施用工程化T细胞以治疗中枢神经系统中的癌症的制作方法

已经对抗肿瘤治疗研究了基于肿瘤特异性t细胞的免疫疗法，包括使用工程化t细胞和离体扩增或选择的t细胞的疗法。在一些情况下，用于此类疗法的t细胞在体内不能保持有活性达足够长的时间段。在一些情况下，t细胞的肿瘤特异性相对较低。在一些情况下，工程化t细胞不能充分接近肿瘤。因此，本领域需要具有更有效的抗肿瘤功能的肿瘤特异性癌症疗法。

治疗中枢神经系统癌症可以特别具有挑战性。例如，高级恶性胶质瘤(mg)，包括间变性星形细胞瘤(anaplasticastrocytoma)(aa级iii)和多形性胶质母细胞瘤(gbm级iv)的治疗仍然是重要的治疗挑战。目前可用的治疗选择具有有限的治愈潜力，并且在初始诊断后仅小于5％的患者存活超过五年。

发明概述

本文描述了通过向患者的脑脊液(“csf”)施用包含t细胞(例如，cart细胞，肿瘤浸润性淋巴细胞(“til”)，tcr工程化t细胞或t细胞克隆)的组合物来治疗中枢神经系统中的恶性肿瘤的方法。t细胞包括已经通过例如导入表达期望受体的核酸分子，通过离体扩增分离的或遗传修饰的t细胞或通过离体选择从患者或供体获得的t细胞亚组或者通过这些技术中两种或更多种的组合操作的t细胞。对cns的施用可以通过例如施用到脑室系统或脊柱的中央腔来完成。对cns的施用在该术语在本文中使用时不同于瘤内施用(注射或输注到肿瘤本身中)和施用于通过切除肿瘤创建的腔两者。然而，本文描述的cns施用方法可以与瘤内/或切除后腔内施用组合。

本文所述的cns施用允许在单次输注中输注相对大体积的包含t细胞的组合物，例如1ml-2ml或更多。因此，可以在单次输注中施用数百万个t细胞。

因此，公开了治疗诊断为中枢神经系统恶性肿瘤的患者的方法，其包括将包含有效量t细胞的组合物输注到诊断为中枢神经系统恶性肿瘤的患者的解剖学区室，含有脑脊液的解剖学区室(“csf”)中。该方法包括例如将组合物输注到脑室系统或脊髓中央管的一部分中。在公开方法的一个实施方案中，中枢神经系统恶性肿瘤包括在中枢神经系统中某处发现的原发性肿瘤或转移性肿瘤，包括脑的一部分，脊柱等。优选地，解剖学区室包含至少约50，100或150ml连续体积的脑脊液。

在本文描述的方法中输注的操作的t细胞靶向肿瘤抗原，例如表面蛋白和细胞内蛋白。所治疗的恶性肿瘤可以是原发性肿瘤或源自身体别处的癌症的继发性肿瘤。因为对脑脊液的施用允许t细胞进入超出局部注射部位的区域，所以本文所述的方法可以用于攻击和减小远离注射部位但在cns内的肿瘤的大小。通过将tcrαβ基因导入t细胞(例如自体t细胞)，然后离体扩增t细胞来制备tcr工程化的t细胞；并将t细胞输注到患者中。输注tcr工程化的t细胞对患者赋予肿瘤反应性，所述患者的肿瘤表达适当抗原和hla限制性元件。可以将tcr靶向到多种肿瘤抗原中的任一种，包括例如由t细胞1(mart-1)识别的黑素瘤相关抗原，糖蛋白(gp)100，癌胚抗原(cea)，p53，黑素瘤相关抗原(mage-a3，和纽约食管鳞状细胞癌抗原(nyeso))。

本文描述了治疗诊断为中枢神经系统恶性肿瘤的患者的方法，包括向患者的脑脊液(csf)中导入包含有效量t细胞的组合物。

在各个实施方案中：t细胞是自体或同种异体t细胞；通过以下一种或多种离体操作t细胞：扩增，分级或用重组核酸分子转染；t细胞包含已经用编码结合肿瘤细胞抗原的多肽的重组核酸分子转染的细胞；多肽是嵌合抗原受体；室内施用组合物；将组合物施用脊髓中央管；施用是对左脑室或右脑室；该组合物包含至少1x10⁶个细胞；包含t细胞的组合物施用至少两次；所述施用在施用的t细胞总数上不同；施用在剂量上逐渐升高；施用在剂量上逐渐降低；t细胞包含cart细胞；t细胞包含自体肿瘤浸润性淋巴细胞；t细胞包含tcr工程化的t细胞；恶性肿瘤是弥漫性浸润性肿瘤；恶性肿瘤是原发性脑肿瘤；一个或多个肿瘤灶的大小减少至少25％；恶性肿瘤源自选自以下的原发性癌症：乳腺癌，肺癌，头和颈癌和黑色瘤；该方法在肿瘤切除后进行；该方法还包括瘤内施用包含t细胞的组合物；恶性肿瘤是继发性脑肿瘤；该方法还包括瘤内施用包含表达嵌合抗原受体的治疗性t细胞的组合物，所述嵌合抗原受体结合在胶质母细胞瘤细胞表面上表达的蛋白质；患者先前已经经历肿瘤损伤的切除；肿瘤抗原选自：il13rα2，her2，psca，egfr，egfrviii，epha2，ny-eso-1和cd19；t细胞包含cd4+细胞和cd8+细胞两者；t细胞已经经历离体扩增；t细胞包含至少10％的tcm细胞；输注的细胞中至少40％，50％，60％，70％或更多是cd4+；输注的细胞中至少至少40％，50％，60％，70％或更多表达靶向肿瘤抗原(例如，il13rα2)的细胞表面受体；细胞剂量基于表达靶向肿瘤抗原(例如il13rα2)的细胞表面受体的输注细胞的数目。

在一些实施方案中，t细胞包含靶向il13rα2的cart细胞，并且细胞包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含：人il-13或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、cd8跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、cd28跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体和cd3ζ跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；至少一个共刺激域；以及cd3ζ信号传导域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体。在一些实施方案中：共刺激域选自：cd28共刺激域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、4ibb共刺激域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；人il13的变体具有1-10个氨基酸修饰，其增加对il13rα2相对于对il13rα1的结合特异性；人il-13或其变体是il-13变体，其包含具有1至5个氨基酸修饰的seqidno：3的氨基酸序列，条件是seqidno：3的位置11处的氨基酸与e不同；嵌合抗原受体包含选自下组的两种不同的共刺激域：cd28共刺激域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、4ibb共刺激域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；嵌合抗原受体包含选自下组的两种不同的共刺激域：cd28共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、4ibb共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；嵌合抗原受体包括：人il-13或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、cd8跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、cd28跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体和cd3ζ跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；共刺激域；和cd3ζ信号传导域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；car包含位于il-13或其变体与跨膜域之间的间隔物区；所述间隔物区包含选自seqidno：4、14-20、50和52的氨基酸序列；嵌合抗原受体包含选自seqidno：10和31-48的氨基酸序列。

在一些实施方案中，t细胞表达结合her2的嵌合抗原受体，包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含：her2靶向域；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、cd8跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、cd28跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体和cd3s跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；选自以下的共刺激域：cd28共刺激域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体和4-ibb共刺激域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；和cd3s信号传导域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体。在某些实施方案中：her2靶向域是her2scfv；her2scfv包含氨基酸序列：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikgstsgggsgggsggggssevqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvss(seqidno：49)或其具有1至5个氨基酸修饰的变体；嵌合抗原受体包含：her2靶向序列；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、cd8跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、cd28跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体和cd3s跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；选自以下的共刺激域：cd28共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体和4-ibb共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；和cd3信号传导域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；核酸分子表达包含选自seqidno：26和27的氨基酸序列的多肽或其具有1-5个氨基酸修饰的变体。

本文还描述了治疗诊断为中枢神经系统恶性肿瘤的患者的方法，包括将包含有效量t细胞的组合物输注到诊断为中枢神经系统恶性肿瘤的患者的解剖学区室，含有脑脊液(csf)的解剖学区室中。在各个实施方案中：解剖学区室包括脑室系统的一部分；解剖学区室包括脊髓中央管的一部分；中枢神经系统恶性肿瘤包括脑肿瘤；中枢神经系统恶性肿瘤包括转移性肿瘤；解剖学区室含有至少约50ml连续体积的脑脊液；解剖学区室含有至少约100ml连续体积的脑脊液；并且解剖学区室含有至少约150ml连续体积的脑脊液。

可以通过本文描述的方法治疗的癌症是例如原发性cns恶性肿瘤和源自位于别处的癌症的继发性恶性肿瘤，例如急性成淋巴细胞性白血病(all)，急性髓样白血病(aml)，肾上腺皮质癌，癌(carcinoma)，aids相关癌症，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，非典型畸胎样/杆状瘤，中枢神经系统，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，中枢神经系统癌，宫颈癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞性白血病(cll)，慢性髓性白血病(cml)，慢性骨髓增生性疾病，结肠癌，结肠直肠癌，颅咽管瘤，皮肤t细胞淋巴瘤，胚胎肿瘤，中枢神经系统，子宫内膜癌，室管膜母细胞瘤，室管膜瘤，食道癌，成感觉神经细胞瘤，尤因肉瘤肿瘤家族，颅外胚细胞瘤，性腺外胚细胞瘤，肝外胆管癌，眼癌，骨纤维组织细胞瘤，恶性和骨肉瘤，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，胃肠道间质瘤(gist)-见软组织肉瘤，胚细胞瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，胶质瘤，毛细胞白血病，头和颈癌，心脏癌，肝细胞癌(肝)癌，组织细胞增多症，何杰金淋巴瘤，下咽癌，眼内黑素瘤，胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)，卡波西肉瘤，肾癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，喉癌，白血病，唇和口腔癌，肝癌(原发性)，小叶原位癌(lcis)，肺癌，淋巴瘤，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤，髓母细胞瘤，髓上皮瘤，黑色瘤，merkel细胞癌，间皮瘤，转移性鳞状颈癌伴涉及nut基因的隐匿性原发性中线癌，口腔癌，多发性内分泌新生物综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞新生物，蕈样肉芽肿病，骨髓增生异常综合征，脊髓发育不良/骨髓增生新生物，髓性白血病，慢性(cml)，髓样白血病，急性(aml)，骨髓瘤，多发性，骨髓增生病症，鼻腔和鼻旁窦癌症，鼻咽癌，成神经细胞瘤，非何杰金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口癌，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌，胰腺癌，乳头状瘤病，副神经节瘤，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，中间分化的松果体实质肿瘤，成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，浆细胞新生物/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，妊娠和乳腺癌，原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞(肾)癌，肾盂和输尿管，移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，肉瘤，塞扎里(sézary)综合征，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，鳞状颈癌，胃癌，幕上原始神经外胚层肿瘤，t-细胞淋巴瘤，皮肤，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋养细胞瘤，输尿管和肾盂癌，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，巨球蛋白血症和wilms肿瘤。

在一些实施方案中，根据公开的方法治疗的恶性肿瘤包括肿瘤。在一些实施方案中，治疗导致肿瘤体积减少至少50％，肿瘤体积减少至少60％，肿瘤体积减少至少70％，肿瘤体积减少至少80％，或至少肿瘤体积减少90％。并且在一些实施方案中，治疗导致消除恶性肿瘤。

