本发明涉及真菌发酵
技术领域：
，具体涉及一种冬虫夏草液体培养基及其制备方法，以及利用该培养基生产冬虫夏草菌种和冬虫夏草菌丝体的方法。
背景技术：
：冬虫夏草是我国二级保护物种，是我国名贵的中药材瑰宝，它在我国民间流传应用已有两千多年的历史。冬虫夏草不仅是具有良好保健功能的药用真菌，而且是具有很高营养价值的高档滋补食用真菌，随着人们生活水平和生活质量的提高，对功能保健产品的需求也日趋扩大。由于野生冬虫夏草分布地区狭窄、自然寄生率低、对生活环境条件要求苛刻，所以本身资源比较有限。近年来冬虫夏草主产地生态环境遭到人为严重破坏，大量盲目不合理采挖致使资源日趋减少，产量逐年下降。而冬虫夏草由于可以药食两用，且人们不断发现其新的药理作用，所以多个国家对它的需要倍增，价格逐年上涨，国际市场日益紧缺。因野生资源逐年枯竭，冬虫夏草的资源保护和可持续利用一直是行业内外广泛关注的焦点，人工发酵方法生产的冬虫夏草菌丝粉已被知晓和认可。冬虫夏草无性型菌种中国被毛孢(HirsutellasinensisLu,Guo,YuetZeng)，目前国内许多个人和单位研究和公开冬虫夏草培养基和发酵生产方法。现有技术中，中国被毛孢菌发酵培养的培养基中主要氮源以鱼蛋白胨、牛肉或牛骨蛋白胨、皮革蛋白胨、胰蛋白胨、蚕蛹等动物蛋白为主。目前动物蛋白胨用于发酵生产存在如下问题：动物致病因子、疯牛病等风险；重金属含量超标；抗生素残留量高。虽然中国药典规定的发酵冬虫夏草菌丝产品理化检测指标中不包含上述指标，但是安全隐患仍然是不可忽视的问题。技术实现要素：本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种能够生产质量好、安全性高、功效和营养成分含量高的冬虫夏草菌丝体的培养基。为达到上述目的，本发明采用的技术解决为：一种冬虫夏草液体培养基，包含重量百分比的以下组分：菊芋汁10～40％，玉米粉0～3％，麸皮0～3％，大豆蛋白胨0.1～1％，玉米浆0～3％，豆粕0～5％，葡萄糖0.1～0.3％，硫酸镁0.01～0.05％，磷酸二氢钾0.01～0.05％和余量的水。优选的，菊芋汁为菊芋全汁，由清洗后的鲜菊芋块茎或/和菊芋茎叶破碎、均质制备。进一步的，菊芋汁可由菊芋全粉或/和干菊粉代替；菊芋全粉或/和干菊粉的使用量为菊芋汁的15～25％。进一步的，培养基中还含有5～15wt％琼脂。本发明还提供一种冬虫夏草液体培养基的制备方法。一种冬虫夏草液体培养基的制备方法为：原料液化：按配方加入菊芋汁、玉米粉、麸皮、豆粕和水，加入0.2～0.4wt％的蛋白质水解酶后加热至100～105℃，自然降温4～8小时，取上清液得液化料液；配制：液化料液中按配方加入大豆蛋白胨、玉米浆、葡萄糖、硫酸镁和磷酸二氢钾，用氢氧化钠调PH至7.2～7.5，即得冬虫夏草液体培养基。进一步的，培养基的制备方法还包括：配制后加入5～15wt％琼脂。本发明还提供一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌丝体的方法。一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌丝体的方法，包括：冬虫夏草液体培养基中加入植物油类消泡剂，0.11～0.15MPa、121～125℃，灭菌30～60min，冷却至室温；接种后通入无菌空气，通气量0.11～0.16MPa，13～18℃培养5～10天；分离菌丝，干燥，即得冬虫夏草菌丝体。进一步的，无菌空气的温度大于实时空气温度。本发明还提供一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌种的方法。