本发明涉及一种ssdna核酸适配体及其筛选方法、检测方法和应用，特别是涉及一种能够识别并结合水产致病菌溶藻弧菌的ssdna核酸适配体及其筛选方法、检测方法与应用。
背景技术：
溶藻弧菌作为引起海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一，主要在广西等华南沿海地区暴发及流行，对当地的水产养殖行业造成巨大经济损失。且溶藻弧菌所引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广的特点，一旦出现鱼类病亡便难以进行快速有效的防治，对着华南地区水产养殖业的发展具有严重威胁。目前国际上对鱼类细菌性疾病的诊断主要采用传统观察法、免疫学检测方法、分子生物学技术等。但这些方法操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵、精确度不高等问题，缺少可以针对溶藻弧菌进行快速检测及诊断的方法和探针。
指数富集的配基系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichmenttechnology,selex)是一种生物文库筛选技术，该技术使用容量高达1014-1015的随机寡核苷酸文库，在体外经过多轮筛选最终获得能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸，即核酸适配体。核酸适配体具有易筛选获得、成本低、易修饰、稳定性强、高特异性识别并结合靶物质等诸多优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测水产致病菌溶藻弧菌的ssdna核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对溶藻弧菌进行准确检测和诊断的问题。
本发明的目地在于提供一种能够识别并结合溶藻弧菌的ssdna核酸适配体，所述ssdna核酸适配体的核苷酸序列为5’-attttgcttttgccacttatcaacatttgtttttccgctttcgcacttc-3’(seqidno：1)的ssdna核酸适配体。
进一步地，所述ssdna核酸适配体的核苷酸序列为5’-gacgcttactcaggtgtgactcg-attttgcttttgccacttatcaacatttgtttttccgctttcgcacttc-cgaaggacgcagatgaagtctc-3’(seqidno：2)的ssdna核酸适配体。
更进一步地，所述ssdna核酸适配体的核苷酸序列上任一位置能进行磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化反应。
更进一步地，所述ssdna核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。
更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。
更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、双(2,2`-联吡啶)(4,4`-二羧基-2,2`-联吡啶)钌配体中的一种或多种。
本发明的另一目在于提供一种上述ssdna核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1：合成以下序列所示的单链dna文库和引物：
随机文库library50：
5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc-3’；
fitc标记的5’引物：5’-fitc-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
biotin标记的5’引物：5’-biotin-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
tamra标记的5’引物：5’-tamra-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于300-500μlpbs中，在70-92℃下恒温水浴5-15min，然后迅速进行冰浴，冰浴5-20min，取处理后的随机文库与溶藻弧菌活菌在冰上孵育0.5-2h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10ml的pbs洗涤溶藻弧菌活菌，并在92℃下恒温水浴5-30min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为特异性识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库；
步骤3：取100-200ul筛选得到的识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库进行pcr扩增，具体的扩增条程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过15-25轮循环，72℃5min；
步骤4：取100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中扩增所得的双链dna在常温下孵育15-30min，使用磁性分离器吸取磁珠并除去上清，用1-4mlpbs洗涤磁珠后，加入100-200μl的200mmnaoh溶液，常温反应5-20min，并利用磁性分离架回收磁珠，留取上清液；
步骤5：取步骤4所得上清液加入无菌水洗涤后除盐柱进行盐分分离，在重力作用下自然滴完，向收集到的液体中加入300-500μlpbs，得到含有dna单链文库的溶液；
步骤6：取步骤5中得到的dna单链文库代替步骤2中的随机文库，并重复步骤2-55-8次；
步骤7：取步骤6的dna文库于80-95℃恒温水浴中加热5-20min，然后迅速进行冰浴，冰浴5-20min，取处理后的dna单链文库的溶液与嗜水气单胞菌在冰上孵育0.5-2h；待孵育结合完成后，离心并收集上清液，将上清溶液与溶藻弧菌活菌在冰上孵育0.5-2h；待孵育结合完成后，离心移除上清，取10ml的pbs洗涤溶藻弧菌活菌，并在80-95℃下恒温水浴5-30min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为经过阴性筛选的高特异性识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库；
步骤8：取步骤7中所得上清溶液，依次按照步骤3、步骤4、步骤5、步骤7、步骤2、步骤3、步骤4和步骤5的实验操作顺序重复8次，最终所得溶液为ssdna核酸适配体。
进一步地，所述引物还包括biotin标记的3’引物：