在一些实施方案中，患者不经历任何3级或更高的毒性。

在一些实施方案中，在用包含有效量的t细胞的组合物治疗之前给患者施用类固醇方案，并且在一些实施方案中，在治疗后将类固醇方案降低至较低剂量。

在一些实施方案中，与接受护理标准治疗的患者相比所述患者具有增加的寿命预期，所述护理标准治疗包括放射疗法、小分子药物疗法、抗体疗法或其组合。并且在一些实施方案中，其中接受标准治疗(“soc”)治疗的患者可以预期从初始诊断起存活约15个月(总体存活或os)，接受所公开的治疗的患者可以预期15，20，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36个月或更多的os。在一些实施方案中，接受要求保护的治疗的患者可以预期42，48，54，60，66，72，78，84，90个月或更多的os。

在一些实施方案中，组合物包含至少2x10⁶个t细胞或2x10⁶个表达靶向肿瘤抗原的细胞表面受体的t细胞，而在一些实施方案中，所述组合物包含至少1x10⁶个t细胞或1x10⁶个表达靶向肿瘤抗原的细胞表面受体的t细胞。在一些实施方案中，组合物包含至少5x10⁶个t细胞或5x10⁶个表达靶向肿瘤抗原的细胞表面受体的t细胞，而在一些实施方案中，该组合物包含至少10x10⁶个t细胞或10x10⁶个表达靶向肿瘤抗原的细胞表面受体的t细胞。在一些实施方案中，所公开的方法包括重复施用组合物，例如重复施用组合物至少五次，重复施用组合物至少十次，或重复施用直至患者接受总剂量至少90x10⁶个t细胞或表达靶向肿瘤抗原的细胞表面受体的t细胞。在一些实施方案中，施用每周重复一次或每两周重复一次。在一些实施方案中，重复施用在15周的过程内持续。

本文还公开了增加患者的脑脊液(csf)中至少一种细胞因子或趋化因子水平的方法，其包括将包含有效量的t细胞的组合物施用到患有中枢神经系统恶性肿瘤的患者的csf，其中与所述施用前的所述至少一种细胞因子或趋化因子的基线水平相比在施用所述包含有效量的t细胞的组合物后所述csf中至少一种细胞因子或趋化因子的水平升高。

在所公开方法的一些实施方案中，与所述基线水平相比所述施用后所述csf中所述至少一种细胞因子或趋化因子的水平升高10倍或5倍。

在一些实施方案中，与所述施用前至少5种细胞因子或趋化因子的基线水平相比施用所述包含有效量的t细胞的组合物后至少5种细胞因子或趋化因子的水平升高。在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子包括egf，嗜酸细胞活化趋化因子，fgf，g-csf，gm-csf，hgf，ifn-α，ifn-γ，il-10，il-12，il-13，il-15，il-17，il-1rα，il-1β，il-2，il-2r，il-4，il-5，il-6，il-7，il-8，ip-10，mcp-1，mig，mip-1α，mip-1β，rantes，tnf-α，或vegf。在一些实施方案中，细胞因子或趋化因子表达的增加是局部增加(即，对csf特异)。

本文还公开了在诊断为中枢神经系统恶性肿瘤的患者的脑脊液(csf)中观察到的与基线数目相比增加的t细胞数目维持至少约5天的方法，包括将有效量的t细胞输注到诊断为中枢神经系统恶性肿瘤的患者的csf中，其中与输注步骤之前观察到的基线数目相比观察到的增加的t细胞数目持续至少约5天。

在一些实施方案中，有效量的t细胞(或表达靶向肿瘤抗原的细胞表面受体的t细胞)的范围为约1x10⁶个细胞至约100x10⁶个细胞，并且在一些实施方案中，t细胞的有效量的范围从约2x10⁶个细胞到约50x10⁶个细胞。

在一些实施方案中，观察到的增加的t细胞数目维持至少约6天，或观察到的t细胞数目不恢复到所述基线数目达约7天。

在一些实施方案中，观察到的t细胞包括输注的t细胞(例如，表达car的t细胞)，并且在一些实施方案中，观察到的t细胞包括内源性t细胞。

本文还公开了增加患者脑脊液(csf)中t细胞数目的方法，包括将包含有效量t细胞的组合物施用到患有中枢神经系统恶性肿瘤的患者的csf中，其中与施用前水平相比，csf中可检测的t细胞数目增加。

在一些实施方案中，与施用前水平相比施用后csf中可检测的t细胞的数目增加长达7天。在一些实施方案中，csf中可检测的t细胞包含内源性t细胞和表达car的t细胞，和/或1型t细胞和/或2型t细胞。

在一些实施方案中，csf中可检测的t细胞包含cd3+t细胞，并且在一些实施方案中，csf中可检测的t细胞包含cd14+cd11b+hla-dr+成熟髓样群体。在一些实施方案中，在施用组合物后，在csf中可检测到cd19+b细胞和cd11b+cd15+粒细胞。

在一些实施方案中，在施用组合物后，在csf中可检测到反应性淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞。

本文还公开了确定诊断为恶性肿瘤的患者对用il-13rα2特异性cart细胞治疗的适合性的方法，其包括确定归因于来自所述患者的样品的评分是否表现出高于预先确定阈值的il-13rα2表达。

在一些实施方案中，通过测定来自诊断为恶性肿瘤的患者的切除肿瘤样品的免疫反应性计算归因于所述样品的评分，其通过用il-13rα2标志物对所述样品进行免疫组织化学染色，分析所述染色的强度，并基于所述染色强度计算评分得到，其中对应于所述样品中的中等至强染色强度的评分指示用il-13rα2特异性cart细胞治疗适合于所述患者。在一些实施方案中，评分包括计数具有弱，中等或强染色强度的细胞数目，并且为每个强度分配权重(h评分，定量免疫组织化学结果的方法基于以下公式：(3x强染色细胞的百分比)+(2x中等染色细胞的百分比)+(1x弱染色细胞的百分比)，导致0至300的范围)。在一些情况下，患者具有h评分，其为：对于相关的肿瘤相关抗原，大于50、50-100、大于100、100-200、大于200、100-300或大于250。在一些实施方案中，还通过免疫组织化学染色确定样品中ki67的表达。

本文还公开了治疗患有恶性肿瘤的患者的方法，包括向诊断为恶性肿瘤的患者施用包含有效剂量的il-13rα2特异性cart细胞的组合物，其中所述患者表达高于预先确定阈值的il-13rα2。

在一些实施方案中，il-13rα2表达的预先确定阈值先前鉴定为适合于包含il-13rα2特异性cart细胞疗法的治疗。

til是肿瘤浸润性淋巴细胞，其可以从患者或供体分离，离体扩增并再输注到有此需要的患者中。

cart细胞表达嵌合t细胞受体，其包含胞外域，跨膜区和胞内信号传导域。胞外域包括结合靶定细胞的部分和任选地间隔物，其包含例如人fc域的一部分。跨膜部分包括合适的跨膜域，例如cd4跨膜域，cd8跨膜域，cd28跨膜域，cd3跨膜域或4ibb跨膜域。胞内信号传导域包括来自人cd3复合物的zeta链(cd3ζ)的信号传导域和一个或多个共刺激域，例如4-1bb共刺激域。胞外域的靶细胞结合部分(例如scfv或配体)使得car在t细胞表面上表达时能够将t细胞活性引导至表达靶定细胞表面分子(例如her2或il13rα2，在肿瘤细胞，包括恶性胶质瘤细胞表面上表达的受体)的那些细胞。

可以工程化改造多种不同的t细胞，例如患者特异性的自体t细胞以表达tcr或car。可以使用各种t细胞亚组。此外，car可以在其他免疫细胞如nk细胞中表达。当患者用表达car或tcr的免疫细胞治疗时，细胞可以是自体或同种异体t细胞。在某些情况下，使用的细胞是cd4+和cd8+中枢记忆t细胞(tcm)，它们是cd45ro+cd62l+，并且与使用其他类型的患者特异性t细胞相比，使用此类细胞可以改善过继转移后细胞的长期持久性。tcm细胞可以包括cd4+细胞和cd8+细胞。

在本文描述的方法中有用的car是靶向il13rα2的car。此类car可包括具有增加结合特异性的氨基酸修饰，例如e13y突变的il13。

本文所述方法中使用的t细胞可以含有编码嵌合抗原受体(car)的核酸分子，其中嵌合抗原受体包含：人il-13或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体，cd8跨膜域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体，cd28跨膜域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体，以及cd3ζ跨膜域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体；共刺激域；和cd3ζ信号传导域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体。

在胞内区域中包含与cd3ζ串联的共刺激域，例如4-1bb(cd137)或cd28共刺激域使得t细胞能够接收共刺激信号。因此，在各个实施方案中，共刺激域选自：cd28共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体，4-ibb共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体。在某些实施方案中，存在4ibb共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体。

在方法的其他实施方案中，由t细胞表达的car包含：具有1-10个氨基酸修饰的人il13的变体，所述氨基酸修饰增加对il13rα2相对于对il13rα1的结合特异性；人il-13或其变体是il-13变体，其包含seqidno：3的具有1至5个氨基酸修饰的氨基酸序列，条件是seqidno：3的第11位氨基酸除e外；选自下组的两种不同的共刺激域：cd28共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体，4ibb共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体；选自下组的两种不同的共刺激域：cd28共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，4ibb共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；人il-13或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、cd8跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、cd28跨膜域或其具有1-2个氨基酸的变体修饰，以及cd3ζ跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；共刺激域；和cd3ζ信号传导域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；位于il-13或其变体与跨膜域之间的间隔物区(例如，间隔物区包含选自seqidno：4，14-20，50和52的氨基酸序列)；间隔物区包含igg铰链区；间隔物区包含10-150个氨基酸；4-1bb信号传导域包含seqidno：6的氨基酸序列；cd3ζ信号传导域包含seqidno：7的氨基酸序列；和3至15个氨基酸的接头，其位于共刺激域和cd3ζ信号传导域或其变体之间。在存在两个共刺激域的某些实施方案中，一个是4-ibb共刺激域，并且另一个是选自以下的共刺激域：cd28和cd28gg。

在本文所述方法的一些实施方案中，t细胞含有表达多肽的核酸分子，所述多肽包含选自seqidno：10和31-48的氨基酸序列；嵌合抗原受体包含含有seqidno：11的氨基酸的il-13/igg4/cd4t/41-bb区和含有seqidno：7的氨基酸序列的cd3ζ信号传导域；并且嵌合抗原受体包含seqidno：10和31-48的氨基酸序列。

还公开了包括室内施用由包含编码嵌合抗原受体的表达盒的载体转导的人t细胞群体的方法，其中嵌合抗原受体包含：人il-13或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，cd8跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，cd28跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，和cd3ζ跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；共刺激域；和cd3ζ信号传导域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体。在各个实施方案中：人t细胞群体包含表达嵌合抗原受体的载体，所述嵌合抗原受体包含选自seqidno：10和31-48的氨基酸序列；人t细胞群体由中枢记忆t细胞(tcm细胞)组成(例如，至少20％，30％，40％，50％60％，70％，80％的细胞是tcm细胞；至少10％，15％，20％，25％，30％或35％的t细胞或tcm细胞是cd4+且至少10％，15％，20％，25％，30％或35％细胞或tcm细胞是cd8+细胞)。

