一种体外活化扩增自然杀伤细胞的方法与流程

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种自然杀伤细胞(nk细胞)的体外培养扩增方法。

背景技术：

通常，nk细胞的应用工艺流程，从不同来源的血液采集开始，经历了血液(如外周血、脐带血、骨髓)的单个核细胞分离、种瓶包被、激活剂刺激、特异性抗体诱导、大规模扩增培养、nk细胞收获、质量监控等七个阶段，涉及单个核细胞的分离技术、nk细胞的体外诱导和激活技术、nk细胞的体外高效扩增技术、nk细胞的收获技术、nk细胞的质量控制技术等关键工艺技术。其中，nk细胞的体外诱导和大规模高效扩增技术是整个nk细胞制备工艺的基础和关键步骤，很大程度地决定了最终所得nk细胞产品的最终数量、纯度和杀伤活性。特别地，如果经体外培养得到的nk细胞的纯度较低、含有cd3+阳性的非nk淋巴细胞较多，会严重地降低nk细胞的直接杀伤活性及其抗衰老等功效并容易引起主要由t淋巴细胞导致的严重的副作用，如高烧、过敏等；此外，如果nk细胞体外培养的数量较少，那么则会大大地增加nk细胞的应用成本。

因此，nk细胞的体外高效活化及扩增技术一直都是本领域的研究热点。目前，从人外周血中分离人nk细胞的基本方法是：首先，对所获得的血液样品进行密度梯度离心，取得白膜层(内含单个核细胞pbmc)；然后，使用0.9％生理盐水将血样标本还原至原体积，离心、洗涤，并用无血清培养基将pbmc重悬，调整细胞浓度至适当范围；接下来，将pbmc重悬液转入预先包被好的细胞培养瓶中刺激、培养适当时间；最后，转入细胞培养袋中继续培养，持续添加含有活性成分的无血清培养基，维持细胞浓度在合适范围，14天左右后即可得到大量扩增的nk细胞。以上现有技术存在多方面的不足，包括：1)nk细胞的扩增倍数较低，经过两个星期左右的培养，nk细胞的扩增倍数仅为几倍至十几倍；2)所得nk细胞的纯度较低，达不到实际应用的要求；3)在培养过程中，大量使用多种价格高昂的细胞因子和抗体，造成nk细胞的制备成本过高，不适合进行nk细胞的大规模体外培养扩增；4)虽然有研究者将k562细胞作为滋养层细胞来培养nk细胞，并获得了纯度较高、数量较多的nk细胞。但是k562细胞是一种白血病细胞，可以释放大量的含有肿瘤核酸信息的外泌体微囊促使正常的造血细胞恶变，用滋养层细胞培养制备的nk细胞用于临床治疗存在着较高的安全风险，对制备工艺的要求也异常苛刻。故一般不推荐作为临床级nk细胞大规模培养的常规技术。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，经过大量的诱导激活剂筛选等实验研究，尤其是nk细胞的体外活化培养、扩增技术进行了优化，从而找到的一种操作简便而经济有效的nk细胞培养扩增技术，具nk细胞得率高、生长状态好、杀伤活性高、整体工艺成本低特点。

为解决上述技术问题，本发明公开了一种体外高效活化扩增nk细胞的方法，所方法包括如下步骤：

a.激活剂预处理

在培养瓶中加入激活剂和pbs进行混合后，所述激活剂含有0.10mg-100.00mg/ml的透明质酸和0.1μg-20μg/ml的cd16抗体，所述激活剂和所述pbs的体积比为1:40；活化处理，吸除激活剂，然后加入生理盐水，轻晃培养瓶，最后吸除生理盐水,得到已包被的培养瓶；

b.单个核细胞分离、血浆采集及处理

采集nk细胞进行密度梯度离心处理，收集上层血浆后进行补体的灭活处理，然后再次离心处理去除血小板，得到待处理的血浆；然后从中收取单个的核细胞层，离心洗涤，然后加入含有gm-csf，il-15、il-2和自体血浆的nk细胞无血清培养基，制得细胞悬浮液，然后取少量细胞悬液计细胞数。

c.细胞培养

取a步骤后得到的已包被的培养瓶，加入单个核细胞悬液，所述gm-csf，il-15，il-2和自体血浆在所述悬液中的浓度分别为0.05μg-1.00μg/ml，25-50ng/ml，500-1000u/ml和5-10％；然后进行14-18天的培养，在这个过程中，及时补充含自体血浆、il-2和il-15的新鲜培养基，最后得到待处理的细胞；

d.细胞收获

将细胞转移到离心管，进行离心处理，再用生理盐水离心洗涤，然后加入注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞，进行细胞过滤处理，然后静置得到扩增后的细胞悬液。

