敏度。

6、检测实例

人工感染牙鲆然后进行病原检测，分别取10尾感染鱼和3尾健康鱼的脾脏待检组织样品，提取cdna，按照步骤4的方法进行检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得扩增条带。若样品扩增条带出现381bp的片段，则样品含有hirrv；若扩增条带没有相应片段，则为阴性。

所以从图3可以判断10尾攻毒鱼均被hirrv感染，体内含有大量hirrv病毒粒子，而健康鱼未在381bp处出现目的条带。将扩增产物纯化后送公司测序，测序结果在genbank数据库中进行blast，测序结果与数据库中hirrv核蛋白基因吻合度超过99%,表明扩增产物是hirrv核蛋白基因。说明本发明所述pcr检测引物可快速、方便、高效地鉴定并诊断hirrv，且特异性好，灵敏度高，具有较大的应用前景。

表1引物列表

pcr产物测序结果(seqidno.3)

atgaggctgagcggaaccggaatgaccatggtgggtctattcaatcaggcctctaagaaccttggagctccacctgcagatctgctggaagatctctgcatgaagtccatcatcgactctgccaggaggattgtcaagctgatgaggatcgttgcagacgtcgaggacatgaccgcaaagtatgccatcatgatgagcaggatgcttggggatgggtacttcaagtcctacgggatcaatgagaactcacggatcacctgtatcttgatgaacatcaacgagcagtacgatgaggggacaaccggaggactggcaggagtcagggtttcaccccccttccgaaagctggcaaccgagattgctcgccttctggtcaaaaag

本发明获得了一种牙鲆弹状病毒pcr检测引物，能够快速、准确地检测鱼类是否患有牙鲆弹状病毒病。

序列表

<110>信阳学院

<120>一种牙鲆弹状病毒pcr检测试剂盒及检测方法

<141>2017-10-29

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<212>dna

<213>牙鲆弹状病毒(hirrv)

<400>3

atgaggctgagcggaaccggaatgaccatggtgggtctattcaatcaggcctctaagaac60

cttggagctccacctgcagatctgctggaagatctctgcatgaagtccatcatcgactct120

gccaggaggattgtcaagctgatgaggatcgttgcagacgtcgaggacatgaccgcaaag180

tatgccatcatgatgagcaggatgcttggggatgggtacttcaagtcctacgggatcaat240

gagaactcacggatcacctgtatcttgatgaacatcaacgagcagtacgatgaggggaca300

accggaggactggcaggagtcagggtttcaccccccttccgaaagctggcaaccgagatt360

gctcgccttctggtcaaaaag381