还描述了治疗患者中的癌症的方法，其包括由包含编码嵌合抗原受体的表达盒的载体转导的自体或同种异体人t细胞群体(例如，包含tcm细胞的自体或同种异体t细胞，例如，至少20％，30％，40％，50％60％，70％，80％的细胞是tcm细胞；至少15％，20％，25％，30％，35％的tcm细胞是cd4+并且至少15％，20％，25％，30％，35％的tcm细胞是cd8+细胞)的cns施用，其中嵌合抗原受体包含选自seqidno：10和31-48的氨基酸序列。在各个实施方案中：人t细胞群体包含中枢记忆t细胞；癌症是胶质母细胞瘤；转导的人t细胞通过包括从患者获得t细胞，处理t细胞以分离中枢记忆t细胞，并用包含编码嵌合抗原受体的表达盒的病毒载体转导至少一部分中央记忆细胞的方法制备，其中嵌合抗原受体包含选自seqidno：10和31-48的氨基酸序列。

还描述了对患者施用的t细胞含有编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与选自seqidno：10和seqidno：31-48的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；编码多肽的核酸分子，所述多肽包含除不超过5个氨基酸取代，缺失或插入的存在以外与选自seqidno：10和31-48的氨基酸序列相同的氨基酸序列；编码多肽的核酸分子，所述多肽包含除不超过5个氨基酸取代的存在以外与选自seqidno：10和seqidno：10和31-48的氨基酸序列相同的氨基酸序列；和编码多肽的核酸分子，所述多肽包含除不超过2个氨基酸取代的存在以外与选自seqidno：10和seqidno：10和31-48的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

本文描述了通过csf施用携带编码嵌合抗原受体(car)的核酸分子的t细胞来治疗患者的方法，其中嵌合抗原受体包含靶向her2的scfv(例如，包含氨基酸序列diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikgstsgggsgggsggggssevqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvss；seqidno：49)或具有1-10(例如1或2)个氨基酸修饰的变体；间隔物区；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体，cd8跨膜域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体，cd28跨膜域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体，以及cd3ζ跨膜域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体；共刺激域；和cd3ζ信号传导域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体。

在各个实施方案中，共刺激域选自下组：cd28共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体，4-ibb共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体。在某些实施方案中，存在4ibb共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体。

在另外的实施方案中，施用于患者的t细胞表达car，其包含：靶向her2的scfv(例如，人源化scfv)；选自下组的两种不同的共刺激域：cd28共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体，4ibb共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-10(例如，1或2)氨基酸修饰的变体；选自下组的两种不同的共刺激域：cd28共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，4ibb共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；人il-13或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、cd8跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体、cd28跨膜域或其具有1-2个氨基酸的变体修饰，以及cd3ζ跨膜域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；共刺激域；和cd3ζ信号传导域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；位于il-13或其变体与跨膜域之间的间隔物区(例如，间隔物区包含选自seqidno：4，14-20，50和52的氨基酸序列)；间隔物区包含igg铰链区；间隔物区包含10-150个氨基酸；4-1bb信号传导域包含seqidno：6的氨基酸序列；cd3ζ信号传导域包含seqidno：7的氨基酸序列；和3至15个氨基酸的接头，其位于共刺激域和cd3ζ信号传导域或其变体之间。在存在两个共刺激域的某些实施方案中，一个是4-ibb共刺激域，而另一个是选自以下的共刺激域：cd28和cd28gg。

在一些实施方案中，对患者施用的t细胞含有表达包含选自seqidno：53-56的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

还公开了包括室内施用由载体转导的人t细胞群体的方法，所述载体包含编码嵌合抗原受体的表达盒，所述嵌合抗原受体包含：靶向her2的scfv；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，cd8跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，cd28跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，和cd3ζ跨膜域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；共刺激域；和cd3ζ信号传导域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体。在各个实施方案中：人t细胞群体包含表达嵌合抗原受体的载体，所述嵌合抗原受体包含选自以下的氨基酸序列：seqidno：53-56；人t细胞群体包含中枢记忆t细胞(tcm细胞)(例如，至少20％，30％，40％，50％60％，70％，80％的细胞是tcm细胞；至少10％，15％，20％，25％，30％，35％的t细胞或tcm细胞是cd4+和/或至少10％，15％，20％，25％，30％，35％的t细胞或tcm细胞是cd8+细胞)。

还描述了治疗患者中的癌症的方法，其包括由包含编码嵌合抗原受体的表达盒的载体转导的自体或同种异体人t细胞群体(例如，包含tcm细胞的自体或同种异体t细胞，例如，至少20％，30％，40％，50％60％，70％，80％的细胞是tcm细胞；至少15％，20％，25％，30％，35％的tcm细胞是cd4+并且至少15％，20％，25％，30％，35％的tcm细胞是cd8+细胞)的室内施用，其中嵌合抗原受体包含选自seqidno：53-56的氨基酸序列。在各个实施方案中：人t细胞群体包含中枢记忆t细胞；癌症是胶质母细胞瘤；转导的人t细胞通过包括从患者获得t细胞，处理t细胞以分离中枢记忆t细胞，并用包含编码嵌合抗原受体的表达盒的病毒载体转导至少一部分中央记忆细胞的方法制备，其中嵌合抗原受体包含选自seqidno：53-56的氨基酸序列。

还描述了治疗患者中的癌症的方法，包括室内施用自体或同种异体人t细胞群体(例如，包含tcm细胞的自体或同种异体t细胞，所述tcm细胞含有：编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与选自seqidno：53-56的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；编码多肽的核酸分子，所述多肽包含除不超过5个氨基酸取代，缺失或插入的存在以外与选自seqidno：53-56的氨基酸序列相同的氨基酸序列；编码多肽的核酸分子，所述多肽包含除不超过5个氨基酸取代的存在以外与选自seqidno：53-56的氨基酸序列相同的氨基酸序列；和编码多肽的核酸分子，所述多肽包含除不超过2个氨基酸取代的存在以外与选自seqidno：53-56的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

本文描述的某些car，例如il13(eq)bbζcar和il13(eq)cd28-bbζcar，与某些其他il13靶向性car相比具有某些有益特征。例如，它们具有改善的对il13rα的选择性，引起较低的th2细胞因子产生，特别是较低的il13产生。

表达靶向il13rα2的car的t细胞可以用于治疗癌症，例如胶质母细胞瘤，以及表达il13rα2的其他癌症。因此，本公开内容包括使用表达本文所述car的t细胞治疗癌症的方法。

表达靶向her2的car的t细胞可以用于治疗癌症，例如胶质母细胞瘤，以及表达her2的其他癌症，例如已经扩散至中枢神经系统的乳腺癌。因此，本公开内容包括使用表达本文所述car的t细胞治疗癌症的方法。

本文描述的car可以包含位于靶向域和跨膜域之间的间隔物区。可以使用多种不同的间隔物。它们中的一些包括人fc区的至少部分，例如人fc区的铰链部分或ch3域或其变体。下表1提供了可以用于本文所述car的各种间隔物。

表1：间隔物的实例

一些间隔物区包括整个或部分免疫球蛋白(例如，igg1，igg2，igg3，igg4)铰链区，即落在免疫球蛋白的ch1和ch2域之间的序列，例如igg4fc铰链或cd8铰链。一些间隔物区包括免疫球蛋白ch3域或ch3域和ch2域两者。免疫球蛋白衍生的序列可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如1，2，3，4或5个取代，例如减少脱靶结合的取代。

“氨基酸修饰”指蛋白质或肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。“氨基酸取代”或“取代”指亲本肽或蛋白质序列中特定位置上的氨基酸被另一氨基酸替换。可以进行取代用于以非保守方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变成属于另一分组的氨基酸)或以保守方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变成属于相同分组的氨基酸)来改变所得蛋白质中的氨基酸。该保守改变一般导致所得蛋白质结构和功能的较少改变。以下是氨基酸的多个分组的实例：1)具有非极性r基团的氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；2)具有不带电的极性r基团的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；3)具有带电的极性r基团的氨基酸(在ph6.0时带负电)：天冬氨酸、谷氨酸；4)碱性氨基酸(在ph6.0时带正电)：赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在ph6.0)。另一分组可以是具有苯基的那些氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸，和酪氨酸。

多种跨膜域可以用于由本文所述方法中使用的细胞表达的car中。表2包括合适的跨膜域的实例。在存在间隔物区的情况下，跨膜域位于间隔物区的羧基末端。

表2：跨膜域的实例

由本文所述方法中使用的细胞表达的许多car包括一个或多个(例如，两个)共刺激域。共刺激域位于跨膜域和cd3ζ信号传导域之间。表3包括合适的共刺激域以及cd3ζ信号传导域的序列的实例。

表3：共刺激域的实例

附图简述

图1是如指示的由il13rα2特异性人il-13变体(huil-13(e13y))，人igg4fc间隔物区(huγ4fc)，人cd4跨膜(hucd4tm)和人cd3ζ链胞质(hucd3ζcyt)部分构成的il13(e13y)-zetakinecar(left)的示意图。还描绘了il13(eq)bbζcar，除位于igg4间隔物的ch2域中的以红色指示的两个点突变l235e和n297q，以及添加共刺激的4-1bb胞质域(4-1bbcyt)以外，其与il13(e13y)-zetakine相同。

图2a-c描绘了某些载体和可读框。a是2670个核苷酸il13(eq)bbz-t2acd19t构建体的cdna可读框图，其中指示il13rα2特异性配体il13(e13y)，igg4(eq)fc铰链，cd4跨膜，4-1bb胞质信号传导，三个甘氨酸的接头和il13(eq)bbzcar的cd3ζ胞质信号域，以及t2a核糖体跳跃和截短的cd19序列。还指示驱动il13(eq)bbζcar和cd19t的表面表达的人gm-csf受体α和cd19信号序列。b是将整合到宿主基因组中的侧翼为长末端重复(由“r”表示)的序列的图。c是il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7质粒的图谱。

图3描绘了phiv7的构建。

图4描绘了phiv7的元件。

图5描绘了il13(eq)bbζ/cd19t+tcm的产生方案。

图6a-c描绘了表面转基因和t细胞标志物表达的流式细胞术分析的结果。用抗-il13-pe和抗-cd8-fitc共染色il13(eq)bbζ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1以检测cd8+car+和cd4+(即cd8阴性)car+细胞(a)，或用抗cd19-pe和抗cd4-fitc共染色以检测cd4+cd19t+和cd8+(即cd4阴性)car+细胞(b)。用缀合有荧光染料的抗-cd3，tcr，cd4，cd8，cd62l和cd28(灰色直方图)或同种型对照(黑色直方图)(c)染色il13(eq)bbζ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1。在所有情况下，基于活淋巴细胞(dapi阴性)的百分比高于同种型染色。

图7a-d描绘了比较较大建立肿瘤的car+t细胞递送途径(i.c.对i.v.)的实验结果。将egfp-ffluc+pbt030-2tss(1×10⁵)植入nsg小鼠的右前脑中。在第19天和第26天，通过尾静脉对小鼠i.v.注射5x10⁶car+il13(eq)bbζ+tcm(11.8x10⁶个总细胞；n＝4)或模拟tcm(11.8x10⁶个细胞；n＝4)。或者，在第19天，第22天，第26天和第29天，对小鼠i.c.注射1x10⁶car+il13(eq)bbζ+tcm(2.4x10⁶个总细胞；n＝4)或模拟tcm(2.4x10⁶个细胞；n＝5)。随时间的平均ffluc通量(光子/秒)显示i.c.递送的il13(eq)bbζtcm介导第19天肿瘤的肿瘤消退。相比之下，与未治疗或模拟tcm对照相比，i.v.递送的t细胞未显示肿瘤负荷减少(a)。kaplanmeier存活曲线表明与用i.v.施用的car+tcm处理的小鼠相比用i.c.il13(eq)bbztcm处理的小鼠的改善的存活(p＝0.0003对数秩检验)(b).用il13(eq)bbz+tcmi.v.(c)对i.c.(d)处理的小鼠的代表性h&e和cd3ihc。仅在i.c.处理组中检测到cd3+t细胞，在i.v.处理的小鼠的肿瘤或周围脑实质中检测不到cd3+细胞。