5’-biotin-gagacttcatctgcgtccttcg-3’(seqidno：3)。
本发明的另一目在于提供一种上述ssdna核酸适配体的elisa检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：对ssdna核酸适配体进行生物素标记；
步骤2：取待测样品1-100mg与步骤1所得浓度为100-200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20-40min；待孵育结合后，清洗待测样品，并加入100-200μl由辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，在冰上再次进行孵育结合10-40min，孵育结合后用pbs溶液清洗待测样品，并加入辣根过氧化物酶显色试剂盒中进行tmb显色液显色，使用酶标仪读取待测样品在450nm处的吸光值并记录结果，根据吸光值的变化检测待测样品中是否含有水产致病菌溶藻弧菌。
本发明还有一目地在于提供一种应用上述ssdna核酸适配体在检测水产致病菌溶藻弧菌中的用途。
本发明相对于现有技术，通过selex技术筛选得到的ssdna核酸适配体，并利用多轮阴性筛选有效提高ssdna核酸适配体的特异性，与现有的蛋白抗体相比无免疫原性、制备周期短、重现性好、分子量小等优点，同时也具有着更高的亲和力和特异性，可以通过体外的化学方法合成进行大量生产，具有工业生产前景。此外使用本发明ssdna核酸适配体对溶藻弧菌进行elisa检测时，操作简单、快速，可应用于elisa试剂盒中。
附图说明
图1为本发明实施例2、对照例中ssdna核酸适配体的异硫氰酸荧光素拍摄图；
图2为本发明实施例2、对照例中ssdna核酸适配体的羧基四甲基罗丹明标记拍摄图；
图3为本发明实施例1、实施例2、对照例中ssdna核酸适配体的elisa检测吸光值对比图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
实施例1
ssdna核酸适配体的制备方法如下：
步骤1：合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物
随机文库library50：
5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc-3’；
5’引物(fitc标记)：5’-fitc-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
5’引物(biotin标记)：5’-biotin-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
5’引物(tamra标记)：5’-tamra-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
步骤2：将10nmol上述随机文库溶解于500μlpbs中，在92℃的恒温水浴下加热5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的随机文库与溶藻弧菌活菌在冰上孵育1h；孵育结合完成后，离心移除上清，用10ml的pbs洗涤溶藻弧菌活菌，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清液，即为特异性识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库；
步骤3：取100ul筛选得到的识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库进行pcr扩增，具体的扩增条程序是：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min；第一轮筛选后得到的上清液，要全部用于进行pcr扩增，得到扩增产物；
步骤4：将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中pcr扩增所得的双链dna在常温下孵育20min，利用双链dna上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链dna结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清液，用2mlpbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200μlnaoh溶液(200mm)，常温反应10min，利用磁性分离架回收得到上清液；除盐柱用10ml无菌水洗涤后，将上清液加入除盐柱，靠重力作用自然滴完；加入500μlpbs，收集到含有dna单链文库的溶液；
步骤5：将步骤4中得到的dna单链文库代替步骤2中的随机文库，重复步骤2-4所示的阳性筛选过程、pcr扩增及单链dna文库的制取过程8次；
步骤6：在第二轮及第二轮以后筛选中，用嗜水气单胞菌为对照，将步骤5后筛选得到的dna单链文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的dna文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与嗜水气单胞菌活菌在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液；然后将此上清液溶液与溶藻弧菌活菌进行冰浴结合；孵育结合完成后，离心移除上清液，用10ml的pbs洗涤溶藻弧菌活菌，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清液，收集到的上清液即为经过阴性筛选的高特异性识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库；
步骤7：将步骤6中收集到的上清液溶液，经过步骤3的pcr扩增和步骤4的单链dna文库制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用多功能酶标仪检测所得文库对溶藻弧菌识别能力的增强情况，直至8轮筛选后，文库对溶藻弧菌识别能力达到最强；将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到实施例1中可用于检测溶藻弧菌活菌的ssdna核酸适配体，其序列为5’-attttgcttttgccacttatcaacatttgtttttccgctttcgcacttc-3’(seqidno：1)。
实施例1ssdna核酸适配体的elisa检测方法如下：
步骤1：对实施例1ssdna核酸适配体进行生物素标记；
