本发明属于医药领域，涉及一种富含苯并吡喃内酯的提取物、制备方法及医药用途。
背景技术：
岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c、岩天麻素是最早从网脉橐吾根中分离得到的苯并吡喃内酯类化合物，化学结构式如下表所示。
申请人发现，岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c、岩天麻素可以降低马兜铃酸的肾毒性，可以用于制备含有马兜铃酸的单味中药或中药提取物或中药复方制剂的减毒药物(参见申请人提交的发明专利申请，申请号为2017112638286)。
但是，从上述化学结构可知，岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c为同分异构体，这种结构上的相似性增加了单体的纯化难度，单体成药的成本太高。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种网脉橐吾根的提取物，该提取物中富含岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c、岩天麻素，并提供该提取物的制备方法，以替代岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c、岩天麻素单体成药，降低制药成本。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种富含苯并吡喃内酯的提取物，所述苯并吡喃内酯包括岩天麻素a、岩天麻素b和岩天麻素c，三者含量之和不低于90％。
优选地，所述苯并吡喃内酯还包括岩天麻素，四者含量之和不低于85％。
上述提取物的制备方法，包括如下步骤：
步骤s1，将网脉橐吾的干燥根粉碎，用醇水溶液提取，收集提取液，过滤，收集滤液；
步骤s2，滤液上大孔树脂柱，大孔树脂型号为d101，先用40％乙醇水溶液洗脱8个柱体积，再用60％乙醇水溶液洗脱，收集第5-6个柱体积洗脱液，浓缩得苯并吡喃内酯粗品；
步骤s3，碱性开环：将粗品用ph为7.8-8.2的碱水超声混悬，过滤，收集滤液；
步骤s4，酸性闭环：滤液ph调至6.4-6.6后立即过滤得二滤液，将二滤液低温静置析晶；
步骤s5，将步骤s4所得晶体用去离子水洗涤，干燥保存。
优选地，步骤s1优选75％乙醇提取。
优选地，步骤s3用0.45μm滤膜过滤。
上述提取物的制备方法，包括如下步骤：
步骤s1，将网脉橐吾的干燥根粉碎，用醇水溶液提取，收集提取液，过滤，收集滤液；
步骤s2，滤液上大孔树脂柱，大孔树脂型号为d101，先用40％乙醇水溶液洗脱8个柱体积，再用60％乙醇水溶液洗脱，收集第5-7个柱体积洗脱液，浓缩得苯并吡喃内酯粗品；
步骤s3，碱性开环：将粗品用ph为7.8-8.2的碱水超声混悬，过滤，收集滤液；
步骤s4，酸性闭环：滤液ph调至6.4-6.6后立即过滤得二滤液，将二滤液低温静置析晶；
步骤s5，将步骤s4所得晶体用去离子水洗涤，干燥保存。
优选地，步骤s1优选75％乙醇提取。
优选地，步骤s3用0.45μm滤膜过滤。
上述提取物用于制备马兜铃酸减毒药物的用途，用于制备含有马兜铃酸的单味中药的减毒药物的用途，用于制备含有马兜铃酸的中药提取物的减毒药物的用途，用于制备含有马兜铃酸的中药复方制剂的减毒药物的用途；所述减毒指降低马兜铃酸的肾毒性。
上述提取物用于制备马兜铃酸减毒药物的用途，用于制备含有马兜铃酸的单味中药的减毒药物的用途，用于制备含有马兜铃酸的中药提取物的减毒药物的用途，用于制备含有马兜铃酸的中药复方制剂的减毒药物的用途；减毒指降低马兜铃酸的肾毒性。
本发明的优点：
1、本发明提供的提取物富含岩天麻素a、岩天麻素b和岩天麻素c，三者含量之和不低于90％，或富含岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c和岩天麻素，四者含量之和不低于85％；该提取物的单体成分明确，且含量高，易于控制质量，可以降低马兜铃酸的肾毒性，可以用于制备含有马兜铃酸的单味中药或中药提取物或中药复方制剂的减毒药物；
2、本发明提取物的制备方法无需反复使用硅胶柱层析这些不易在工厂大规模操作的分离手段，仅需过一次大孔树脂，并结合ph调节控制即可制备出有效单体成分总含量85％以上的提取物，易于产业化，操作简单，成本低。
附图说明
图1为实施例1和实施例2制备的提取物对马兜铃酸导致人肾小管上皮细胞损害的保护作用，包括抑制hk-2细胞凋亡；
图2为实施例1和实施例2制备的提取物对马兜铃酸导致大鼠肾间质纤维化的保护作用，抑制肾组织纤维化纤维化面积和纤维化标志蛋白col-ⅰ的表达水平。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：提取物1的制备