图8a-b描绘了研究结果，其显示颅内，即瘤内(i.c.t.)或室内(i.c.v.)注射的car+t细胞可以转运到相对半球上的肿瘤。将egfp-ffluc+pbt030-2tss(1×10⁵)立体定位植入nsg小鼠的右前脑和左前脑中。在第6天，在右侧肿瘤部位对小鼠i.c.注射1.0x10⁶il13(eq)bbζ+tcm(1.6x10⁶个总细胞；63％car；n＝4)。多灶性胶质瘤实验模型(a)的示意图。cd3ihc，其显示t细胞浸润右侧和左侧肿瘤部位两者(b)。

图9描绘了il13(eq)bbζ/cd19t+(seqidno：10)的氨基酸序列。

图10描绘了il13(eq)41bbζ[il13{eq}41bbζt2a-cd19t_ephiv7；pf02630](seqidno：12)和cd19rop_ephiv7(pj01683)(seqidno：13)的序列比较。

图11描绘了il13(emy)-cd8h3-cd8tm2-41bbzeta的氨基酸序列(具有gmcsfra信号肽的seqidno：31；没有gmcsfra信号肽的seqidno：39)。

图12描绘了il13(emy)-cd8h3-cd28tm-cd28gg-41bb-zeta的氨基酸序列(具有gmcsfra信号肽的seqidno：32；没有gmscfra信号肽的seqidno：40)。

图13描绘了il13(emy)-igg4(hl-ch3)-cd4tm-41bb-zeta的氨基酸序列(具有gmcsfra信号肽的seqidno：33；没有gmcsfra信号肽的seqidno：41)。

图14描绘了il13(emy)-igg4(l235e，n297q)-cd8tm-41bb-zeta的氨基酸序列(具有gmcsfra信号肽的seqidno：34；没有gmcsfra信号肽的seqidno：42)。

图15描绘了il13(emy)-linker-cd28tm-cd28gg-41bb-zeta的氨基酸序列(具有gmcsfra信号肽的seqidno：35；没有gmcsfra信号肽的seqidno：43)。

图16描绘了il13(emy)-hl-cd28m-cd28gg-41bb-zeta的氨基酸序列(具有gmcsfra信号肽的seqidno：36；没有gmcsfra信号肽的seqidno：44)。

图17描绘了il13(emy)-igg4(hl-ch3)-cd28tm-cd28gg-41bb-zeta的氨基酸序列(具有gmscfra信号肽的seqidno：37；没有gmscfra信号肽的seqidno：45)。

图18描绘了il13(emy)igg4(l235e，n297q)-cd28tm-cd28gg-41bb-zeta的氨基酸序列(具有gmcsfra信号肽的seqidno：38；没有gmscfra信号肽的seqidno：46)。

图19描绘了il13(emy)-cd8h3-cd8tm-41bbzeta的氨基酸序列(具有gmcsfra信号肽的seqidno：47；没有gmcsfra信号肽的seqidno：48)。

图20描绘了her2scfv-igg4(l235e，n297q)-cd28tm-cd28gg-zeta-t2a-cd19t的氨基酸序列。各个域按序列下面的顺序列出，并通过交替下划线和非下划线指示。成熟car序列(seqidno：26)不包括gmcsfra信号肽，t2a跳跃序列或截短的cd19。

图21描绘了her2scfv-igg4(l235e，n297q)-cd8tm-41bb-zeta-t2a-cd19t的氨基酸序列。各个域按序列下面的顺序列出，并通过交替下划线和非下划线指示。成熟car序列(seqidno：27)不包括gmcsfra信号肽，t2a跳跃序列或截短的cd19。

图22a-d描绘了her2特异性car构建体和cart细胞扩增数据。

图23a-d描绘了针对乳腺癌细胞系的her2-cart细胞的体外表征。

图24a-f描绘了her2-cart细胞的体外肿瘤活性的研究结果。

图25a-i描绘了局部瘤内递送的her2-cart细胞的体内抗肿瘤功效的研究结果。

图26a-d描绘了在人原位(orthotopic)bbm异种移植物模型中局部递送her2-cart细胞的研究结果。

图27a-d描绘了her2-cart细胞的室内递送的研究结果。

图28示意性描绘了肿瘤细胞注射和cart细胞注射的位置，用于在胶质母细胞瘤的鼠模型中靶向il13α2r的cart细胞的瘤内和室内注射研究。

图29a-c描绘了研究结果，其证明了在施用il13(eq)bbζ[cd19t+tcm后已建立的胶质瘤肿瘤异种移植物的消退。将ffluc⁺pbt030-2肿瘤细胞(1×10⁵)立体定位植入nsg小鼠的左侧和右侧前脑中。在第6天，如上图4.1所述，对小鼠ict或icv注射1x10⁶il13(eq)bbζ+tcm(1.6x10⁶个总细胞；63％car+)。a，来自每组的代表性小鼠，显示了使用xenogen活体成像的相对肿瘤负荷。b，来自每组小鼠(n＝4-5)的左脑和右脑半球(感兴趣区域，roi)的平均xenogen通量，其中每个连续柱分别代表第5，9，12，15和19天。*，当使用未配对的studentt检验与未处理的pbt030-2组的相应roi和日/柱相比时，p＜0.05。c，t细胞注射后13天的全脑的平均xenogen通量。*，当使用未配对的studentt检验比较icv组与未处理的pbt030-2组时，p＝0.0407。这些数据代表三个分开的多病灶gbm实验。

图30显示了研究结果，证明在ict和icv施用il13(eq)bbζ/cd19t+tcm后在右脑和左脑肿瘤/半球中检测到hucd3+细胞。将ffluc⁺pbt030-2肿瘤细胞(1×10⁵)立体定位植入nsg小鼠的右前脑和左前脑中。在第6天，给小鼠ict(左图像)或icv(右图像)注射1x10⁶il13(eq)bbζ+tcm(1.6x10⁶个总细胞；63％car+)。t细胞施用后一周(顶部图像)和两周(底部图像)，对来自每组的2-3只小鼠实施安乐死，收获脑，在石蜡中包埋，并且用抗人cd3抗体进行ihc以检测t细胞。描绘了来自每组小鼠(ict：m406和m410；icv：m414和m415)的左和右肿瘤部位的代表性ihc图像。镶嵌图描绘了安乐死和大脑收获当天小鼠的xenogen通量图像。

图31示意性地描绘了用于治疗胶质母细胞瘤的cart细胞的临床试验的cart细胞制备和治疗的时间过程(a)，并提供了几种施用方案(b)。

图32呈现了如通过cd19监测(a)的cart细胞持久性的分析和如通过il13rα2表达监测(b)的gbm细胞的存在。

图33呈现了在用于瘤内施用的导管区域中来自患者upn097的成像结果。

图34是显示在一名患者的治疗过程中各种细胞因子水平的一系列图。

图35a-c是描绘在室内递送il13rα2靶向性cart细胞后复发性多灶性胶质母细胞瘤(包括脊柱转移)的消退(egression)的图像。通过将il13bbζtcm对最佳的复发性肿瘤灶的切除腔的6次局部输注(2m的1个循环，以及10mcar+t细胞的5个循环)治疗呈现复发性多灶性gbm(包括脊柱中的一个转移部位和广泛的柔脑膜疾病)的患者。虽然cart细胞注射部位在7周内保持稳定而没有疾病复发的证据，但远离cart细胞注射部位的其他疾病病灶继续进展(数据未显示)。然后该患者每周接受5次il13bbζtcm的室内(icv)输注(2m的1个循环和10mcar+t细胞的4个循环)。显示完成i.c.v.疗法之前(左)和之后一周(右)的脊柱的(a)横向脑切片，(b)矢状(saggital)脑切片和(c)横向(顶部)和额部(底部)切片的mri和/或pet图像，每个图像中的红色箭头指示肿瘤损伤部位。

图36a-b显示了具有nct02208362上的登记和同情使用方案的治疗方案。nct02208362上的登记设定在第0天(a)，在第107天(b)启动同情使用方案。novottf-100a，一种便携式医疗设备，通过非侵入性一次性头皮电极提供低强度、中等频率、交变电场；fgfr，成纤维细胞生长因子受体；mri，磁共振成像，它们均对脑进行，除非另有指示；ict，腔内；pet，正电子发射断层摄影术，在指定部位处进行；icv，脑室内。

图37a-c显示原发性和复发性肿瘤的免疫组织化学。在初始诊断时切除肿瘤(a)，并且在nct02208362下在rickham放置时切除的复发肿瘤(t1)(b，c)。描绘了使用il13rα2特异性或ki67特异性dab与苏木精复染剂的免疫化学染色，红框勾勒出从左到右的连续放大图像。

图38a-b显示肿瘤损伤鉴定。(a)鉴定gbm损伤t1-t8的特征。(b)脑mri扫描，其描绘t1-t7的部位。

图39a-c显示切除的肿瘤区域保持稳定，在腔内递送il13bbζtcm后没有疾病进展/复发的证据。(a)il13bbζtcm细胞产物的流式细胞术分析。顶行，用指示的构建体的转导通过t2a核糖体跳跃序列驱动il13bbζcar(用抗il13检测)和cd19t标志物(用抗cd19检测)的协调表面表达。在中间行中描绘了t细胞标志物tcr-α/β，cd3，cd4和cd8以及耗尽标志物lag-3，tim-3，klrg1和pd-1的染色概貌；在底行描绘了记忆标志物cd62l，cd45ro，ccr7，cd27和cd28的染色概貌以及幼稚t细胞标志物cd45ra。(b)nct02208362下的治疗方案。在患者经历复发并且在放置腔内(ict)rickham导管的情况下进行肿瘤切除后，施用6个循环的ict细胞剂量(1个循环的2x10⁶和5个循环的10x10⁶个car+细胞)，在循环3和4之间休息一周。红色箭头，il13bbζtcm递送的部位。(c)脑部mri扫描上的黄色圆圈显示放置导管的切除肿瘤的部位(t1)，以及额叶中仅切除的肿瘤部位(t2，t3)和在51天的ict治疗期内新产生的肿瘤部位(t6，t7)。

图40a-e显示了脑室内递送il13rα2靶向性cart细胞后复发性多灶性胶质母细胞瘤(包括脊柱转移)的消退。(a)同情使用方案下的治疗方案。在患者经历脑室内(icv)rickham导管放置后，施用5个循环的icv细胞剂量(2x10⁶的1个循环和10x10⁶个car+细胞的4个循环，以循环7到11指示)，在循环9和循环10之间休息一周。红色箭头，il13bbζtcm递送的部位。完成icv疗法之前(左)和之后一周(右)的脊柱的(b)横向脑切片，(c)矢状(saggital)脑切片和(d)横向(顶部)和额部(底部)切片的mri和/或pet图像，每个图像中的黄色圆圈指示肿瘤损伤部位。(e)非切除肿瘤t4-t8的最大损伤区域描绘了icv治疗随时间的各自降低。

