一种同时检测人EGFR基因45个突变位点的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种试剂盒，具体地说，涉及一种同时检测人egfr基因18-21外显子45个突变位点的试剂盒，属于生物技术和医学领域。
背景技术：
：人类表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)基因位于人第7号染色体短臂(7p12)，长约118kb，由28个外显子组成。其转录形成的mrna长约5.6kb，编码分子量为170kd的跨细胞膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶(tyrosinekinase，tk)活性，负责将胞外信号传递至胞内。异常的egfr活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、分化、血管新生，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡。egfr与其配体结合后形成同源二聚体，也可与其他tk受体形成异源二聚体，导致胞内tk区的激活，启动一系列级联反应，将信号传到细胞核内，最终引起一系列相关基因活化，导致肿瘤细胞增殖、凋亡抑制，促使肿瘤细胞转移并导致放、化疗耐受，在肿瘤发生发展过程中扮演着重要角色。egfr基因突变主要发生在胞内tk区域的前4个外显子上(18～21外显子)，研究表明：egfr基因18、19、21外显子发生突变的肺癌患者服用酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，tkis)类药物的疗效较好，20外显子发生的突变常与tkis耐药有关。中国肺癌患者中，egfr的突变率约为30％～50％，其中18外显子上发生的点突变约占egfr突变类型的5％左右，19外显子上发生的多种缺失突变约占egfr突变类型的45％左右，21外显子上发生的l858r、l861q点突变约占egfr突变类型的40％～45％，20外显子上发生的t790m点突变约占egfr突变类型的5％左右。目前检测基因突变的方法主要有以下几种：(1)直接测序法。直接测序法的原理是：首先针对突变位点设计引物(每个基因片段设计一对引物，引物所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置)，然后通过简单pcr扩增获得目的基因产物，最后对pcr产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对一些可能的突变样品的pcr产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的pcr产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长，而且由于测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。(2)变性高效液相色谱法(denaturinghigh-performanceliquidchromatograph，dhplc)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链dna与完全匹配的纯合双链dna解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形成“y”形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合dna链要比纯合dna链优先洗脱出来，通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。dhplc可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体位置，最终还需测序确认。(3)高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting，hrm)。高分辨率熔解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于pcr扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。(4)探针扩增阻滞突变法(amplificationrefractorymutationsystem，arms)。利用pcr引物的3’端末位碱基必须与其模板dna互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性pcr扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时pcr扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常dna互补，一个与突变dna互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的pcr，结合有与突变dna完全互补的引物才可以延伸并得到pcr扩增产物，该检测方法的灵敏度在1％左右。