优选的，所述nk细胞来源于人脐带血或者外周血。

优选的，所述c步骤的具体步骤如下：

1)单个核细胞悬液中加入gm-csf、il-15，il-2和自体血浆，使其终浓度分别为0.05μg-1.00μg/ml，25-50ng/ml，500-1000u/ml和5-10％，使得悬液中细胞的最终浓度为2*10^6/ml；

2)37℃，5％co2和100％湿度下培养；次日，观察是否有污染现象；如无，继续培养48小时。

3)72小时后，根据细胞密度，加入适量含il-21000u/ml，il-1550ng/ml，血浆10％的扩增培养基，补充液体量为原体积的一倍；

4)继续培养2天，培养液中补充适量含血浆5-10％，1000u/ml的il-2和50ng/ml的il-15的新鲜扩增培养基。补液量一般为原体积的1-3倍；

5)每天观察细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆、il-2和il-15的新鲜培养基；

6)继续培养1-3天，此时应转大培养袋培养；补充适量含10％血浆，il-2和il-15，使得悬液中il-2和il-15的最终浓度分别为500-1000u/ml和25-50ng/ml；

7)每隔2-3天补充新鲜的含血浆及细胞因子的培养基，继续培养7-11天细胞，达到目的用量后，收获细胞。

优选的，所述a步骤中，活化处理的条件为4℃下活化12-16小时；或置于4℃冰箱保存，时长2周。

优选的，所述b步骤中所述密度梯度离心处理为2000rpm，时间为25分钟；所述灭活处理除去补体后的温度为56℃，时间持续20分钟；所述灭活处理的离心处理速度为3000rpm，时间不小于5分钟；灭活离心处理除去补体后还需要将去除血小板后的血浆置于4℃储存备用。

优选的，所述步骤b中，离心洗涤的次数为两次，时间为6分钟。

优选的，所述d步骤中，离心处理的次数为两次，速度为1500rpm，离心时间为6分钟。

更为优选的，所述d步骤中，所述注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞的浓度为1％。

更为优选的，所述d步骤中，所述细胞过滤处理用的筛子为70μm的细胞筛。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明相比于已有的专利方法，是一种更为简单有效的nk细胞的体外扩增培养技术，有效地降低了nk细胞的体外扩增培养成本。在包被步骤中，加入透明质酸，显著地增加nk细胞的比例和扩增倍数；具有极大的市场前景和经济价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是实验例所述nk细胞(外周血来源)进行诱导激活阶段的显微镜观察的示意图；

图2是实验例所述的对nk细胞(外周血来源)的流式细胞仪检测结果示意图；

图3是实验例所述的对nk细胞(外周血来源)的流式细胞仪检测结果示意图；

图4是实验例所述的对nk细胞(外周血来源)的流式细胞仪检测结果示意图；

图5是实验例所述的对nk细胞(外周血来源)的流式细胞仪检测结果示意图；

图6是实验例所述的示对nk细胞(外周血来源)的流式细胞仪检测结果意图；

图7是实验例所述的nk细胞(脐带血来源)进行诱导激活阶段的显微镜观察示意图；

图8是实验例所述的nk细胞(脐带血来源)进行的流式细胞仪检测示意图；

图9是实验例所述的nk细胞(脐带血来源)进行的流式细胞仪检测示意图；

图10是实验例所述的nk细胞(脐带血来源)进行的流式细胞仪检测示意图；

图11是实验例所述的nk细胞(脐带血来源)进行的流式细胞仪检测示意图；

图12是实验例所述的nk细胞(脐带血来源)进行的流式细胞仪检测示意图。

具体实施方式

实施例

实施例1本实施例公开了一种自然杀伤细胞(nk细胞)的体外培养扩增方法，所述方法(以50ml人外周血为例)如下：

a.激活剂预处理

1)吸取激活剂500ul，内含透明质酸(浓度范围在0.10mg-10.00mg/ml之间)和cd16抗体(浓度范围在0.5μg-2μg/ml之间)，加至1个175cm²培养瓶中。加入pbs20ml充分混匀，使液体分散在瓶底；