图41显示icv递送il13rα2靶向性cart细胞后复发性多灶性gbm的消退。描绘了非切除的肿瘤t4-t7的最大损伤区域。

图42a-c显示了来自脑脊液(csf)样品的细胞浸润物和细胞因子的分析。(a)icv循环9、10和11后掺加的csf细胞浸润物数目，具有cd19+b细胞，car+(即cd19t+)和非工程化cd3+t细胞，cd11b+cd15+粒细胞和cd11b+cd14+hla-dr+单核细胞两者的流式细胞测定证据。(b)对csf中的cd3+t细胞群体评估基因修饰的(即cd19t+)t细胞的存在。针对cd19和cd8共染色来自循环9、10和11的指定日收集的csf的cd3门控细胞(顶部直方图)。然后使用免疫反应性细胞的百分比来计算每个时间点每mlcsf流体的总cd3+t细胞和cd19+cd3+(il13bbζtcm)细胞的数目。(c)icv治疗循环7-11的细胞因子水平的倍数变化。仅描绘了来自30重分析的那些细胞因子，其与治疗前水平相比表现出10倍或更多变化。

发明详述

下面描述了各种cart细胞的结构，构建和表征及其在治疗中枢神经系统癌症中的用途。嵌合抗原(car)是一种重组生物分子，其至少含有胞外识别域，跨膜区和胞内信号传导域。因此，术语“抗原”不限于结合抗体的分子，而是可以特异性结合靶物的任何分子。例如，car可以包括特异性结合细胞表面受体的配体。胞外识别域(也称为胞外域或简单地通过其包含的识别元件提及)包含识别元件，其特异性结合存在于靶细胞的细胞表面上的分子。跨膜区域将car锚定在膜中。胞内信号传导域包含来自人cd3复合物的zeta链的信号传导域，并且任选地包含一个或多个共刺激信号传导域。以不依赖于mhc限制的方式，car既可以结合抗原又可以转导t细胞活化。因此，car是“通用的”免疫受体，其可以治疗具有抗原阳性肿瘤的患者群体而不管其hla基因型。使用表达肿瘤特异性car的t淋巴细胞的过继免疫疗法可以是用于治疗癌症的有效治疗策略。

在一些情况下，可以使用载体产生本文描述的car，其中car可读框之后是t2a核糖体跳跃序列和截短的cd19(cd19t)，其缺乏胞质信号传导尾部(在氨基酸323处截短)。在此种排列中，cd19t的共表达提供了惰性的、非免疫原性的表面标志物，其允许基因修饰的细胞的精确测量，并且实现基因修饰的细胞的阳性选择，以及过继性转移后体内的治疗性t细胞的有效细胞追踪和/或成像。cd19t的共表达提供了使用临床可用的抗体和/或免疫毒素试剂选择性地删除治疗细胞，从而发挥自杀开关功能的在体内免疫靶向转导细胞的标志物。

可以以各种剂量和在各个时间范围间进行使用cart细胞的所公开的治疗方法。例如，接受cart细胞(例如il-13rα2特异性cart细胞)的输注，施用或注射的患者可以接受包含1x10⁶-15x10⁶个细胞的单剂量。换言之，用于所公开的方法的单剂量可以包含1x10⁶，2x10⁶，3x10⁶，4x10⁶，5x10⁶，6x10⁶，7x10⁶，8x10⁶，9x10⁶，10x10⁶，11x10⁶，12x10⁶，13x10⁶，14x10⁶或15x10⁶个细胞。在整个治疗过程中，患者可以接受20x10⁶-150x10⁶个t细胞之间的累积或总细胞剂量。例如，患者在治疗过程中可以接受约20x10⁶，约25x10⁶，约30x10⁶，约35x10⁶，约40x10⁶，约45x10⁶，约50x10⁶，约55x10⁶，约60x10⁶，约65x10⁶，约70x10⁶，约75x10⁶，约80x10⁶，约85x10⁶，约90x10⁶，约95x10⁶，约100x10⁶，约105x10⁶，约110x10⁶，约115x10⁶，约120x10⁶，约125x10⁶，约130x10⁶，约135x10⁶，约140x10⁶，约145x10⁶，或约150x10⁶或更多t细胞。在一些实施方案中，患者可以接受至少90x10⁶个t细胞的总剂量。在一个实施方案中，患者可以接受94x10⁶个t细胞的总剂量。

此外，可以根据不同的方案和时间表施用剂量。例如，所公开的方法可包括每天一次，每两天一次，每三天一次，每四天一次，每五天一次，每六天一次，一周一次，每两次一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每隔一个月一次，每三个月一次，或每六个月一次输注，施用或注射。在一些实施方案中，所公开的方法可包括例如从可穿戴泵连续输注。类似地，治疗的总时间过程可以是约5周，约10周，约15周，约20周，约25周，约30周，约35周，约40周，约45周，约50周，约55周，约60周，约65周，约70周，约75周或更长时间。在根据所公开的方法的治疗过程中，患者可以接受t细胞的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20或更多次输注，施用，或注射。例如，在一个实施方案中，患者可以在15周的过程中接受11次t细胞输注。

根据所公开的方法治疗癌症，更具体地，胶质瘤如胶质母细胞瘤可以产生许多治疗效果。例如，用所公开的cart细胞治疗可以导致根据所公开的方法治疗的患者的csf中细胞因子和趋化因子水平的增加。与如用包含cart细胞的组合物治疗前测量的基线水平相比，细胞因子和/或趋化因子表达可以增加至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，在至少95％，至少99％，或至少100％，或细胞因子和/或趋化因子表达可以增加至少1倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或至少10倍。可以观察到1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15种或更多种细胞因子或趋化因子的表达增加。

特别地，egf，嗜酸性粒细胞趋化因子，fgf，g-csf，gm-csf，hgf，ifn-α，ifn-γ，il-10，il-12，il-13，il-15，il-17，il-1rα，il-1β，il-2，il-2r，il-4，il-5，il-6，il-7，il-8，ip-10，mcp-1，mig，mip-1α，mip-1β，rantes，tnf-α和vegf中的至少一种的表达可以由于用如本文公开的cart细胞处理而增加。此外，细胞因子和/或趋化因子表达的增加可以是局部的(即，仅在cns和cfs中可观察到增加，而细胞因子和趋化因子的血清水平保持不变。

根据所公开的方法的治疗还可以导致csf中可检测的t细胞的增加。虽然在治疗后在csf中可检测的至少一些t细胞可能是表达car的t细胞，但是募集到csf的内源性t细胞也可能增加。尽管不希望受理论束缚，但是内源性t细胞的增加可能是由于局部细胞因子水平的增加所致的1型和2型t辅助细胞募集的结果。另外，可检测的t细胞可以包含cd3+t细胞，以及cd14+cd11b+hla-dr+成熟髓样群体，cd19+b细胞和cd11b+cd15+粒细胞，和/或反应性淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞。

可以在根据所公开的方法的治疗后可检测到csf中t细胞数目的增加达特定时间段。csf中可检测的t细胞增加可以在施用包含t细胞的组合物后持续或维持1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30天或更多天。例如，csf中观察到的t细胞数目的增加可以不恢复到基线水平(即治疗前可检测到的t细胞数目)约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30天。与如在用包含cart细胞的组合物治疗之前测量的基线水平相比，在csf中可检测的t细胞的数目可以增加至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或至少100％，或至少1倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少11倍，至少12倍，至少13倍，至少14倍或至少15倍。

图31中描绘了cart细胞制备和治疗的时间过程。在制备过程同时，研究参与者经历其肿瘤的切除，然后放置rickham导管和基线成像。

患者upn097经历肿瘤切除并在循环1中用2x10⁶个细胞处理，在循环2中用10x10⁶个细胞处理。在循环1和循环2两者中，将细胞施用于通过切除留下的腔。在第二个循环后，由于肿瘤快速进展，患者upn097被取消研究。

患者upn109在循环1中用2x10⁶个细胞处理，在循环2和3中用10x10⁶个细胞处理。休息期后，患者upn109在循环4、5和6用10x10⁶个细胞进行治疗。在循环1-6中，瘤内施用细胞。在循环7中，用2x10⁶个细胞治疗患者。在循环8和9中，用10x10⁶个细胞治疗患者。在循环7-10中，施用是室内施用。

如本文所用，术语“室内”是指室系统，特别是脑室内的空间。因此，在整个本公开中，术语“室内”和“脑室内”可以互换使用。因此，“室内施用”或“室内注射”是指将组合物递送到脑的室(即脑室)中。脑室是一系列相互连接的充满液体的空间，其位于前脑和脑干的核心中。此系统包括四个室：右侧和左侧室(其中一个在脑的每个半球中发现)，第三室和第四室。

所公开的方法包括施用包含t细胞的组合物的各种途径。例如，在一些实施方案中，可以在室内递送或施用所公开的组合物。在一些实施方案中，可以将所公开的组合物递送或施用到椎管中(即鞘内递送)。在一些实施方案中，可以将所公开的组合物递送或施用到脊髓的硬膜外空间中(即硬膜外递送)。在一些实施方案中，可以将所公开的组合物可以递送或施用于肿瘤(即瘤内递送)。在一些实施方案中，可以将公开的组合物递送或施用到通过切除肿瘤组织形成的腔中(即腔内递送)。此外，在一些实施方案中，所公开的方法可包括上述施用途径的组合。例如，患者可以通过腔内递送接受至少一剂包含t细胞的组合物，然后通过室内递送接受至少一剂组合物。

图32a显示了如由cd19监测的cart细胞持久性的分析。该分析显示在循环2后8天良好的t细胞持久性。图32b显示如通过il13rα2表达监测的gbm细胞的存在减少。

图33a和图33b描绘了在用于瘤内施用的导管区域中来自患者upn097的成像结果。在图33a中，可以看到预处理前存在很少的cd3+或cd8+t细胞。图33b(其是取自左侧额叶肿瘤腔壁的治疗后第16天的样品)显示大面积的坏死肿瘤和cd3+和cd8+细胞的显著存在。

胶质瘤表达il13受体，特别是高亲和力il13受体。然而，与il13受体不同，胶质瘤细胞过表达能够以不依赖于il4rβ或γc44需要的方式结合il13的独特il13rα2链。与其同源物il4一样，il13在cns外具有多向免疫调节活性。il13和il4两者都刺激b淋巴细胞产生ige并抑制巨噬细胞产生促炎性细胞因子。使用用放射性标记的il13的放射自显影术的详细研究已经证明了对所研究的几乎所有恶性胶质瘤组织的大量il13结合。此结合在肿瘤切片内和单细胞分析中是高度均质的。然而，对il13rα2mrna特异性的分子探针分析未检测到正常脑元件的胶质瘤特异性受体的表达，并且用放射性标记的il13的放射自显影术也未能检测到正常cns中的特异性il13结合。这些研究提示了共有的il13rα1/il4β/γc受体在正常cns中不能被可检测地表达。因此，il13rα2是胶质瘤的非常特异性细胞表面靶标，并且是设计用于治疗胶质瘤的car的合适靶标。

某些患者可能比其他患者更适合接受所公开的治疗方法。例如，具有高度表达il-13rα2的恶性肿瘤的那些患者可以特别受益于用所公开的cart细胞的治疗。可以通过染色从患者切除的肿瘤样品以确定il-13rα2的表达量来确定患者的适合性。可以基于表现出弱，中等或强染色强度的细胞数目对样品进行评分。确定ki67的表达水平对于确定疾病的侵入性也可以是有益的。一旦可以确定患者非常适合接收所公开的cart细胞，就可以根据所公开的方法治疗患者。