此外，目前检测人类egfr基因突变的引物、探针及试剂盒只能检测几种或二十几种缺失突变，而对于其余突变位点的检测并没有相关报道，因此亟需一种覆盖更多突变位点且特异性强的egfr基因突变检测试剂盒，为肺癌患者选择靶向治疗药物提供参考。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测人egfr基因18-21外显子45个突变位点的试剂盒，检测结果可供医生在非小细胞肺癌患者中选择适合服用抗egfr的靶向治疗药物的人群时参考。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：用于检测人egfr基因18-21外显子45种突变的引物和探针，其中引物和探针的具体序列见下表：所述探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团为fam，tet，vic，cy3，cy5，joe或hex，所述荧光淬灭基团为tamra或bhq；更优选地，所述荧光报告基团为fam；所述荧光淬灭基团为bhq。进一步，人egfr基因18-21外显子突变检测试剂盒，包括：检测egfr基因18-21外显子突变的引物和探针，内参基因的引物和探针，内控基因的引物和探针，taqdna聚合酶，egfr阳性质控品和dntp。更进一步，内控基因为actb，其引物和探针序列如下：ic-f：5’-gcatggagtcctgtggcatc-3’seqidno：27；ic-r：5’-gtacaggtctttgcggatgt-3’seqidno：28；ic-pb：5’-ccttcaactccatcatgaagtgt-3’seqidno：29；所述探针5’端标记荧光报告基团，且不同于步骤2所述探针标记的荧光报告基团，所述探针3’端标记荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团为hex，所述荧光淬灭基团为bhq。更进一步，内参基因为actb，其引物和探针序列如下：ir-f：5’-cagcagatgtggatcagca-3’seqidno：30；ir-r：5’-catagtccgcctagaagcatt-3’seqidno：31；ir-pb：5’-atgacgagtccggcccctccat-3’seqidno：32；所述探针5’端标记荧光报告基团，3’端标荧光淬灭基团；报告基团优选fam，淬灭基团优选bhq，为了判读结果方便，内参基因和突变基因探针的报告基团保持一致。进一步，利用上述引物和探针同时扩增待检测的45种突变基因序列。进一步，荧光pcr仪检测通道设定：stratagenemx3000p：突变检测通道为fam，tet，vic，cy3，cy5，joe或hex，内控检测通道不同于突变检测通道；优选地，突变检测通道为fam通道，内控检测通道为hex通道；二者同时设定为fam和hex通道，参比染料设置为“无”。反应程序设置如下：设置阴性质控品nc和阳性质控品pc用于结果判定。进一步，采用下述任意一种荧光pcr仪确定ct值：(1)stratagenemx3000p荧光pcr仪：首先设定基线，选择“适合基线(adaptivebaseline)”设定时的荧光信号，阈值(threshold)设定在扩增曲线指数区。从软件中读取各样本在各位点检测的ct值。(2)abi7500荧光pcr仪：首先设定基线，选择“自动基线(automaticbaseline)”设定时的荧光信号，阈值(threshold)设定在扩增曲线指数区。从软件中读取各样本在各位点检测的ct值。(3)rochelc480荧光pcr仪：选择“absquant/2ndderivativemax”模式，从软件中读取各样本在各位点检测的cp值。(4)abbottm2000rt荧光pcr仪：首先设定基线，选择“自动基线(automaticbaseline)”设定时的荧光信号，阈值(threshold)设定在扩增曲线指数区。从软件中读取各样本在各位点检测的ct值。(5)bioradcfx-96荧光pcr仪：首先设定基线，选择“默认基线(autocalculated)”设定时的荧光信号，阈值(threshold)设定在扩增曲线指数区。从软件中读取各样本在各位点检测的cp值。注：在下述内容中，将cp值、ct值统一标记为cp/ct值。进一步，对检测结果进行定性分析：(1)实验质量评判：若nc中fam、hex通道检测均无扩增(不呈典型的s型曲线)或无cp/ct值，pc中fam、hex通道检测均有扩增(呈典型的s型曲线)且cp/ct值≤35，则可继续分析；否则认为实验无效，需重复实验；(2)待检dna样品中内参基因检测情况评判：若内参基因检测(fam通道)有扩增且22≤cp/ct值≤30，则可继续分析；若其cp/ct值较小，则认为dna样品浓度过高；若其cp/ct值较大或无扩增，则认为dna样品浓度过低、发生降解，或其中可能含有pcr抑制剂。