包括如下步骤：
步骤s1，将网脉橐吾的干燥根粉碎，用75％乙醇提取，收集提取液，过滤，收集滤液；
步骤s2，滤液上大孔树脂柱，大孔树脂型号为d101，先用40％乙醇水溶液洗脱8个柱体积，再用60％乙醇水溶液洗脱，收集第5-6个柱体积洗脱液，浓缩得苯并吡喃内酯粗品；
步骤s3，碱性开环：将步骤s2所得苯并吡喃内酯粗品用ph值为8.0的氢氧化钠溶液超声混悬，0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
步骤s4，酸性闭环：滤液ph调至6.5后立即过滤得二滤液，将二滤液4℃静置析晶；
步骤s5，将步骤s4所得晶体用去离子水洗涤，干燥保存。
高效液相色谱法测定干燥的提取物中的苯并吡喃内酯，检测到岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c，岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c含量之和为91.4％。
实施例2：提取物2的制备
包括如下步骤：
步骤s1，将网脉橐吾的干燥根粉碎，用75％乙醇提取，收集提取液，过滤，收集滤液；
步骤s2，滤液上大孔树脂柱，大孔树脂型号为d101，先用40％乙醇水溶液洗脱8个柱体积，再用60％乙醇水溶液洗脱，收集第5-7个柱体积洗脱液，浓缩得苯并吡喃内酯粗品；
步骤s3，碱性开环：将步骤s2所得苯并吡喃内酯粗品用ph值为8.0的氢氧化钠溶液超声混悬，0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
步骤s4，酸性闭环：滤液ph调至6.5后立即过滤得二滤液，将二滤液4℃静置析晶；
步骤s5，将步骤s4所得晶体用去离子水洗涤，干燥保存。
高效液相色谱法测定干燥的提取物中的苯并吡喃内酯，检测到岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c、岩天麻素，岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c、岩天麻素含量之和为86.5％。
实施例3：上述提取物对马兜铃酸导致人肾小管上皮细胞损害的保护作用
一、实验材料
人肾小管上皮细胞系(hk-2)购自中国典型培养物保藏中心；
马兜铃酸-ⅰ(aa-ⅰ)购自中国药品生物制品检定所；
胎牛血清(fcs)，gibico公司；dmem：hamsf-12培养基(hyclone)；annexin-v试剂盒，invitrogen公司；
酶联免疫检测仪，美国thermofisher公司；流式细胞仪，美国bd公司。
二、实验方法
1、细胞培养及分组
取生长良好的hk-2细胞，悬浮于含10％fcs及1％青霉素+链霉素的dmem：hamsf-12培养基中，以6×107/l细胞悬液接种于96孔板中，每孔接种100μl，在37℃、5％co2、湿度100％环境下培养24h细胞贴壁后，吸弃培养液，按以下分组分别加入相应药物继续孵育培养48h。实验共设立4个组，每个组设8个复孔：
(1)对照组：培养液不加aa-ⅰ；
(2)马兜铃酸组：培养液中加入aa-ⅰ(25mg/l，各药物干预组同)；
(3)提取物1组：培养液中同时加入提取物1(10mg/l，为终浓度，下同)及aa-ⅰ；
(4)提取物2组：培养液中同时加入提取物2(10mg/l)及aa-ⅰ。
2、mtt法测定细胞存活率
各组于培养终止前4h，每孔加入5mg/l的mtt溶液20μl，培养结束后，每孔加入100μldmso，应用酶联免疫检测仪480nm处测量各孔的od值。
3、流式细胞法检测细胞凋亡率
培养结束后，收集细胞1×106个/ml，1000rpm离心5min，弃上清，用pbs重悬细胞，按照annexin-vfitc细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，检测凋亡细胞和坏死细胞的百分率。
4、统计学方法
采用spss19.0软件统计分析，数据以均值±偏差表示，组间比较采用单因素方差分析。
三、实验结果
1、mtt法测定细胞存活率
与对照组相比，aa-ⅰ作用48h后，马兜铃酸组hk-2细胞活性明显受抑制(p＜0.05)；与马兜铃酸组比较，提取物1组、提取物2组hk-2细胞活性均明显提高(p＜0.05)。各组480nm波长检测条件下的od值见表1。
表1各组480nm波长检测条件下的od值
2、流式细胞法检测细胞凋亡率
与对照组相比，aa-ⅰ作用48h后，马兜铃酸组hk-2细胞凋亡比例明显增加(p＜0.05)；与马兜铃酸组比较，提取物1组、提取物2组hk-2细胞凋亡比例均明显降低(p＜0.05)。各组凋亡值见表2和图1。
表2各组hk-2细胞凋亡比例