然而，基于il13的治疗性分子与广泛表达的il13rα1/il4β/γc受体复合物的结合具有介导对cns外的正常组织的不期望的毒性的潜力，因此限制了这些试剂的系统性施用。酪氨酸的氨基酸13处的il13α螺旋a中的天然谷氨酸的氨基酸取代选择性地降低il13对il13rα1/il4β/γc受体的亲和力。然而，相对于野生型il13，该突变体(称为il13(e13y))与il13rα2的结合增加。因此，这种最小程度改变的il13类似物同时增加il13对胶质瘤细胞的特异性和亲和力。因此，本文描述的car包含含有在氨基酸13(根据debinskietal.1999clincancerres5：3143s的编号)处的突变(e至y或e至某些其他氨基酸如k或r或l或v)的il13。然而，也可以使用具有天然序列的il13，并且可以是有用的，特别是在局部施用修饰的t细胞的情况下，例如通过直接注射到肿瘤块中。

另外，已知胶质瘤具有通常较差的患者预后。例如，多形性胶质母细胞瘤(gbm)是cns的常见恶性癌症。gbm的1年和2年相对存活率分别为29.6％和9.0％。只有3.4％的具有gbm诊断的患者存活超过5年。此外，手术切除和/或用其他常规治疗剂治疗后的复发是常见的。目前的常规治疗包括但不限于放射疗法，小分子(例如替莫唑胺，伊立替康，甲磺酸伊马替尼，厄洛替尼和羟基脲)和生物制剂如抗体(例如贝伐单抗)。

与现行标准相比，所公开的治疗方法改善了患者的临床预后。例如，所公开的方法可以增加1年，2年和5年的存活率。在一些实施方案中，根据所公开的方法治疗的患者的1年存活率可以为至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或至少100％。在一些实施方案中，根据所公开的方法治疗的患者的2年存活率可以为至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或至少100％。在一些实施方案中，根据所公开的方法治疗的患者的5年存活率可以为至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或至少100％。

在一些实施方案中，与接受常规治疗或soc治疗，包括放射疗法，小分子药物疗法，治疗性生物制剂如治疗性抗体或其组合的另一患者相比，所公开的方法还增加患者的寿命预期。在一些实施方案中，其中接受soc治疗的患者可以预期从初始诊断起存活约15个月(总体存活或os)，接受所公开的治疗的患者可以预期25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36个月或更多的os。在一些实施方案中，接受要求保护的治疗的患者可以预期42，48，54，60，66，72，78，84，90个月或更多的os。

所公开的方法可以通过多种临床结果改善患者的预后。例如，所公开的方法可以导致用包含t细胞的组合物治疗的患者中的肿瘤体积减小。在一些实施方案中，所公开的治疗方法可以导致至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％或至少100％的肿瘤体积减少。在一些实施方案中，可以完全消除患者中的肿瘤并且可以治愈患者的恶性肿瘤。

另外，所公开的方法是安全且耐受良好的。根据所公开的方法治疗的患者可以不经历显著的副作用，此外，可以能够中断服用辅助药物。例如，在一些实施方案中，根据nci常见毒性标准(ctc)，所公开的方法不会导致任何3级或更高级别的毒性。ctc提供0-5的可量化量表，其中0意指无不良事件，1意指轻度，2意指中度，3意指严重和不期望，4意指危及生命或致残，5意指死亡。因此，副作用和/或毒性可以包括轻度或中度头痛，疲劳，肌痛和轻微神经系统病症(如嗅觉先兆)等事件，但可避免高级毒性。

类固醇如地塞米松通常用于胶质瘤的临床管理以预防神经学副作用如脑水肿。所公开的治疗方法可以减少对此类辅助治疗的需要。例如，若患者在根据所公开的方法治疗之前接受类固醇(例如地塞米松)方案，则患者可以能够减少类固醇方案的剂量或中断类固醇方案以及不经历临床有害作用。

乳腺癌的脑转移可以表达her2。本文描述的某些可用于治疗恶性胶质瘤的car靶向her2。

本文描述的car可以通过本领域已知的任何手段产生，但优选使用重组dna技术产生它们。可以通过方便的本领域已知的标准分子克隆技术(基因组文库筛选，pcr，引物辅助连接，定点诱变等)制备编码嵌合受体的几个区域的核酸并组装成完整的编码序列。优选地，将所得编码区插入表达载体中并用于转化合适的表达宿主细胞系，优选t淋巴细胞细胞系，最优选自体t淋巴细胞细胞系。

可以用用于car表达的载体转导从患者分离的各种t细胞亚组，包括未选择的pbmc或富集的cd3t细胞或富集的cd3或记忆t细胞亚组。中央记忆t细胞是一种有用的t细胞亚组。通过选择cd45ro+/cd62l+细胞，使用例如装置以免疫磁性选择表达期望受体的细胞，可以从外周血单个核细胞(pbmc)中分离中枢记忆t细胞。富集中枢记忆t细胞的细胞可以用抗cd3/cd28活化，用例如指导car以及截短的人cd19(cd19t)(用于体内检测和潜在的离体选择两者的非免疫原性表面标志物)表达的sin慢病毒载体转导。活化/遗传修饰的中枢记忆t细胞可以用il-2/il-15在体外扩增，然后冷冻保存。

实施例1：il13rα2特异性car的构建和结构

以下描述有用的il13rα2特异性car的结构。密码子优化的car序列含有在单一位点处突变(e13y)以减少与il13rα1的潜在结合的膜栓系il-13配体，含有大大降低fc受体介导的识别模型的两个突变(l235e；n297q)的igg4fc间隔物，cd4跨膜域，共刺激4-1bb胞质信号传导域和cd3ζ胞质信号传导域。t2a核糖体跳跃序列将该il13(eq)bbζcar序列与cd19t(一种惰性的非免疫原性细胞表面检测/选择标志物)分离。此t2a连接导致来自单一转录物的il13(eq)bbζ和cd19t两者的协调表达。图1a是编码il13(eq)bbz-t2acd19t构建体的2670个核苷酸的可读框的示意图。在该图中，il13(eq)bbzcar的il13rα2特异性配体il13(e13y)、igg4(eq)的fc、cd4跨膜、4-1bb胞质信号传导、三甘氨酸接头，和cd3ζ胞质信号传导域，以及t2a核糖体跳跃和截短的cd19序列都得到指示。还指示驱动il13(eq)bbzcar和cd19t的表面表达的人gm-csf受体α和cd19信号序列。因此，il13(eq)bbz-t2acd19t构建体包括il13rα2特异性、铰链优化的、共刺激免疫嵌合序列(命名为il13(eq)bbz)、核糖体跳跃t2a序列和cd19t序列。

通过人gm-csf受体α前导肽与il13(e13y)配体5l235e/n297q修饰的igg4fc铰链(其中双重突变干扰fcr识别)、cd4跨膜、4-1bb胞质信号传导域和cd3ζ胞质信号传导域序列的融合产生il13(eq)bbz序列。密码子优化后从头合成该序列。通过消化含t2a的质粒获得t2a序列。从含有cd19的质粒的跨越前导肽序列到跨膜组分(即碱基对1-972)获得cd19t序列。将所有三种片段，1)il13(eq)bbz、2)t2a和3)cd19t克隆到ephiv7慢病毒载体的多克隆位点中。当转染到合适的细胞中时，载体将图1b中示意性描绘的序列整合到宿主细胞基因组中。图1c提供了9515个碱基对的il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7质粒本身的示意图。

如图2中示意性显示，il13(eq)bbzcar在几个重要方面与先前描述的称为il13(e13y)-zetakine的il13rα2特异性car(brownetal.2012clinicalcancerresearch18：2199)不同。il13(e13y)-zetakine由il13rα2特异性人il13突变蛋白(huil-13(e13y))、人igg4fc间隔物(huγ4fc)、人cd4跨膜(hucd4tm)和人cd3ζ链胞质(hucd3ζcyt)部分构成，如指示的。相反，il13(eq)bbζ)具有位于igg4间隔物的ch2域中的两个点突变l235e和n297q，和共刺激4-1bb胞质域(4-1bbcyt)。

实施例2：用于表达il13rα2特异性car的ephiv7的构建和结构

phiv7质粒是在希望之城(coh)的t细胞治疗剂研究实验室(tctrl)中衍生临床载体il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7的亲本质粒。从phiv7载体产生用于表达car的ephiv7载体。重要的是，该载体使用人ef1启动子来驱动car的表达。载体的5′和3′序列两者源自pv653rsn，如先前源自hxbc2原病毒。多嘌呤段dna瓣序列(flapsequence)(cppt)源自来自nihaids试剂保藏中心(aidsreagentrepository)的hiv-1株pnl4-3。之前描述了土拨鼠转录后调控元件(wpre)序列。

phiv7的构建示意性地描绘于图3中。简言之，如下将pv653rsn(含有来自gag-pol的653bp加上5’和3’长末端重复(ltr)以及居间的sl3-新霉素磷酸转移酶基因(neo))亚克隆到pbluescript中：在步骤1中，从5’ltr到rev-响应元件(rre)的序列制备p5’hiv-151，然后通过除去tata盒上游的序列修饰5’ltr，并首先连接到cmv增强子，然后连接到sv40复制起点(p5’hiv-2)。在步骤2中，在将3’ltr克隆到pbluescript中以制备p3’hiv-1之后，在3’ltr增强子/启动子中进行400-bp缺失以除去hivu3中的顺式调控元件并形成p3’hiv-2。在步骤3中，连接从p5’hiv-3和p3’hiv-2分离的片段以制备phiv-3。在步骤4中，通过除去额外的上游hiv序列来进一步修饰p3’hiv-2以产生p3’hiv-3，并且将含有wpre的600-bpbamhi-sali片段添加到p3’hiv-3中以制备p3’hiv-4。在步骤5中，通过pcr将phiv-3rre的大小减小，并连接到来自phiv-3的5’片段(未显示)和连接到p3’hiv-4，以制备phiv-6。在步骤6中，从pnl4-3扩增含有来自hiv-1pnl4-3(55)的cpptdna瓣序列的190-bpbglii-bamhi片段，并将其置于phiv6中的rre和wpre序列之间以制备phiv-7。此亲本质粒phiv7-gfp(gfp，绿色荧光蛋白)用于使用四质粒系统包装亲本载体。

包装信号psi(ψ)是将病毒基因组有效包装到载体中所需的。rre和wpre增强rna转录物转运和转基因的表达。与wpre组合的瓣序列已经证明增强慢病毒载体在哺乳动物细胞中的转导效率。

产生病毒载体所需要的辅助功能分成三个分开的质粒以降低经由重组产生有复制能力的慢病毒的可能性：1)pcgp编码病毒载体组装所需要的gag/pol蛋白；2)pcmv-rev2编码rev蛋白，其作用于rre序列以帮助运输病毒基因组来实现高效包装；和3)pcmv-g编码水泡-口炎病毒(vsv)的糖蛋白，其是病毒载体的传染性所需要的。

在phiv7编码的载体基因组和辅助质粒之间存在最小的dna序列同源性。同源性的区域包括位于pcgp辅助质粒的gag/pol序列中的大约600个核苷酸的包装信号区域；所有三种辅助质粒中的cmv启动子序列；和辅助质粒pcgp中的rre序列。极不可能由于这些区域的同源性可以产生具有复制能力的重组病毒，因为它将需要多次重组事件。另外，任何产生的重组体都将缺少慢病毒复制所需要的功能性ltr和tat序列。

cmv启动子被ef1α-htlv启动子(ef1p)置换，且新的质粒命名为ephiv7(图4)。ef1p具有563bp并在切除cmv启动子后使用nrui和nhei导入ephiv7。