(3)待检dna样品中内控基因检测情况评判：若内控基因检测(hex通道)有扩增且cp/ct值≤35，则可继续分析；若内控基因检测(hex通道)cp/ct值较大或无扩增，但突变位点检测(fam通道)有扩增且cp/ct值≤39，则可继续分析(可能由于突变位点扩增对内控基因扩增产生抑制)；若内控基因检测(hex通道)cp/ct值较大或无扩增，而突变位点检测(fam通道)无扩增或有扩增但cp/ct值>39，则无法继续分析，需重复实验(可能由于dna样品发生降解、其中含有pcr抑制剂或未加样品)。(4)待检dna样品中基因突变情况评判：若样品中某突变位点检测(fam通道)有扩增且cp/ct值≤38，则判定该样本突变结果为阳性；若无扩增或cp/ct值>39，则判定该样本突变结果为阴性；若38<cp/ct值≤39，则判定该样本突变结果为疑似阳性(可能由于突变含量低造成cp/ct值波动)。注意：同一dna样品中可能同时存在多种突变。人egfr基因18-21外显子45个突变位点，突变位点信息如下:临床研究表明不同突变型对egfrtki类的药物敏感程度不同，确定检测样本具体含有哪个种类的egfr基因突变，用于结果统计，为临床研究提供数据，因此，将上述45个突变位点分成7个pcr反应进行检测。45种突变和内参基因分为8个pcr反应检测，各管检测的突变见下表：管号突变airbg719xce19deldl858rel861qft790mgs768ihe20ins本发明的有益效果是：本试剂盒基于寡核苷酸探针技术，建立了双通道内控反应体系，可以同时检测45种表皮生长因子受体egfr的基因突变，本试剂盒：(1)可用于同时检测egfr基因的45种突变，包括点突变、插入突变和缺失突变，包含了egfr基因绝大部分的高频突变；(2)选择性高，可用于检测包括石蜡包埋组织dna，新鲜组织dna，胸腔积液或腹腔积液中脱落细胞dna，血浆或尿液中游离dna(cellfreedna，cfdna)等多种样本dna；可用于检测低至5ng/μldna中0.6％的突变；可以耐受10ng/μl野生型dna；批内精密度测试ct值变异系数低于5％；(3)特异性高，用于检测野生型样本时，扩增曲线平整；(4)该试剂盒操作便捷，预装试剂，加样后即上机反应，便于实验室标准化操作；节省临床样本dna的用量(如果使用更多孔位检测，则需要更多的dna，临床样本dna宝贵且有限)、方便操作和上机(无需试剂反复冻融，降低试剂受到污染的风险、方便操作，需要检测几个人份就从试剂盒中取出几条八连管即可)；试剂盒内组分很少、用户操作简单，只涉及一步混匀和加样，不涉及试剂盒用户的试剂配制过程，从而有利于规范操作、缩短检测时间、降低操作错误导致结果错误的风险；(5)该试剂盒兼容适用于多种pcr仪器，90分钟完成上机检测，方便快速；(6)该试剂盒采用闭管反应，稳定可靠，减少污染；(7)该试剂盒采用ir-ic双质控体系，分析待检dna能否被正常扩增，排除可能造成pcr失败的原因，保证实验的可靠性和可追溯性；(8)内控基因检测体系与egfr各种突变类型检测体系在同一pcr管中进行反应，用于排除检测结果的“假阴性”；(9)判读方便，无非特异性扩增，客观判读结果，不需人工计算△ct值；(10)本试剂盒与sanger测序法检测非小细胞肺癌样本，kappa检验结果表明本试剂盒与测序法检测结果的一致性高，且具有统计学意义(p<0.05)。附图说明：图1为本发明实施例1加样排布图；图2为本发明实施例5阴性质控品nc检测情况；图3为本发明实施例5阳性质控品pc检测情况；图4为本发明实施例5egfr18外显子突变型(序号1～3)检测情况；图5为本发明实施例5egfr19外显子突变型(序号4～10)检测情况；图6为本发明实施例5egfr19外显子突变型(序号11～20)检测情况；图7为本发明实施例5egfr19外显子突变型(序号21～30)检测情况；图8为本发明实施例5egfr19外显子突变型(序号31～34)检测情况；图9为本发明实施例5egfr20外显子突变型(序号38～40)检测情况；图10为本发明实施例5egfr20外显子突变型(序号41～43)检测情况；图11为本发明实施例5egfr20外显子突变型(序号44～45)检测情况；图12为本发明实施例5egfr18外显子突变型(序号35～37)检测情况。具体实施方式本发明提供一种人egfr基因18-21外显子突变检测试剂盒，试剂盒组成如下：本试剂盒的使用方法如下：(1)根据待测dna样品的数量(n)，取试剂盒中相应条数(n+2)的检测试剂i以及阳性质控品pc；待检测试剂及阳性质控品pc融化后短暂离心，置于冰上；(2)根据待测dna样品的数量(n)，取试剂盒中相应数目(n+2)的pcr单管，加入taqdna聚合酶(3μl/管)至管底，置于冰上；向pcr单管中分别加入27μl待检dna样品、阴性质控品nc及阳性质控品pc，吹打混匀，盖紧管盖后短暂离心；(3)小心的打开装有检测试剂的8联管管盖，将步骤2中与taqdna聚合酶混匀的各个待检dna样品、阴性质控品nc及阳性质控品pc，按3μl/孔，分别加至检测试剂的不同反应孔中(每条8联管用于检测1个样品)。