一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌种的方法，包括：冬虫夏草液体培养基中加入琼脂，加热至琼脂溶化；0.11～0.15MPa、121～125℃，灭菌30～60min，冷却至40～85℃，分装、摆斜面，冷却至室温；接种，13～18℃培养30～45天，得冬虫夏草菌种。本发明提供的冬虫夏草液体培养基，用菊芋和豆粕代替蚕蛹，用大豆蛋白胨、豆粕等代替原有的动物源蛋白胨(肉蛋白胨、鱼蛋白胨、骨蛋白胨等)，用植物油类消泡剂代替有机硅或醚类消泡剂，提供一种原料来源更广泛，经济成本更低，安全性更好的全植物源培养基及生产工艺。新鲜的菊芋含蛋白质量6.3～8.7％，总糖73～87％，属于碳氮双用的微生物培养基原料，另外，菊芋有增值菌类繁殖的的功能。菊糖还具有控制血脂，降低心血管疾病的危害，降低血氨浓度，促进矿物质的吸收，防治便秘等功效，适宜于糖尿病患者。菊糖还可以调节代谢功能、提高脂质代谢率、增强免疫力以及提高矿物质吸收转化。因此，使用菊芋不仅能满足冬虫夏草菌的生产需求，还能提供额外的保健功效。菊芋是一种无病虫危害和农药污染的农作物，因此安全性高。菊芋分布广，在中国南北各地均有栽培；适应性强，耐贫瘠，耐寒，耐旱；种植简易，一次播种多次收获；产量极高。因此，来源和价格稳定，成本低。大豆蛋白胨总氮含量为15％左右，氨基氮为2.5％左右，动物源肉胨总氮含量14％左右，骨胨总氮含量13％左右，胰蛋白胨总氮含量14％左右，几种蛋白胨总氮含量相当，在价格方面大豆蛋白胨较低，较动物源蛋白胨成本低50％左右。且农产品原料来源稳定，品质控制较为容易。豆粕是用大豆榨取豆油后得到的一种副产品。因为榨油只是把大豆中的油脂提取出来，而豆粕中含有很多蛋白质等营养物质。豆粕中总氮含量7％左右，在冬虫夏草发酵生产时可考虑加倍量使用，加量使用后，成本方面较原有蚕蛹配方还要节约一半左右。本发明提供的冬虫夏草液体培养基，用植物性原料替代动物性原料，生产过程中不使用抗生素，因此无抗生素残留。也不会存在动物致病因子风险。植物在生态系统中属于生产者，虽然会富集重金属，但相较于消费者的动物，富集的重金属远远小于动物富集的重金属。植物性原料较动物性原料生产成本更低，来源更稳定，品质控制更简单。因此，本发明提供的冬虫夏草液体培养基以及利用该培养基生产的冬虫夏草菌种和菌丝体成本低、质量好、安全性高、功效和营养成分含量高。利用本发明提供的培养基生产冬虫夏草菌丝体，缩短了发酵周期，可由原来总周期38～42天缩短到30～35天，总发酵周期缩短可降低染菌风险，并降低消耗。同时还能提高菌丝体收率，收率由原7‰左右增加到11.5‰左右，产品的各项质量指标也完全达到药典标准的要求。与现有技术相比，本发明提供的冬虫夏草液体培养基及利用该培养基生产冬虫夏草菌种和菌丝体的方法的优点：(1)无动物致病因子风险、重金属含量低、无抗生素残留，安全性高。(2)原料来源广泛、价格稳定、成本低。(3)培养基营养丰富、全面，完全能满足冬虫夏草菌种和菌丝的生长。(4)菌丝体发酵周期短、染菌风险低、能耗低。(5)菌丝体收率高，经济效益好。(6)产品质量稳定，符合相关标准。具体实施方式一种冬虫夏草液体培养基，包含重量百分比的以下组分：菊芋汁10～40％，玉米粉0～3％，麸皮0～3％，大豆蛋白胨0.1～1％，玉米浆0～3％，豆粕0～5％，葡萄糖0.1～0.3％，硫酸镁0.01～0.05％，磷酸二氢钾0.01～0.05％和余量的水。优选的，菊芋汁为菊芋全汁，由清洗后的鲜菊芋块茎或/和菊芋茎叶破碎、均质制备。进一步的，菊芋汁可由菊芋全粉或/和干菊粉代替；菊芋全粉或/和干菊粉的使用量为菊芋汁的15～25％。进一步的，培养基中还含有5～15wt％琼脂。本发明还提供一种冬虫夏草液体培养基的制备方法。一种冬虫夏草液体培养基的制备方法为：原料液化：按配方加入菊芋汁、玉米粉、麸皮、豆粕和水，加入0.2～0.4wt％的蛋白质水解酶后加热至100～105℃，自然降温4～8小时，取上清液得液化料液；配制：液化料液中按配方加入大豆蛋白胨、玉米浆、葡萄糖、硫酸镁和磷酸二氢钾，用氢氧化钠调PH至7.2～7.5，即得冬虫夏草液体培养基。