一种检测线粒体基因组A3243G位点异质性的方法与流程

本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种检测人不同组织中线粒体基因组A3243G位点异质性的方法。

背景技术：

脑肌病伴高乳酸血症及卒中样发作综合征(MELAS)主要是由于人线粒体基因组第3243位点的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)所致(mt.3243A>G)，是人线粒体疾病中最常见的一种变现形式。除MELAS之外，mt.3243A>G位点突变也会引起MIDD或中风等多种疾病表型。研究表明，线粒体基因组突变具有异质性的特点，而由线粒体突变所引发的疾病则具有显著的阈值效应。由于客观条件和经济因素的限制，现阶段对MELAS病患者的筛选和诊断还停留在临床观察的水平，未能对患者血/细胞(或其他组织)线粒体DNA突变进行广泛、精确的基因检测。

目前对mt.3243A>G位点异质性无法快速、广泛检测的现实，传统的qPCR技术是对特定基因的表达或拷贝数进行定量，其方法包括相对定量和绝对定量。然而不管是何种方法都必须以提取细胞或组织中的核酸为前提，如基因拷贝数是以核DNA为模板，mRNA表达量是以反转录之后的cDNA第一链为模板，这些都增加了方法的复杂性。故有待提出一种新的简便有效的检测线粒体基因组A3243G位点异质性的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种新的简化的检测线粒体基因组A3243G位点异质性的方法，以至少解决现有技术中检测人不同组织中线粒体基因组A3243G位点异质性的方法复杂的技术问题。

本发明提供了一种检测线粒体基因组A3243G位点异质性的方法,包括如下步骤：

a)制备包含上述线粒体基因组A3243G位点片段的野生型和突变型载体的标准品；

b)将非核酸模板直接作为待测模板,使用实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术对A3243G位点进行单核苷酸多态性位点(SNP)分析检测，使用小沟结合物探针(MGB探针)标记。

可选的，上述非核酸模板包括白细胞、尿沉淀、唾液沉淀或毛囊。

可选的，上述步骤a)中还包括：

包含线粒体基因组A3243G位点片段基因的克隆及载体的构建；以及使用重叠聚合酶链式反应(PCR)进行定点突变，得到突变位置，设计上述突变位置的突变引物。

可选的，上述聚合酶链式反应(PCR)技术为小沟结合物探针(MGB探针)标记的定量聚合酶链式反应(定量PCR)技术，和/或上述标准品的载体是质粒或T载体。

可选的，上述标准品的载体是在大肠杆菌中增殖的克隆载体。

可选的，上述标准品的载体是pEasy-Blunting载体。

可选的，将上述野生型和上述突变型质粒的标准品配制成相同的浓度，而后等体积混合制成上述标准品原液，然后将上述标准品原液进行5至10倍倍比稀释至6至8个浓度梯度。

可选的，将上述标准品原液进行5倍倍比稀释至8个浓度梯度。

可选的，上述野生型的探针采用的是5’端绿色荧光蛋白(VIC)标记，上述突变型的探针采用的5’端羧基荧光素(FAM)标记，上述野生型的探针和上述突变型的探针的3’端均利用小沟结合物探针(MGB探针)进行标记；和/或

上述步骤b)中使用实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术对A3243G位点进行单核苷酸多态性位点(SNP)分析检测时，使用的模板为非核酸模板。

可选的，上述非核酸模板包括白细胞、尿沉淀、唾液沉淀或毛囊。

本发明提供了一种新的简化的检测线粒体基因组A3243G位点异质性的方法，以至少解决现有技术中检测人不同组织中线粒体基因组A3243G位点异质性的方法复杂的技术问题。本发明技术方案能够对MELAS患者以及MELAS非典型症状或无症状成员不同组织线粒体基因组3243位点异质性进行精确、快速的检测。人线粒体基因组3243位点异质性的精准分析，有助于澄清MELAS的临床特性与线粒体基因组中突变型基因拷贝数所占的比例(基因突变异质性水平)之间的相关性。此外，本发明利用的是MGB探针法进行定量，而非传统的TAMRA探针。MGB即小沟结合物，能够增加探针的Tm值，使其特异性更高，可精细区分模板中一个碱基间的差异，另外在体系里同时添加野生型和突变型的MGB探针，实现了对多个基因的同时定量，在结果分析中利用双标准曲线的制备，使得对mt.3243A>G位点异质性的检测更加准确。总之，利用MGB探针的qPCR方法，更加准确、便捷和高效，可以实现对特定患者不同组织中线粒体A3243G位点异质性的有效检测。