盖紧荧光pcr管盖，轻弹混匀后短暂离心。实施例以下实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例1以待检样品为10例举例，说明本试剂盒的使用方法：(1)从试剂盒中取出12条8联管，置于96孔板上，将检测试剂i及阳性质控品pc融化后短暂离心，置于冰上；(2)取12个pcr单管，分别标记1-10和nc、pc，每管加入3μltaqdna聚合酶，加至管底，置于冰上；向其中1-10号pcr单管中分别加入27μl待检的10例dna样品、阴性质控品nc及阳性质控品pc，吹打混匀，盖紧管盖后短暂离心(注意：混匀时不要使用漩涡振荡仪；混匀后立即进行后续操作)；阳性质控品pc为内参基因ir与人egfr各突变型基因质粒(表1，*标记)的te溶液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)，其中每种质粒的终浓度为5×10-4ng/μl。阴性质控品nc为溶解样本dna的缓冲液，由使用者自备；(3)小心打开装有检测试剂的8联管管盖，将步骤2中与taqdna聚合酶混匀的各个待检dna样品、阴性质控品nc及阳性质控品pc，按3μl/孔，分别对应加至检测试剂的不同反应孔中(每条8联管用于检测1个样品，如图1所示)；盖紧荧光pcr管盖，轻弹混匀后短暂离心(注意：取、盖管盖时应更换新的pe或橡胶手套；混匀时不要使用漩涡振荡仪；短暂离心后使试剂保持在管底并立即上机检测)。试剂盒中8联管的排布情况如图1所示，其中孔中1～10为10例待检dna样品，nc为阴性质控品，pc为阳性质控品。实施例2人egfr野生型基因组dna中egfr基因突变的检测限实验取人egfr野生型基因组dna、人egfr各突变型基因质粒(表1，*标记)及稀释缓冲液，制备同时含20ng/μl的人egfr野生型基因组dna及含量分别为野生型10％、5％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％的人egfr各突变型基因质粒的检测限参考品；制备同时含10ng/μl的人egfr野生型基因组dna及含量分别为野生型10％、5％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％的人egfr各突变型基因质粒的检测限参考品；制备同时含5ng/μl的人egfr野生型基因组dna及含量分别为野生型10％、5％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％的人egfr各突变型基因质粒的检测限参考品，记录阳性检出率(结果见表2)，实验中阳性检出率至少为95％(即至少92次可检出阳性，n＝96次)且突变型所占比例最低设定为检测限。结果发现，检测5ng/μl人egfr野生型基因组dna中所含egfr基因45种突变的含量的检测限均不低于0.6％。实施例3阴性参考品符合率实验检测15ng/μl的人egfr野生型基因组dna的10例阴性参考品各1次，记录阴性检出情况，结果发现，所有egfr野生型核酸样本的检测结果均为阴性，阴性符合率达100％。实施例4精密度实验用同一批号待检试剂对精密度中阳性参考品重复检测10次，计算中阳性参考品在检测孔位中的ct值的平均值(公式1)、标准差(s)(公式2)，进而计算变异系数(cv，％)(公式3)。结果发现，ct值的变异系数(cv，％)均≤5％。实施例5突变位点检测实验根据实施例1所述的试剂盒的使用方法，对阴性质控品nc、阳性质控品pc和分别含有18-21外显子45个突变位点的突变质粒(表4)进行检测，结果如下：(1)阴性质控品nc检测情况(如图2所示)(2)阳性质控品pc检测情况(如图3所示)(3)egfr18外显子突变型检测情况(如图4所示)(4)egfr19外显子突变型检测情况(如图5-8所示)(5)egfr20外显子突变型检测情况(如图9-11所示)(6)egfr21外显子突变型检测情况(如图12所示)结果表明，采用本发明的试剂盒可以快速准确地鉴定人egfr基因18-21外显子的突变位点，为选择肺癌患者的靶向治疗药物提供参考。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。表1人egfr基因18-21外显子突变质粒信息及规定检测位点注：*表示热点突变型。以上均为通过克隆获得的重组质粒，使用分光光度法测定od260nm，按照下式换算质粒所含基因拷贝数：dna浓度＝od260nm×50×10-9g/μl；基因拷贝数＝dna浓度/mw×6.02×1023拷贝/μl。其中od260nm为1cm光径下260nm处吸光度值；mw为质粒分子量，单位为g/mol；6.02×1023为阿伏伽德罗常数。表2检测限实验结果表注：参考品名称中“％”表示egfr各突变位点基因占egfr野生基因拷贝数的比例，“ng/μl”表示egfr野生型基因的浓度。