2)4℃活化12-16小时；或置于4℃冰箱保存，可储存2周。

3)吸除激活剂，沿培养瓶侧壁加入生理盐水，轻轻晃动培养瓶，使液体充分分散。

4)吸除生理盐水，洗涤后的培养瓶应立即使用。

b.单个核细胞分离、血浆采集及处理

1)开启水浴箱，调整温度至56℃，以备灭活补体用。

2)采集常规外周血50ml左右。

3)ficoll-hypaque密度梯度离心，800g(2000rpm左右)，25分钟。

4)收集上层血浆，编号。立即将收集的血浆置于56℃，持续20分钟，以灭活血浆中的补体。之后，3000rpm离心5分钟以上，以去除其中的血小板。将去除血小板后的血浆置于4℃储存。

5)收取单个核细胞层，充分混匀。离心洗涤，500g，6分钟。

6)再次离心洗涤，500g，6分钟。

7)使用含gm-csf、il-15、il-2和自体血浆的nk细胞无血清培养基悬浮细胞。

8)取10ul细胞悬液计细胞数。

c.细胞培养

1)将单个核细胞悬液加入已经包被好的培养瓶内，单个核细胞悬液中含有gm-csf，il-15，il-2和自体血浆，终浓度分别为0.05μg-1.00μg/ml，25-50ng/ml，500-1000u/ml和5-10％。细胞终浓度为2*10^6/ml。

2)37℃，5％co2和100％湿度下培养。次日，观察是否有污染现象；如无，继续培养48小时。

3)72小时后，根据细胞密度，加入适量含il-21000u/ml，il-1550ng/ml，血浆10％的扩增培养基。一般情况下，补充液体量为原体积的一倍。

4)继续培养2天，培养液中补充适量含血浆5-10％，il-2(1000u/ml)和il-15(50ng/ml)的新鲜扩增培养基。补液量一般为原体积的1-3倍。

5)之后，每天观察细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆、il-2和il-15的新鲜培养基。

6)继续培养1-3天，此时应转大培养袋培养。补充适量含10％血浆，il-2和il-15终浓度分别为500-1000u/ml和25-50ng/ml的新鲜培养基。

7)每隔2-3天补充新鲜的含血浆及细胞因子的培养基，继续培养7-11天细胞，达到目的用量后，可进行质量检验，之后收获细胞。

d.细胞收获

1)将细胞转移至离心管，计细胞数及细胞活力。

2)离心收获细胞，离心速度为1500rpm(300xg)，离心时间为6分钟。

3)生理盐水离心洗涤两次，1500rpm(300xg)，6分钟。

4)用含1％注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞。

5)70μm细胞筛过滤细胞。

6)留小样备质检。

7)将细胞转移至输液袋中。静置于室温。

实施例2本实施例公开了一种自然杀伤细胞(nk细胞)的体外培养扩增方法，所述方法(以50ml人脐带血为例)如下：

a.激活剂预处理

1)吸取激活剂500ul，内含透明质酸(浓度范围在0.10mg-10.00mg/ml之间)和cd16抗体(浓度范围在0.5μg-2μg/ml之间)，加至1个175cm²培养瓶中。加入pbs20ml充分混匀，使液体分散在瓶底。