本发明技术方案克服了现有技术中对mt.3243A>G位点异质性进行检测时对检出限的确定的困难，因为在常规PCR或qPCR扩增过程中，经常会出现非特异性扩增，即使以水作为模板，也会在反应末期出现非特异的扩增曲线，因此对非特异性扩增曲线和低突变率模板的扩增曲线荧光阈值的界定便成为了现有技术的难度，而本发明在有效检测mt.3243A>G位点异质性的同时，对非特异性荧光阈值和mt.3243A>G位点突变率检出限进行了评估，充分确定了本发明的精确性和准确性。

传统的qPCR技术是对特定基因的表达或拷贝数进行定量，其方法包括相对定量和绝对定量。然而不管是何种方法都必须以提取细胞或组织中的核酸为前提，如基因拷贝数是以核DNA为模板，mRNA表达量是以反转录之后的cDNA第一链为模板。而本发明对mt.3243A>G位点异质性进行检测，可以不用提取核酸，而直接以白细胞、尿沉淀或毛囊直接作为模板，对患者mt.3243A>G位点异质性进行有效的检测，大大简化了检测方法，还有意想不到的效果。

本发明检测mt.3243A>G位点的异质性利用的是MGB探针标记的qPCR技术，该技术对特定位点突变率进行分析，需要有多种标记的探针；同时本发明一改常规PCR提取核酸DNA为模板的操作步骤，将白细胞、尿沉淀、唾液沉淀和毛囊直接作为模板并获得很好的结果，简化了检测的时长；双标曲的制备增加了对mt.3243A>G位点异质性检测的准确性；本发明确立了严格的检出限范围，即4％～4.5％突变率均可有效检出。

附图说明

图1为本发明实施例的一种可选的人线粒体基因组3243位点野生型测序结果；

图2为本发明实施例的一种可选的人线粒体基因组3243位点突变型测序结果；

图3为本发明实施例的一种可选的不同浓度梯度标准品的扩增曲线；

图4为本发明实施例的一种可选的VIC标记探针的标准曲线；

图5为本发明实施例的一种可选的FAM标记探针的标准曲线；

图6为本发明实施例的一种可选的以白细胞为模板进行qPCR检测的扩增曲线；

图7为本发明实施例的一种可选的以毛囊为模板进行qPCR检测的扩增曲线；

图8为本发明实施例的一种可选的以尿沉淀为模板进行qPCR检测的扩增曲线。

下面具体实施方式用于进一步说明但不限于本发明，下面实施例仅为本发明一种优选地实施方式。

具体实施方式

实施例1

一、外周血或组织基因组DNA的提取

1.分离外周血白细胞

(1)取患者肘静脉血5mL，EDTA抗凝，2 500rpm离心10min；

(2)小心吸去上层血浆，在下层血细胞沉淀中加入3倍体积的红细胞裂解液，摇匀，冰浴15min。

(3)2 500rpm离心10min，弃上清，重复步骤2一遍。

(4)3 000rpm离心10min，弃上清，得白细胞。

2.白细胞或组织DNA的提取

(1)取白细胞，加入600μL STE裂解缓冲液、10μL蛋白酶K和2μL RNase A,55℃消化20min(组织DNA的提取同白细胞相似，消化前先用剪刀剪碎)；

(2)待裂解液冷至室温,加入600μL的Tris-饱和酚混匀,15 000g(～12 000rpm),4℃离心10min,然后取上层液体加入另一1.5mL离心管；

(3)向上层液体中加入等体积的Tris-饱和酚/氯仿/异戊醇(25/24/1),颠倒混匀,15 000g(～12 000rpm),4℃离心10min,然后取上层液体加入另一1.5mL离心管；

(4)向上层液体中加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1),颠倒混匀,15000g(～12 000rpm),4℃离心10min,然后取上层液体加入另一1.5mL离心管；

(5)向上层液体中加入0.1倍体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和3倍体积预冷的无水乙醇,轻柔摇匀,能看到白色絮状物；

(6)小心挑取白色絮状DNA,加入到装有1mL 75％乙醇的1.5mL离心管中,15 000g(～12 000rpm),4℃离心10min,小心弃去上清,保留白色沉淀；