步骤2：取感染溶藻弧菌活菌的样品10mg与步骤1所得浓度为200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20min；待孵育结合后，清洗样品，并加入200μl由辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，在冰上再次进行孵育结合40min，孵育结合后用pbs溶液清洗样品，并加入辣根过氧化物酶显色试剂盒中进行tmb显色液显色，使用酶标仪读取样品在450nm处的吸光值并记录结果。如图3所示，no.1为本发明实施例1检测结果吸光值。
实施例2
实施例2ssdna核酸适配体的制备方法如下：
步骤1：合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物
随机文库library50：
5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc-3’；
5’引物(fitc标记)：5’-fitc-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
5’引物(biotin标记)：5’-biotin-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
5’引物(tamra标记)：5’-tamra-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
3’引物：5’-biotin-gagacttcatctgcgtccttcg-3’；
步骤2：将10nmol上述随机文库溶解于500μlpbs中，在92℃的恒温水浴下加热5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的随机文库与溶藻弧菌活菌在冰上孵育1h；孵育结合完成后，离心移除上清，用10ml的pbs洗涤溶藻弧菌活菌，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清液，即为特异性识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库；
步骤3：取100ul筛选得到的识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库进行pcr扩增，具体的扩增条程序是：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min；第一轮筛选后得到的上清液，要全部用于进行pcr扩增，得到扩增产物；
步骤4：将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中pcr扩增所得的双链dna在常温下孵育20min，利用双链dna上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链dna结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清液，用2mlpbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200μlnaoh溶液(200mm)，常温反应10min，利用磁性分离架回收得到上清液；除盐柱用10ml无菌水洗涤后，将上清液加入除盐柱，靠重力作用自然滴完；加入500μlpbs，收集到含有dna单链文库的溶液；
步骤5：将步骤4中得到的dna单链文库代替步骤2中的随机文库，重复步骤2-4所示的阳性筛选过程、pcr扩增及单链dna文库的制取过程8次；
步骤6：在第二轮及第二轮以后筛选中，用嗜水气单胞菌为对照，将步骤5后筛选得到的dna单链文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的dna文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与嗜水气单胞菌活菌在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液；然后将此上清液溶液与溶藻弧菌活菌进行冰浴结合；孵育结合完成后，离心移除上清液，用10ml的pbs洗涤溶藻弧菌活菌，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清液，收集到的上清液即为经过阴性筛选的高特异性识别溶藻弧菌的ssdna核酸适配体库；
步骤7：将步骤6中收集到的上清液溶液，经过步骤3的pcr扩增和步骤4的单链dna文库制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用多功能酶标仪检测所得文库对溶藻弧菌识别能力的增强情况，直至8轮筛选后，文库对溶藻弧菌识别能力达到最强；将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到实施例1-3中可用于检测溶藻弧菌活菌的ssdna核酸适配体，其序列为5’-gacgcttactcaggtgtgactcg-attttgcttttgccacttatcaacatttgtttttccgctttcgcacttc-cgaaggacgcagatgaagtctc-3’(seqidno：2)。
实施例2ssdna核酸适配体的异硫氰酸荧光素标记检测方法如下：
步骤1：对实施例2ssdna核酸适配体进行异硫氰酸荧光素标记；
步骤2：取感染溶藻弧菌活菌的样品10mg与步骤1所得浓度为200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20min；待孵育结合后，清洗样品，并用pbs溶液清洗样品，利用荧光显微镜检测本实施例中异硫氰酸荧光素标记的ssdna核酸适配体对溶藻弧菌的结合效果及其特异性，检测结果如图1所示，no.2为本发明实施例2检测结果。
实施例2ssdna核酸适配体的羧基四甲基罗丹明标记检测方法如下：
步骤1：对实施例2ssdna核酸适配体进行羧基四甲基罗丹明标记；
步骤2：取感染溶藻弧菌活菌的样品10mg与步骤1所得浓度为200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20min；待孵育结合后，清洗样品，并用pbs溶液清洗样品，利用荧光显微镜检测本实施例中羧基四甲基罗丹明标记的ssdna核酸适配体对溶藻弧菌的结合效果及其特异性，检测结果如图2所示，no.2为本发明实施例2检测结果。
实施例2ssdna核酸适配体的elisa检测方法如下：
步骤1：对实施例2ssdna核酸适配体进行生物素标记；