进一步的，培养基的制备方法还包括：配制后加入5～15wt％琼脂。本发明还提供一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌丝体的方法。一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌丝体的方法，包括：冬虫夏草液体培养基中加入植物油类消泡剂，0.11～0.15MPa、121～125℃，灭菌30～60min，冷却至室温；接种后通入无菌空气，通气量0.11～0.16MPa，13～18℃培养5～10天；分离菌丝，干燥，即得冬虫夏草菌丝体。进一步的，无菌空气的温度大于实时空气温度。本发明还提供一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌种的方法。一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌种的方法，包括：冬虫夏草液体培养基中加入琼脂，加热至琼脂溶化；0.11～0.15MPa、121～125℃，灭菌30～60min，冷却至40～85℃，分装、摆斜面，冷却至室温；接种，13～18℃培养30～45天，得冬虫夏草斜面固体菌种。以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1一种冬虫夏草液体培养基，包含重量百分比的以下组分：菊芋汁10％，玉米粉3％，麸皮3％，大豆蛋白胨1％，玉米浆3％，豆粕5％，葡萄糖0.3％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.01％和余量的水。实施例2一种冬虫夏草液体培养基，包含重量百分比的以下组分：菊芋汁40％，玉米粉0.5％，大豆蛋白胨0.1％，玉米浆1％，葡萄糖0.15％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.2％和余量的水。实施例3一种冬虫夏草液体培养基，包含重量百分比的以下组分：菊芋汁25％，玉米粉2.5％，麸皮2％，大豆蛋白胨0.5％，玉米浆2％，豆粕2.5％，葡萄糖0.2％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％和余量的水。实施例4一种冬虫夏草液体培养基，包含重量百分比的以下组分：菊芋全粉6％，玉米粉2％，麸皮2％，大豆蛋白胨6％，玉米浆2％，豆粕5％，葡萄糖0.3％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％和余量的水。实施例5一种冬虫夏草液体培养基，包含重量百分比的以下组分：干菊粉1.5％，玉米粉3％，麸皮3％，大豆蛋白胨1％，玉米浆3％，豆粕5％，葡萄糖0.3％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.03％和余量的水。干菊粉为菊芋水提物。实施例6一种冬虫夏草液体培养基的制备方法为：原料液化：按实施例1配方加入菊芋汁10％，玉米粉3％，麸皮3％，豆粕5％和水，加入0.2wt％的蛋白质水解酶后加热至100℃，自然降温4小时，取上清液得液化料液；配制：液化料液中按配方加入大豆蛋白胨1％，玉米浆3％，葡萄糖0.3％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.01％，用氢氧化钠调PH至7.2～7.5，即得冬虫夏草液体培养基。