(7)自然干燥后,用适量的灭菌水或TE溶解；

(8)将完全溶解的基因组样品，利用Nanodrop分光光度计进行核算定量及电泳分析，并根据要求稀释工作液，-20℃冻存。

二、其他形式模板的处理，即提取核酸前的组织或细胞的处理

1.抗凝血和白细胞

方法同上,抗凝血直接混匀作为模板；白细胞计数后作为模板(约10⁴个/μL)。

2.随机尿沉淀

收集待检个体的随机尿(>5mL),8,000rpm/min,离心15min,而后弃去上清原尿,取尿沉淀作为模板。

3.毛囊组织

采样及被采样人员均进行严格无菌操作,拔取采样者头部毛囊组织,分装于1.5mL离心管内,而后进行实验。

4.唾液沉淀

被采样者于采样前30min用清水漱口,30min后收集2mL唾液样品,12,000rpm/min,离心3min,而后弃去上清,取唾液沉淀作为模板。

三、基因克隆和载体构建

1.PCR扩增

不同DNA聚合酶的反应体系和热循环条件根据各自使用说明书而定,以下是NEB公司Q5高保真聚合酶的使用方法:

上述非核酸模板可以是白细胞、尿沉淀、唾液沉淀或毛囊。

引物序列如序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示:。

反应条件为:98℃预变性30s；98℃变性10s,50～72℃退火20s,72℃延伸(30s/kb),25～35个循环；72℃终延伸2min；4℃保存。

2.PCR扩增产物和酶切片段的回收

2.1使用EasyPure PCR纯化盒子(全式金)直接纯化:

(1)将50～100μL PCR产物,加入5倍体积的BB,混匀后加入离心柱中,静置1min,10 000g室温离心1min,弃去流出液；

(2)加入650μL溶液WB,10 000g室温离心1min,弃去流出液；

(3)10 000g室温离心1～2min,去除残留的WB溶液；

(4)将离心柱置于一个干净的离心管中,加入30～50μL EB(65℃预热),室温静置1min,10 000g离心1min,洗脱出的DNA于-20℃保存。

2.2使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶纯化:

(1)将PCR产物或酶切产物进行琼脂糖电泳,待条带明显分开后,将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下,放入干净的离心管中,称量计算凝胶重量；

(2)向胶块中加入1倍体积Buffer PG(如凝胶重为100mg,其体积可视为100μL),55℃水浴中,彻底溶解胶块；

(3)柱平衡:向已装入收集管中的吸附柱(Spin Columns DM)中加入200μL Buffer PS,13 000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中；

(4)将步骤2所得溶液加入到吸附柱中,室温放置2min,13 000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放回收集管中；

(5)向吸附柱中加入450μL Buffer PW,13 000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放回收集管中,再重复一次；

(6)13 000rpm离心1min,弃滤液；

(7)将吸附柱置于一个干净的离心管中,加入30～50μL Buffer EB(65℃预热),室温静置2min,13 000rpm离心1min,洗脱出的DNA于-20℃保存。

3.连接反应

pEASY-Blunting载体(全式金)的连接:

连接体系如下:

轻轻混合上述反应液,25℃反应10～15min。反应结束后,将离心管置于冰上。

4.转化

(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞(50μL),冰上融化,将5μL连接产物加入其中,冰浴30min；

(2)42℃水浴热激30s,立即置入冰上1～2min,加入700μL LB液体培养基,37℃振荡复苏60min；

(3)4 000rpm离心5min,弃去650μL上清,吹匀后铺于LB平板上,平板含0.1％(V/V)的氨苄青霉素或卡那霉素,37℃恒温培养10～15h。

5.菌落PCR鉴定

(1)用灭菌的白枪头挑取转化后的单克隆菌落在新鲜的含抗生素平板上划线后,将白枪头在配好的PCR反应液中涮洗后拿出；

(2)PCR反应液置于PCR仪上进行PCR反应扩增；

(3)产物用1～2％琼脂糖进行电泳检测,鉴定出阳性单克隆菌落,扩大培养后进行测序鉴定,测序无误的菌液用于下一步的质粒提取。

6.质粒提取

质粒DNA小量提取:

(1)取1～5mL过夜培养的菌液加入离心管中,13 000rpm离心30s收集菌体沉淀,尽量弃尽上清；

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL Buffer P1(含RNase A),使用移液器或涡旋振荡器充分混匀；