已从该系统中除去了慢病毒基因组，其排除野生型病毒的致病性所必需的并且对于靶细胞的生产性感染需要的gag/pol和rev。另外，il13(eq)bbz-t2acd19t_ephiv7载体构建体不含有完整的3’ltr启动子，因此得到的在靶定细胞中表达的和反转录的dna原病毒基因组将具有无活性的ltr。由于此种设计，无hiv-i衍生的序列将从原病毒转录，并且仅仅治疗序列将从它们各自的启动子表达。sin载体中ltr启动子活性的除去预期将显著降低宿主基因的无意活化的可能性。表4汇总了il13(eq)bbz-t2acd19tephiv7中存在的各种调节物元件。

实施例3：用于转导患者t细胞的载体的产生

对于每种质粒(il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7；pcgp；pcmv-g；和pcmv-rev2)，产生种子库，所述种子库用于接种发酵罐以产生足够量的质粒dna。在用于产生慢病毒载体之前，测试质粒dna的身份、无菌性和内毒素。

简言之，从293t工作细胞(wcb)扩增细胞，所述293t工作细胞已经经过测试以确认无菌性并且没有病毒污染。将来自293twcb的一小瓶293t细胞解冻。将细胞培养并扩增直到存在足够数量的细胞来铺板适当数量的10层细胞工厂(cf)用于载体生产和细胞系维护。可以使用单细胞系(singletrainofcell)进行生产。

在至多10cf的亚批次中产生慢病毒载体。可在同一周内生产两个亚批次，使得产生约20l慢病毒上清液/周。在下游加工阶段期间，将所有批次产生的材料合并，以产生一批产物。在293t培养基(含有10％fbs的dmem)中将293t细胞铺在cf中。将工厂放置在37℃的培养箱中并水平平整以获得cf的所有层上的细胞的均匀分布。两天后，使用capo4方法用上述四种慢病毒质粒转染细胞，所述方法涉及tris：edta、2mcacl2、2xhbs和四种dna质粒的混合物。转染后第3天，收集含有分泌的慢病毒载体的上清液，纯化并浓缩。在从cf移除上清液后，从每个cf收集终止生产细胞。从每个工厂胰蛋白酶消化细胞并通过离心收集。将细胞重悬浮于冷冻培养基中并冷冻保存。随后这些细胞用于有复制能力的慢病毒(rcl)测试。

为了纯化和配制载体，通过膜过滤来澄清粗制上清液以除去细胞碎片。通过内切核酸酶消化降解宿主细胞dna和残留的质粒dna。使用0.45μm滤器对病毒上清液澄清细胞碎片。将澄清的上清液收集到加入有(终浓度50u/ml)的预先称重的容器中。对残留的质粒dna和宿主基因组dna的内切核酸酶消化在37℃下进行6小时。内切核酸酶处理的上清液的初始切向流超滤(tff)浓缩用于从粗制上清液中去除残留的低分子量组分，同时将病毒浓缩约20倍。澄清的内切核酸酶处理的病毒上清液以一定流速循环通过具有500kd的nmwco的中空纤维筒，所述流速设计为将剪切速率维持在约4000/秒或更低，同时最大化通量率。在浓缩过程期间起始核酸酶处理的上清液的渗滤以维持筒性能。使用pbs中的4％乳糖作为渗滤缓冲液，建立80％的渗透物置换率。使得病毒上清液达到目标体积，代表粗制上清液的约20倍浓缩，并继续再渗滤达4个另外的交换体积，其中渗透物置换率为100％。

通过使用高速离心技术来完成病毒产物的进一步浓缩。慢病毒的各个亚批次使用sorvallrc-26plus离心机以6000rpm(6,088rcf)在6℃下沉淀达16-20小时。然后将来自各个亚批次的病毒团粒用pbs中的4％乳糖在50ml体积中重构。该缓冲液中重构的团粒代表了病毒制备物的最终配制剂。整个载体浓缩过程导致大约200倍的体积减少。在所有亚批次完成之后，将材料置于-80℃，同时对各个亚批次的样品测试无菌性。确认样品无菌性后，亚批次在37℃快速搅拌解冻。然后，在病毒载体套件中ii类a/b3型生物安全柜中将材料混合并手动等分取样。使用无菌usp6类外部螺纹的o形环冷冻管中的1ml的浓缩慢病毒的填充构造。coh的应用技术部中心(centerforappliedtechnologydevelopment，catd)的质量系统(qs)根据cbg的政策和标准操作规程(policiesandstandardoperatingproceduresforthecbg)并且遵守目前的良好制造实践(currentgoodmanufacturingpractices，cgmps)释放所有材料。

为了确保慢病毒载体制备物的纯度，对其测试残留的宿主dna污染物以及残留的宿主和质粒dna的转移。在其它测试中，通过rt-pcr评估载体的身份，以确保存在正确的载体。满足关于意图用于此研究的载体的所有释放标准

实施例4：适用于act的t细胞的制备

通过白细胞单采术(leukopheresis)从患者获得t淋巴细胞，并且对适当的同种异体或自体t细胞亚组(例如，中枢记忆t细胞(tcm))进行遗传改变以表达car，然后通过任何临床上可接受的手段将其施用回到患者，以实现抗癌治疗。

可以如下制备合适的tcm。将从同意的研究参与者获得的白细胞单采术产物进行ficoll处理，洗涤并温育过夜。然后使用gmp级抗cd14、抗cd25和抗cd45ra试剂(miltenyibiotec)和clinimacs^tm分离装置消减细胞的单核细胞、调节性t细胞和幼稚t细胞群体。消减后，在clinimacstm分离装置上使用dreg56-生物素(coh临床级)和抗生物素微珠(miltenyibiotec)富集阴性级分细胞的cd62l+tcm细胞。

富集后，将tcm细胞在完整的x-vivo15加50iu/mlil-2和0.5ng/mlil-15中配制，并转移到teflon细胞培养袋中，在那里用dynalclinex^tmvivocd3/cd28珠刺激它们。刺激后长达5天，用il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7慢病毒载体转导细胞以感染复数(moi)为1.0至0.3转导细胞。在添加完全x-vivo15并且根据细胞扩充需要添加il-2细胞因子的情况下将培养物维持长达42天(将细胞密度保持于3x10⁵-2x10⁶个活细胞/ml，在培养的每周一、周三和周五补充细胞因子)。细胞通常在21天内在这些条件下扩充至约10⁹个细胞。在培养期结束时收获细胞，清洗两次，并在临床级冷冻保存培养基(cryostorecs5，biolifesolutions)中配制。

在t细胞输注当天，将冷冻保存并释放的产物解冻，清洗并配制用于再输注。将含有释放的细胞产物的冷冻保存的小瓶从液氮储存中取出，解冻，冷却，并用pbs/2％人血清白蛋白(hsa)清洗缓冲液清洗。离心后，除去上清液并将细胞重悬于不含防腐剂的生理盐水(pfns)/2％hsa输注稀释剂中。采集样品用于质量控制测试。

使用上述制造平台进行对从健康供体获得的细胞的两次鉴定运行。对每个临床前量化运行产物分配人供体(hd)编号-hd006.5和hd187.1。重要的是，如表5所示，这些量化运行在28天内扩增＞80倍，并且扩增的细胞表达il13(eq)bbγ/cd19t转基因。

表5：来自临床前量化运行产物的表达数据的汇总

实施例5：il13(eq)bbγ/cd19t+tcm中表面转基因和t细胞标志物表达的流式细胞术分析

如下所述，将实施例4中描述的两种临床前量化运行产物用于临床前研究。图6a-c描绘了表面转基因和t细胞标志物表达的流式细胞术分析的结果。将il13(eq)bbγ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1与抗-il13-pe和抗-cd8-fitc共染色以检测cd8+car+和cd4+(即cd8阴性)car+细胞(图6a)，或用抗-cd19-pe和抗-cd4-fitc共染色以检测cd4+cd19t+和cd8+(即cd4阴性)car+细胞(图6b)。il13(eq)bbγ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1用缀合有荧光染料的抗cd3，tcr，cd4，cd8，cd62l和cd28(灰色直方图)或同种型对照(黑色直方图)染色。(图6c)。在图6a-c的每一个中，所示百分比基于高于同种型染色的活淋巴细胞(dapi阴性)。

实施例6：用于治疗大的ts引发的pbt肿瘤的cart细胞递送途径的比较

以下描述了比较递送途径(静脉内(i.v.)或颅内(i.c.))对针对侵入性原发性pbt细胞系的抗肿瘤活性的研究。在试点研究中(数据未显示)，出乎意料地观察到i.v.施用的il13(eq)bbζ+tcm与pbs相比没有提供治疗小(第5天)pbt030-2egfp：ffluc肿瘤的治疗益处。这与用i.c.施用的car+t细胞观察到的稳健治疗效力形成对比。推测第5天pbt030-2肿瘤可能太小而无法募集来自外周的治疗性t细胞，因此针对较大的第19天pbt030-2egfp：ffluc肿瘤比较i.v.与i.c.递送。对于这些研究，用il13(eq)bbz+tcm，或模拟tcm(无car)的两个i.v.输注(5x10⁶car+tcm；第19和26天)或4次i.c.输注(1x10⁶car+tcm；第19、22、26和29天)处理pbt030-2移植的小鼠。对于i.v.施用的car+t细胞，这里也没有如通过xenogen成像或kaplan-meier存活分析监测的治疗益处(图7a和7b)。相反，对i.c.施用的il13(eq)bbζ+tcm观察到有力的抗肿瘤活性(图7a-b)。接下来，收获t细胞注射后7天的来自小鼠分组的脑，并通过ihc评估cd3+人t细胞。令人惊讶的是，对于用模拟tcm或il13(eq)bbζtcmi.v.处理的小鼠，在肿瘤或人t细胞通常存在的其它小鼠脑区域(即柔脑膜病)中没有可检测的cd3+人t细胞(图7c)，提示肿瘤向性缺陷。这与在i.c.处理的小鼠中检测到的大量t细胞形成对比(图7d)。

肿瘤衍生的细胞因子，特别是mcp-1/ccl2，在将t细胞募集到肿瘤中是重要的。因此，评估pbt030-2肿瘤细胞，并且发现该系产生与u251t细胞相当的高水平的mcp-1/ccl2(数据未显示)，所述u251t细胞是先前显示吸引i.v.施用的效应器cd8+t细胞至i.c.移植肿瘤的胶质瘤系。恶性胶质瘤是高度侵入性肿瘤，并且陈述中通常是多病灶的。上述研究建立il13bbztcm可以消除浸润的肿瘤，如pbt030-2，并介导长期持久的抗肿瘤活性。还检查颅内递送的cart细胞运输到多灶性疾病的能力。对于该研究，将pbt030-2egfp：fflucts植入左半球和右半球两者中(图8a)，并且仅在右侧肿瘤部位处注射car+t细胞。令人鼓舞的是，对于所有评估的小鼠(n＝3)，我们在注射部位(即右侧肿瘤)以及左半球上的瘤内在t细胞输注后7天通过cd3ihc检测到t细胞(图8b)。这些发现提供如下证据，即car+t细胞能够运输到并浸润远端部位处的肿瘤病灶。在使用u251t胶质瘤细胞系的第二肿瘤模型中也观察到类似的发现(数据未显示)。