2)4℃活化12-16小时；或置于4℃冰箱保存，可储存2周。

3)吸除激活剂，沿培养瓶侧壁加入生理盐水，轻轻晃动培养瓶，使液体充分分散。

4)吸除生理盐水，洗涤后的培养瓶应立即使用。

b.单个核细胞分离、血浆采集及处理

1)开启水浴箱，调整温度至56℃，以备灭活补体用。

2)采集常规脐带血50ml左右。

3)ficoll-hypaque密度梯度离心，800g(2000rpm左右)，25分钟。

4)收集上层血浆，编号。立即将收集的血浆置于56℃，持续20分钟，以灭活血浆中的补体。之后，3000rpm离心5分钟以上，以去除其中的血小板。将去除血小板后的血浆置于4℃储存。

5)收取单个核细胞层，充分混匀。离心洗涤，500g，6分钟。

6)再次离心洗涤，500g，6分钟。

7)使用含gm-csf、il-15、il-2和自体血浆的nk细胞无血清培养基悬浮细胞。

8)取10ul细胞悬液计细胞数。

c.细胞培养

1)将单个核细胞悬液加入已经包被好的培养瓶内，单个核细胞悬液中含有gm-csf，il-15，il-2和自体血浆，终浓度分别为0.05μg-1.00μg/ml，25-50ng/ml，500-1000u/ml和5-10％。细胞终浓度为2*10^6/ml。

2)37℃，5％co2和100％湿度下培养。次日，观察是否有污染现象；如无，继续培养48小时。

3)72小时后，根据细胞密度，加入适量含il-21000u/ml，il-1550ng/ml，血浆10％的扩增培养基。一般情况下，补充液体量为原体积的一倍。

4)继续培养2天，培养液中补充适量含血浆5-10％，il-2(1000u/ml)和il-15(50ng/ml)的新鲜扩增培养基。补液量一般为原体积的1-3倍。

5)之后，每天观察细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆、il-2和il-15的新鲜培养基。

6)继续培养1-3天，此时应转大培养袋培养。补充适量含10％血浆，il-2和il-15终浓度分别为500-1000u/ml和25-50ng/ml的新鲜培养基。

7)每隔2-3天补充新鲜的含血浆及细胞因子的培养基，继续培养7-11天细胞，达到目的用量后，可进行质量检验，之后收获细胞。

d.细胞收获

1)将细胞转移至离心管，计细胞数及细胞活力。

2)离心收获细胞，离心速度为1500rpm(300xg)，离心时间为6分钟。

3)生理盐水离心洗涤两次，1500rpm(300xg)，6分钟。

4)用含1％注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞。

5)70μm细胞筛过滤细胞。

6)留小样备质检。

7)将细胞转移至输液袋中。静置于室温。

实验例

实验例1对实施例1所得的nk细胞进行诱导激活阶段的显微镜观察，结果如图1所示有大量nk细胞集落形成。

实验例2对实施例1、2nk细胞(外周血来源)的流式细胞仪检测结果(具体见图2-6)可见，cd3-93.7％；cd16+92.2％；cd56+96.9％；nk92.3％。

可见在包被步骤中，于包被液中加入透明质酸，能够显著地增加nk细胞的比例和扩增倍数。此外透明质酸还具有易得(临床应用级别)、成本低廉等优点，便于获取、使用及质量监控。

将实验例3对实施例2得到的nk细胞(脐带血来源)进行诱导激活阶段的显微镜观察，结果(具体见图7)：有大量nk细胞集落形成。

将实验例4对实施例1、2得到的nk细胞(脐带血来源)进行的流式细胞仪检测，结果(具体见图8-12)为cd3-98％；cd16+84.1％；cd56+91.9％；nk91.7％。

可见在包被液中加入透明质酸，能够显著地增加nk细胞的比例和扩增倍数。此外透明质酸还具有易得(临床应用级别)、成本低廉等优点，便于获取、使用及质量监控

实验例5将实施例1/2所得的nk细胞的扩增倍数和现有技术进行对比，得到表1结果：

表1

实验例6将实施例1/2所得的nk细胞的对k562靶细胞的杀伤率与现有技术进行对比，得到表2结果：

表2

可见本实施例1和2提供的简单有效的nk细胞的体外扩增培养技术，有效地降低了nk细胞的体外扩增培养成本。其技术特征在于，在包被步骤中，加入透明质酸，显著地增加nk细胞的比例和扩增倍数。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。