(3)向离心管中加入250μL Buffer P2,温和地上下颠倒混匀4～6次,静置1～2min至溶液应变得清亮粘稠；

(4)向离心管中加入350μL Buffer N3,立即温和地上下颠倒混匀8～10次,静置5min,13 000rpm离心10min；

(5)将步骤3中所得的上清液转移到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中,13 000rpm离心30s,弃废液；

(6)向吸附柱中加入500μL Buffer PB,13 000rpm离心30s,弃废液；

(7)向吸附柱中加入700μL Buffer PW,13 000rpm离心1min,弃废液,再重复一次；

(8)13 000rpm离心1min,弃滤液；

(9)将吸附柱置于一个干净的离心管中,加入50～100μL Buffer EB(65℃预热),室温静置2min,13 000rpm离心1min,洗脱出的质粒进行核算定量后于-20℃保存。

7.PCR-RFLP鉴定

将PCR产物利用Apa I进行酶切鉴定，酶切反应体系如下:

25℃酶切2h，利用2％的琼脂糖凝胶电泳分型。

四、定点突变(重叠PCR法)

针对特定突变位置,设计相应突变引物,利用常规PCR技术扩增得到包含突变位点的上、下游目的片段,目的片段分别胶回收后进行融合PCR反应,第一步反应体系如下:

Q5酶进行10个循环的扩增反应,第二步反应体系如下:

Q5酶再进行33个循环反应,产物经胶回收纯化后,进行载体构建。

定点突变引物如序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：64所示。

构建好的载体进行PCR-RFLP和测序鉴定，人线粒体基因组3243位点野生型测序结果如图1所示，人线粒体基因组3243位点野生型序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；人线粒体基因组3243位点突变型测序结果如图2所示，人线粒体基因组3243位点突变型序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

五、标准品的制备

(1)将包含线粒体基因组3243位点片段的野生型和突变型质粒，稀释成相同浓度；

(2)各取5μg质粒进行等质量混合，以此作为标准品原液，标记为1号；

(3)再取7个0.2mL的Ep管，分别标记为2、3、4、5、6、7、8号，并向各管中加入40μL去离子水；

(4)吸取步骤2中标准品原液10μL加入到2号管内，振荡混匀后，吸取10μL加入到3号管内，依此类推，对标准品进行5倍倍比稀释，直至8号管；

(5)将8管标准品相同条件小心放存。

以上标准品涉及到质粒拷贝数的计算，其计算公式如下:

拷贝数(copies/mL)＝质粒浓度(g/mL)×阿伏伽德罗常数/质粒分子质量；

质粒分子质量＝一个碱基对的平均分子质量×碱基数目

六、实时定量PCR技术进行SNP分析检测

1.定量PCR(qPCR)

反应体系如下:

上述反应体系中的模板为组织或细胞，可以是白细胞、尿沉淀、唾液沉淀或毛囊。

程序设计时选择TaqMan探针法，对所需荧光进行选择添加，反应条件为:94℃预变性30s；94℃5s,60℃30s,共40个循环。每个样品设3孔重复。荧光定量PCR仪根据不同的荧光标记强度自动得出野生型和突变型的域值循环数(Ct)，计算其差异(ΔCt)，之后与已知突变率为50％的DNA溶液进行标化得出ΔΔCt，原液中突变型与野生型DNA拷贝数的比率即为2^-ΔΔCt，由此可得出突变异质性的比例。

线粒体基因组3243位点的定量引物如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，探针序列如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

2.qPCR探针的剂量依赖性验证

为了更真实地反应野生型和突变型探针的结合效率,对本发明中所用的qPCR探针进行dose-dependent验证,即标准曲线构建,检测方法如下:以所制备的8个浓度梯度的标准品为模板，用待验证的探针进行定量PCR实验，不同浓度梯度标准品的扩增曲线如图3所示,建立基因拷贝数(Log值)和相应Ct值的标准曲线，VIC标记探针的标准曲线如图4所示，FAM标记探针的标准曲线如图5所示,通过R²值反应不同探针的有效性。七、非核酸模板的实验分析

(1)以健康人白细胞直接作为模板,在10μL扩增体系中分别添加4μL、3μL、2μL、1μL白细胞进行qPCR检测(经细胞计数后,待测样品的白细胞数目为3～7×10⁴个/μL)；