该实施例说明，马兜铃酸对人肾小管上皮细胞hk-2具有明显的细胞毒性，会造成hk-2存活率降低、凋亡率升高；本发明提供的提取物1、提取物2可以拮抗马兜铃酸对人肾小管上皮细胞hk-2的细胞毒性，具有开发成马兜铃酸减毒药物的前景。
实施例4：上述提取物对马兜铃酸导致大鼠肾间质纤维化的保护作用
一、实验材料
spf级雄性sd大鼠，体重280-300g，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场；
用食用油溶解马兜铃酸ⅰ，作为灌胃工作液。
二、实验方法
1、建立马兜铃酸肾纤维化大鼠模型和实验分组
马兜铃酸肾纤维化造模方法(参考文献：慢性马兜铃酸肾病动物模型的建立及牛磺酸对其早期保护作用，中国中西医结合杂志2003年6月第23卷基础理论研究特集，北京大学医学部病理学系)：先将大鼠按20mg/kg/d马兜铃酸ⅰ的剂量连续灌胃5d，停药9d；此后剂量减至15mg/kg/d，隔周灌胃给药，直至第11周。
将spf级雄性sd大鼠适应性喂养一周后，根据体重随机分为4组，每组10只：
(1)对照组：灌胃给予等体积溶媒(食用油)；
(2)马兜铃酸组：按照上述方法造模；
(3)提取物1组：按上述方法造模，且从第一周隔日灌胃25mg/kg/d提取物1；
(4)提取物2组：按上述方法造模，且从第一周隔日灌胃25mg/kg/d提取物2。
2、肾组织纤维化病理检查
培养结束后，处死大鼠，取出大鼠肾脏，pbs缓冲液冰上淋洗干净，常规脱水、包埋、切片及masson染色后，光学显微镜(×100)采集皮质部分的肾间质图像(每只大鼠随机采集15个视野)，用多功能真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学制造)进行自动测量分析，肾间质纤维化相对面积＝肾间质绿染区面积/视野总面积×100％。
3、肾组织纤维化标志蛋白col-ⅰ表达的检测
培养结束后，处死大鼠，取出大鼠肾脏，放置于冰上，防止蛋白质降解。剪取约35mg组织，加入350μl浓度为100mg/ml的裂解液，用研磨棒充分研磨，冰上静置20min，4℃下相对离心力5.67×104×g离心15min。吸取蛋白质上清液，弃去沉淀。4℃下相对离心力5.67×104×g离心15min，再次吸取蛋白质上清液，弃去沉淀。以gapdh蛋白为内参，采用蛋白质印迹法(westernblot)测定各组大鼠肾组织col-ⅰ的相对表达水平。
4、统计学方法
采用spss19.0软件统计分析，数据以均值±偏差表示，组间比较采用单因素方差分析。
三、实验结果
1、各组大鼠肾间质纤维化相对面积
与对照组相比，马兜铃酸组大鼠肾间质纤维化相对面积显著升高(p＜0.05)；与马兜铃酸组比较，提取物1组、提取物2组大鼠肾间质纤维化相对面积均明显降低(p＜0.05)。各组大鼠肾间质纤维化相对面积见表3和图2。
表3大鼠肾间质纤维化相对面积(％)
2、各组大鼠肾组织纤维化标志蛋白col-ⅰ表达水平
与对照组相比，马兜铃酸组大鼠肾组织中col-ⅰ蛋白表达水平显著升高(p＜0.05)；与马兜铃酸组比较，提取物1组、提取物2组大鼠肾组织中col-ⅰ蛋白表达水平均明显降低(p＜0.05)。各组大鼠col-ⅰ的相对表达水平如图2所示。
该实施例说明，马兜铃酸会造成大鼠肾组织纤维化；本发明提供的提取物1、提取物2可以拮抗马兜铃酸的体内肾毒性，具有开发成马兜铃酸减毒药物的前景。
实施例5：与单味中药制成药物组合物
一种药物组合物，为单味中药与实施例1或2提取物的组合；该单味中药可以是关木通、马兜铃、广防己、青木香、朱砂莲、寻骨风、天仙藤、厚朴、细辛等含有马兜铃酸的中药。
实施例6：与中药提取物制成药物组合物
一种药物组合物，为中药提取物与实施例1或2提取物的组合；该中药可以是关木通、马兜铃、广防己、青木香、朱砂莲、寻骨风、天仙藤、厚朴、细辛等含有马兜铃酸的中药。
该药物组合物可以用于制药或者制成成减肥茶等产品。
实施例7：与中药复方制成药物组合物
一种药物组合物，为中药复方与实施例1或2提取物的组合；该复方可以是大黄清胃丸、小儿金丹片、分清五淋丸、龙胆泻肝丸、十香返生丸、冠心苏合丸等含马兜铃酸的中药复方。
综上可见，本发明提供的提取物富含岩天麻素a、岩天麻素b和岩天麻素c，三者含量之和不低于90％，或富含岩天麻素a、岩天麻素b、岩天麻素c和岩天麻素，四者含量之和不低于85％；该提取物的单体成分明确，且含量高，易于控制质量，可以降低马兜铃酸的肾毒性，可以用于制备含有马兜铃酸的单味中药或中药提取物或中药复方制剂的减毒药物；本发明提取物的制备方法无需反复使用硅胶柱层析这些不易在工厂大规模操作的分离手段，仅需过一次大孔树脂，并结合ph调节控制即可制备出有效单体成分总含量85％以上的提取物，易于产业化，操作简单，成本低。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。