实施例7一种冬虫夏草液体培养基的制备方法为：原料液化：按实施例4配方加入菊芋全粉6％，玉米粉2％，麸皮2％，豆粕5％和水，加入0.4wt％的蛋白质水解酶后加热至105℃，自然降温8小时，取上清液得液化料液；配制：液化料液中按配方加入大豆蛋白胨6％，玉米浆2％，葡萄糖0.3％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％，用氢氧化钠调PH至7.2～7.5，即得冬虫夏草液体培养基。实施例8冬虫夏草菌种培养基的制备：取实施例6制得的冬虫夏草液体培养基，加入琼脂15wt％，加热至琼脂溶化，即得。实施例9冬虫夏草菌种培养基的制备：取实施例7制得的冬虫夏草液体培养基，加入琼脂5wt％，加热至琼脂溶化，即得。实施例10一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌丝体的方法，包括：取实施例6制得的冬虫夏草液体培养基，加入大豆油，0.11MPa、121℃，灭菌60min，冷却至室温；接种后通入无菌空气，通气量0.16MPa，13℃培养10天；分离菌丝，干燥，即得冬虫夏草菌丝体。无菌空气的温度大于实时空气温度。实施例11一种利用冬虫夏草液体培养基生产冬虫夏草菌种的方法，包括：取实施例7制得的冬虫夏草液体培养基；0.15MPa、125℃，灭菌30min，冷却至85℃，分装、摆斜面，冷却至室温；接种，18℃培养30天，得冬虫夏草斜面固体菌种。实施例12菌丝体培养对比试验以下对比例和试验例中，除培养基配方不同外，其他参数全部一致。原料液化条件：原料投料后加入0.3wt％的蛋白质水解酶后加热至102℃，自然降温6小时；PH值：7.4；灭菌条件：0.11MPa、121℃，灭菌45min，冷却至室温；无菌空气通气量：0.13MPa；无菌空气的温度大于实时空气温度；接种量：5％；培养基使用量：30L；培养条件及时间：15℃培养8天。对比例和试验例培养基配方见表1。冬虫夏草菌丝体收率和活性成分含量测定结果见表2。表1对比例和试验例培养基配方编号对比例1对比例2试验例1试验例2试验例3蚕蛹(％)1.52.0——————肉胨(％)1.01.0——————玉米粉(％)2.02.01.03.02.0葡萄糖(％)2.02.02.02.02.0菊芋汁(％)————40.0————菊芋全粉(％)——————6.0——干菊粉(％)————————1.5麸皮(％)————1.02.03.0大豆蛋白胨(％)————1.01.01.0玉米浆(％)————1.02.03.0豆粕(％)————1.02.55.0硫酸镁(％)0.020.020.020.020.02磷酸二氢钾(％)0.030.030.030.030.03水(％)补足补足补足补足补足消泡剂(大豆油)微量微量微量微量微量表2冬虫夏草菌丝体收率和活性成分含量测定结果编号对比例1对比例2试验例1试验例2试验例3法规标准菌丝体收率‰6.867.2312.1511.7312.08——氨基酸(％)32.1432.7832.5932.5433.1530.00虫草多糖(％)8.798.169.118.668.93——虫草酸(％)9.6610.089.759.239.52——腺苷(％)0.160.170.20.190.220.08铅(％)0.170.09——————0.1铬(％)0.150.18——————0.1结果显示，本发明试验例1～3的培养基所培养的冬虫夏草菌丝体的收率超过现有技术菌丝体收率。利用冬虫夏草液体培养基生产的冬虫夏草菌丝体的活性成分含量基本与天然冬虫夏草相同，个别指标高于法规标准。而不含菊芋提取物的对比例培养基所培养的冬虫夏草发酵产品的活性成分虽然能达到药典标准，但明显存在重金属残留，说明本发明的培养基在安全性效果方面效果显著优异。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 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