(2)以健康人随机尿沉淀(来自5mL原尿)直接作为模板,在10μL扩增体系中分别添加4μL、3μL、2μL、1μL随机尿沉淀进行qPCR检测；

(3)以健康人毛囊组织直接作为模板,在10μL扩增体系中分别添加4根、3根、2根、1根毛囊组织进行qPCR检测；

结果显示:

(1)在10μL扩增体系中,以白细胞(1μL～4μL)或随机尿沉淀(1μL～3μL)为模板进行qPCR检测,均可得到质量很好的扩增曲线,相应Ct值也处于合适理想范围内，以白细胞为模板进行qPCR检测的扩增曲线如图6所示，以尿沉淀为模板进行qPCR检测的扩增曲线如图8所示,其中以白细胞为模板,其批内变异显示0.27≤CV批内(％)≤7.53；

(2)在10μL扩增体系中,以毛囊组织(1～4根)为模板进行qPCR检测,扩增曲线相对完好，以毛囊为模板进行qPCR检测的扩增曲线如图7所示,相应Ct值也处于合适理想范围内。

由上述实施例可知，本发明技术方案一改常规PCR提取核酸DNA为模板的操作步骤，将白细胞、尿沉淀或毛囊直接作为模板并获得很好的结果，特别是将实时定量PCR技术进行SNP分析检测中反应体系的模板直接简化为非核酸模板，可以是白细胞、尿沉淀或毛囊，取得了意想不到的和用核酸作为模板时的效果，大大简化了检测的时长。

序列表

<110> 北京中科唯新生物医学研究所有限公司

<120> 一种检测线粒体基因组A3243G位点异质性的方法

<130> ZW17013-I

<141> 2017-12-30

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 494

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(494)

<223> 人线粒体基因组3243位点野生型序列

<400> 1

cctccctgta cgaaaggaca agagaaataa ggcctacttc acaaagcgcc ttcccccgta 60

aatgatatca tctcaactta gtattatacc cacacccacc caagaacagg gtttgttaag 120

atggcagagc ccggtaatcg cataaaactt aaaactttac agtcagaggt tcaattcctc 180

ttcttaacaa catacccatg gccaacctcc tactcctcat tgtacccatt ctaatcgcaa 240

tggcattcct aatgcttacc gaacgaaaaa ttctaggcta tatacaacta cgcaaaggcc 300

ccaacgttgt aggcccctac gggctactac aacccttcgc tgacgccata aaactcttca 360

ccaaagagcc cctaaaaccc gccacatcta ccatcaccct ctacatcacc gccccgacct 420

tagctctcac catcgcactt ctactatgaa cccccctccc catacccaac cccctggtca 480

acctcaacct aggc 494

<210> 2

<211> 494

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(494)

<223> 人线粒体基因组3243位点突变型序列

<400> 2

cctccctgta cgaaaggaca agagaaataa ggcctacttc acaaagcgcc ttcccccgta 60

aatgatatca tctcaactta gtattatacc cacacccacc caagaacagg gtttgttaag 120

atggcagggc ccggtaatcg cataaaactt aaaactttac agtcagaggt tcaattcctc 180

ttcttaacaa catacccatg gccaacctcc tactcctcat tgtacccatt ctaatcgcaa 240

tggcattcct aatgcttacc gaacgaaaaa ttctaggcta tatacaacta cgcaaaggcc 300

ccaacgttgt aggcccctac gggctactac aacccttcgc tgacgccata aaactcttca 360

ccaaagagcc cctaaaaccc gccacatcta ccatcaccct ctacatcacc gccccgacct 420

tagctctcac catcgcactt ctactatgaa cccccctccc catacccaac cccctggtca 480

acctcaacct aggc 494

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> mtDNA-3243-F1

<400> 3

ctccctgtac gaaaggacaa gagaa 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> mtDNA-3243-R1

<400> 4

tatggggagg ggggttcata gta 23

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> mtDNA-3243-F2

<400> 5

gaacagggtt tgttaagatg gcagggccc 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> mtDNA-3243-R2

<400> 6

taagttttat gcgattaccg ggccctgcc 29

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> mtDNA-3243-F3

<400> 7

attataccca cacccaccca agaac 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> mtDNA-3243-R3

<400> 8

atgggtacaa tgaggagtag gaggt 25

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(14)

<223> 5'端为VIC,3'端为MGB

<400> 9

ccgggctctg ccat 14

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(14)

<223> 5'端为6FAM,3'端为MGB

<400> 10

ccgggccctg ccat 14