步骤2：取感染溶藻弧菌活菌的样品10mg与步骤1所得浓度为200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20min；待孵育结合后，清洗样品，并加入200μl由辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，在冰上再次进行孵育结合40min，孵育结合后用pbs溶液清洗样品，并加入辣根过氧化物酶显色试剂盒中进行tmb显色液显色，使用酶标仪读取样品在450nm处的吸光值并记录结果。如图3所示，no.2为本发明实施例2检测结果吸光值。
实施例3
本发明实施例取用实施例2所得ssdna核酸适配体，进行elisa试剂盒组装，形成一种用于水产致病菌溶藻弧菌检测的elisa检测试剂盒。
对照例
对照例ssdna核酸适配体的制备方法如下：
合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物
随机文库library50：
5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc-3’；
5’引物(fitc标记)：5’-fitc-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
5’引物(biotin标记)：5’-biotin-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
5’引物(tamra标记)：5’-tamra-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’；
3’引物：5’-biotin-gagacttcatctgcgtccttcg-3’；
上述随机单链dna文库为对照例ssdna核酸适配体。
对照例ssdna核酸适配体的异硫氰酸荧光素标记检测方法如下：
步骤1：对对照例ssdna核酸适配体进行异硫氰酸荧光素标记；
步骤2：取感染溶藻弧菌活菌的样品10mg与步骤1所得浓度为200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20min；待孵育结合后，清洗样品，并用pbs溶液清洗样品，利用荧光显微镜检测本实施例中异硫氰酸荧光素标记的ssdna核酸适配体对溶藻弧菌的结合效果及其特异性，检测结果如图1所示，con为本发明对照例检测结果。
对照例ssdna核酸适配体的羧基四甲基罗丹明标记检测方法如下：
步骤1：对对照例ssdna核酸适配体进行羧基四甲基罗丹明标记；
步骤2：取感染溶藻弧菌活菌的样品10mg与步骤1所得浓度为200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20min；待孵育结合后，清洗样品，并用pbs溶液清洗样品，利用荧光显微镜检测本实施例中羧基四甲基罗丹明标记的ssdna核酸适配体对溶藻弧菌的结合效果及其特异性，检测结果如图2所示，con为本发明对照例检测结果。
对照例ssdna核酸适配体的elisa检测方法如下：
步骤1：对对照例ssdna核酸适配体进行生物素标记；
步骤2：取感染溶藻弧菌活菌的样品10mg与步骤1所得浓度为200nm的ssdna核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20min；待孵育结合后，清洗样品，并加入200μl由辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，在冰上再次进行孵育结合40min，孵育结合后用pbs溶液清洗样品，并加入辣根过氧化物酶显色试剂盒中进行tmb显色液显色，使用酶标仪读取样品在450nm处的吸光值并记录结果。如图3所示，con为本发明对照例检测结果吸光值。
如图1所示，通过荧光显微镜确定溶藻弧菌活菌位置，由图中可看出，对照例的溶藻弧菌在荧光检测过程中不显示荧光，说明对照例ssdna核酸适配体无法与溶藻弧菌进行特异性结合，不能对溶藻弧菌进行有效检测，而实施例2的荧光检测过程中溶藻弧菌所在位置均有荧光显示，说明实施例2的ssdna核酸适配体可与溶藻弧菌进行有效结合。
如图2所示，通过荧光显微镜确定溶藻弧菌活菌位置，由图中可看出，对照例的溶藻弧菌在荧光检测过程中不显示荧光，说明对照例ssdna核酸适配体无法与溶藻弧菌进行特异性结合，不能对溶藻弧菌进行有效检测，而实施例2的荧光检测过程中溶藻弧菌所在位置均有荧光显示，说明实施例2的ssdna核酸适配体与溶藻弧菌具较好的结合效果。此外，图3中实施例2的荧光检测图片在可视光照射下明显可见其它杂菌，而在荧光检测过程中，杂菌位置无明显的荧光吸收，说明实施例2的ssdna核酸适配体可与溶藻弧菌进行特异性结合，不易产生假阳性结果，针对溶藻弧菌具有特异性识别的能力。
如图3所示，本发明实施例1、实施例2的ssdna核酸适配体与溶藻弧菌活菌可以进行特导性结合，检测结果均具有较高的吸光值，而对照例相比实施例1、实施例2，吸光值较低，不具有与溶藻弧菌活菌进行特异性结合的能力，无法对溶藻弧菌活菌进行特异性识别。此外，实施例2的吸光值明显高于实施例1，针对溶藻弧菌活菌具有更好的特异性识别能力。
基于图1、2、3的结果，可以证明本发明实施例1、实施例2所示的ssdna核酸适配体经过生物素、酶、异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明等荧光物质或发光材料标记修饰后，仍可与溶藻弧菌进行特异性结合，均可用于针对溶藻弧菌的检测及诊断。
本发明实施例1、2的ssdna核酸适配体作为小分子化合物，相比于蛋白抗体具有制备周期短、重现性好、分子量小的优点，便于体外合成，在水产致病菌溶藻弧菌的检测领域有良好的应用前景。此外，本发明实施例1、2通过selex技术筛选得到的ssdna核酸适配体具有较好的亲和力及特异性，且本发明实施例1、2的ssdna核酸适配体结构稳定，在进行基团标记及修饰后，仍具有较好的亲和力和特异性，可应用于elisa检测试剂盒中，达到现场对溶藻弧菌进行快速诊断的效果。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。
序列表
<110>广西科学院
<120>一种能够识别并结合溶藻弧菌的ssdna核酸适配体及其应用
<130>py1710279
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>49
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
attttgcttttgccacttatcaacatttgtttttccgctttcgcacttc49
<210>2
<211>94
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gacgcttactcaggtgtgactcgattttgcttttgccacttatcaacatttgtttttccg60
ctttcgcacttccgaaggacgcagatgaagtctc94