序列表<110>北京雅康博生物科技有限公司<120>一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒<160>32<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>artificial<400>1ttcaaaaagatcaaagtgctga22<210>2<211>22<212>dna<213>artificial<400>2ttcaaaaagatcaaagtgctgt22<210>3<211>22<212>dna<213>artificial<400>3tcaaaaagatcaaagtgctggc22<210>4<211>17<212>dna<213>artificial<400>4gtgccagggaccttacc17<210>5<211>22<212>dna<213>artificial<400>5tatacaccgtgccgaacgcacc22<210>6<211>20<212>dna<213>artificial<400>6cgtcgctatcaaaacatctc20<210>7<211>19<212>dna<213>artificial<400>7ccgtcgctatcaaggaacc19<210>8<211>18<212>dna<213>artificial<400>8cgtcgctatcaaggagcc18<210>9<211>19<212>dna<213>artificial<400>9tgaggttcagagccatgga19<210>10<211>23<212>dna<213>artificial<400>10agccaacaaggaaatcctcgatg23<210>11<211>19<212>dna<213>artificial<400>11agatcacagattttgggcg19<210>12<211>20<212>dna<213>artificial<400>12ttactttgcctccttctgca20<210>13<211>23<212>dna<213>artificial<400>13ctgggtgcggaagagaaagaata23<210>14<211>19<212>dna<213>artificial<400>14attttgggctggccaaaca19<210>15<211>20<212>dna<213>artificial<400>15ttactttgcctccttctgca20<210>16<211>23<212>dna<213>artificial<400>16ctgggtgcggaagagaaagaata23<210>17<211>18<212>dna<213>artificial<400>17caccgtgcagctcatcat18<210>18<211>19<212>dna<213>artificial<400>18tgttcccggacatagtcca19<210>19<211>22<212>dna<213>artificial<400>19agctcatgcccttcggctgcct22<210>20<211>20<212>dna<213>artificial<400>20gaagcctacgtgatggccat20<210>21<211>20<212>dna<213>artificial<400>21atgagctgcacggtggaggt20<210>22<211>20<212>dna<213>artificial<400>22ccgcctgctgggcatctgcc20<210>23<211>18<212>dna<213>artificial<400>23gatggccagcgtggacgg18<210>24<211>18<212>dna<213>artificial<400>24gtggacaacccccaccac18<210>25<211>20<212>dna<213>artificial<400>25atgagctgcacggtggaggt20<210>26<211>20<212>dna<213>artificial<400>26ccgcctgctgggcatctgcc20<210>27<211>20<212>dna<213>artificial<400>27gcatggagtcctgtggcatc20<210>28<211>20<212>dna<213>artificial<400>28gtacaggtctttgcggatgt20<210>29<211>23<212>dna<213>artificial<400>29ccttcaactccatcatgaagtgt23<210>30<211>19<212>dna<213>artificial<400>30cagcagatgtggatcagca19<210>31<211>21<212>dna<213>artificial<400>31catagtccgcctagaagcatt21<210>32<211>22<212>dna<213>artificial<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