实施例7：il13(eq)bbζ/cd19t的氨基酸序列

il13(eq)bbζ/cd19t的完整氨基酸序列描绘于图9中。整个序列(seqidno：1)包括：22个氨基酸的gmcsf信号肽(seqidno：2)，112个氨基酸的il-13序列(seqidno：3；氨基酸取代e13y以粗体显示)；229个氨基酸的igg4序列(seqidno：4；氨基酸取代l235e和n297q以粗体显示)；22个氨基酸的cd4跨膜序列(seqidno：5)；42个氨基酸的4-1bb序列(seqidno：6)；3个氨基酸的gly接头；112个氨基酸的cd3ζ序列(seqidno：7)；24个氨基酸的t2a序列(seqidno：8)；和323个氨基酸的cd19t序列(seqidno：9)。

成熟嵌合抗原受体序列(seqidno：10)包括：112个氨基酸的il-13序列(seqidno：3；氨基酸取代e13y以粗体显示)；229个氨基酸的igg4序列(seqidno：4；氨基酸取代l235e和n297q以粗体显示)；22个氨基酸的cd4序列(seqidno：5)；42个氨基酸的4-1bb序列(seqidno：6)；3个氨基酸的gly接头；和112个氨基酸的cd3ζ序列(seqidno：7)。在该car序列(seqidno：10)内是il-13/igg4/cd4t/41-bb序列(seqidno：11)，其包括：112个氨基酸的il-13序列(seqidno：3；氨基酸取代e13y以粗体显示)；229个氨基酸的igg4序列(seqidno：4；氨基酸取代l235e和n297q以粗体显示)；22个氨基酸的cd4序列(seqidno：5)；和42个氨基酸的4-1bb序列(seqidno：6)。il13/igg4/cd4t/4-1bb序列(seqidno：11)可以通过接头例如glyglygly接头与112个氨基酸的cd3ζ序列(seqidno：7)连接。car序列(seqidno：10)之前可以是22个氨基酸的gmcsf信号肽(seqidno：2)。

图10描绘了il13(eq)41bbζ[il13{eq}41bbζt2a-cd19t_ephiv7；pf02630](seqidno：12)和cd19rop_ephiv7(pj01683)(seqidno：13)的序列比较。

实施例8：另外的靶向il13rα2的car的氨基酸序列

图11-18描绘了另外的针对il13rα2的car的氨基酸序列。在每种情况下，除了位于某些胞内域之间的glyglygly间隔物之外标记各个域。每个包括人il13，具有glu至tyr(seqidno：3；突出显示氨基酸取代e13y)。在用于表达这些car的表达载体中，表达的氨基酸序列可以包含24个氨基酸的t2a序列(seqidno：8)；和323个氨基酸的cd19t序列(seqidno：9)，以允许截短的cd19序列在car表达细胞的表面上的协调表达。

对一组car测试其介导il13ra2特异性杀伤的能力，如72小时共培养测定时中评估，所述car包含人il13(e13y)域，cd28tm域，cd28gg共刺激域，4-1bb共刺激域和cd3ζ域car主链，并且包括hl(22个氨基酸)间隔物，cd8铰链(48个氨基酸)间隔物，igg4-hl-ch3(129个氨基酸)间隔物或igg4(eq)(229个氨基酸)间隔物。除了在该系统中似乎具有差的car表达的hl(22个氨基酸)之外，所有都是有活性的。

实施例9：两种her2-car的结构

包含本文所述her2scfv的一种car称为her2scfv-igg4(l235e，n297q)-cd28tm-cd28gg-zeta-t2a-cd19t。该car包括多种重要特征，包括：靶向her2的scfv；以减少fc受体(fcr)结合的方式在ch2区域内的两个位点处突变(l235e；n297q)的igg4fc区域；cd28跨膜域，cd28共刺激域和cd3ζ活化域。图20呈现了该car的氨基酸序列，包括用于监测car表达的截短的cd19序列和t2a核糖体跳跃序列的序列，所述t2a核糖体跳跃序列允许在不融合截短的cd19序列的情况下产生car。如图21中显示，未成熟car包含：gmcsfr信号肽，her2scfv，充当间隔物的igg4，cd8跨膜域，包含ll至gg序列改变的4-ibb共刺激域，三gly序列，cd3zeta刺激域。转录物还编码t2a核糖体序列和截短的cd19序列，其不是car蛋白序列的一部分。成熟car与未成熟car相同，但缺乏gmcsf信号肽。

实施例10：靶向her2的car的表达

图22a是图20和图21中描绘的两种her2特异性car构建体的示意图。在her2(eq)28ζ中，通过修饰的igg4fc接头(双重突变体，l235e；n297q)将scfv栓系到膜，含有cd28跨膜域，胞内cd28共刺激域和细胞溶解性cd3ζ域。t2a跳跃序列将car与用于细胞追踪的截短的cd19(cd19t)蛋白分开。her2(eq)bbζ是相似的，除了共刺激域是4-1bb而不是cd28并且跨膜域是cd8跨膜域而不是cd28跨膜域。用表达her2(eq)28ζ或her2(eq)bbζ的慢病毒载体转染人中枢记忆(tcm)细胞。图22b描绘了人tcm表面表型的代表性facs数据。图22c描绘了用表达her2(eq)28ζ或her2(eq)bbζ的慢病毒载体转染的tcm中cd19和蛋白l表达的测定结果。从这些结果可以看出，如通过cd19表达评估的转染效率对于这两种car是相似的。然而，蛋白l表达对于her2(eq)bbζ比对于her2(eq)28ζ低，提示her2(eq)bbζcar比her2(eq)bbζ较不稳定。细胞扩增的分析(图22d)显示car均不干扰t细胞扩增。

实施例11：her2靶向性car的体外表征

使用多种乳腺癌细胞系，包括her2阴性系(lcl淋巴瘤，mda-mb-468，u87胶质瘤)，低her2表达系(mda-mb-361，231br)和高her2表达系(skbr3，bt474，bbm1)来表征her2(eq)28ζ和her2(eq)bbζ。图23a描绘了这些品系中每一种的her2表达水平。使用流式细胞术(对car+t细胞门控)来表征与mda-mb-361肿瘤细胞(低her2表达)或bbm1肿瘤细胞(高her2表达)共培养5小时后模拟(未转导)，her2(eq)28ζ或her2(eq)bbζcart细胞中cd107a脱粒和ifnγ产生。该分析的结果在图23b中呈现。用其他乳腺癌细胞系进行类似的研究，并且在图23c中汇总结果。通过elisa测量用重组her2蛋白或肿瘤靶物培养24小时后her2-cart细胞产生的ifnγ，并且该分析结果显示在图23d中。

实施例12：her2靶向性car的体外抗肿瘤活性

使用流式细胞术评估在模拟(未转导的)、her2(eq)28ζ或her2(eq)bbζcart细胞与肿瘤靶物共培养72小时后的肿瘤细胞杀伤。该分析的结果在图24a中呈现。测量与her2阴性mda-mb-468或her2阳性bbm1细胞共培养72小时后在总cart细胞中的pd-1和lag-3诱导，并且该分析的结果在图24b中呈现。测量在与her2阴性(lcl淋巴瘤，mda-mb-468，u87胶质瘤)，低her2表达(mda-mb-361，231br)或高her2表达(skbr3，bt474，bbm1)的肿瘤靶物共培养72小时后cd8+cart细胞中的pd-1诱导，并且该分析结果在图24c中呈现。这些研究提示her2(eq)bbζ比her2(eq)28ζ引起更低的pd-1诱导。对于her2(eq)28ζ或her2(eq)bbζcatt细胞两者，测量在范围为0.25∶1至2∶1的效应器∶肿瘤(e∶t)比率的情况下的肿瘤细胞杀伤。该分析的结果在图24d中呈现，其显示her2(eq)28ζ和her2(eq)bbζ在体外肿瘤细胞杀伤中都是有效的。通过流式细胞术测量与mda-mb-468或bbm1细胞共培养72小时后her2-cart细胞的cfse增殖。该分析的结果在图24e中呈现，其显示her2(eq)bbζcart细胞比her2(eq)28ζcart细胞增殖更多。

实施例13：her2靶向性car的体内抗肿瘤活性

在患者来源的乳腺至脑转移模型中评估瘤内递送的her2cart细胞的活性。图25a-25c是肿瘤的h&e染色。通过用模拟(未转导的)或her2(eq)bbζcart细胞直接注射到肿瘤中来治疗小鼠。图25d-25f描绘了肿瘤的光学成像结果，并且图25g-25i是在肿瘤注射后第3，8或14天局部治疗的小鼠的kaplan-meier存活曲线。这些研究显示当直接注射到肿瘤中时，her2(eq)bbζcart细胞在体内具有有力的抗肿瘤功效。

为了评估乳腺至脑转移的人异种移植物模型中的抗肿瘤功效，将bbm1细胞(0.2m)或bt474(0.15m)颅内注射到nsg小鼠中。在肿瘤注射后第8天，瘤内注射her2(eq)28ζ或her2(eq)bbζ或模拟(未转导)t细胞(1m)。通过基于萤光素酶光学成像监测bbm1(图26a)和bt474(图26b)肿瘤。kaplanmeier曲线在图26c和图26d中呈现。

还使用乳腺至脑转移的人患者来源的原位异种移植物模型来评估her2(eq)28ζ和her2(eq)bbζcart细胞。图27a显示了通过立体定向注射bbm1细胞(0.2m)和室内t细胞递送的肿瘤植入区域。肿瘤染色在图27b中描绘。在肿瘤注射后第14天，瘤内注射her2(eq)28ζ，her2(eq)bbζ或模拟(未转导)t细胞(0.5m)。通过基于萤光素酶的光学成像监测肿瘤生长。图27c呈现每个处理组的通量平均值，而图27d呈现每个处理组的kaplanmeier存活曲线。

实施例14：表达靶向il13ra2的car的tcm的颅内和瘤内施用的比较

对于从用il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7慢病毒载体转导并在体外扩增的富含tcm的细胞系产生的cart细胞的体内安全性、运输和功效，在胶质母细胞瘤的鼠模型中评估两种不同的颅内(ic)递送途径(瘤内(ict)和室内(icv))，如对于胶质母细胞瘤(gbm)的临床治疗所提出的。使用il13rα2+原代低传代gbm肿瘤球体系pbt030-2在免疫缺陷的nsg小鼠中检查ict或icv施用的这些细胞的体内安全性和功能效力，所述pbt030-2已经被工程化改造以表达萤火虫萤光素酶(ffluc)报告物基因。

通过clinimacs^tm/automacs选择从pbmc富集的tcm细胞系用il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7慢病毒进行慢病毒转导，扩增，然后使用与上述方法类似的方法冷冻保存。然后评估ict或icv施用的新鲜解冻的cart细胞的潜在毒性，其运输到多灶性gbm肿瘤的能力以及其控制ic植入的il13rα2+gbm系pbt030-2细胞的体内生长的效力。为了评估一般毒性，每天观察小鼠的总体健康，包括体重和警觉性。检测如通过xenogen成像测量的肿瘤负荷；还对小鼠的亚组进行免疫组织化学(ihc)以检测肿瘤的t细胞募集/浸润。

在第0天，雄性nsg小鼠(10-12周龄)在右侧和左侧对侧半球两者中立体定向ic注射1x10⁵个ffluc+pbt030-2细胞，并允许移植6天。然后基于如通过xenogen成像确定的肿瘤大小对小鼠进行分组，实现每组相等的肿瘤大小分布。然后，将小鼠组保持未处理(n＝4)，或或者用1x10⁶car+il13(eq)bbζ/cd19t+tcmict(右半球，n＝8)或icv(n＝8)处理(图28)。通过xenogen成像和ffluc通量(光子/秒)的定量随时间监测pbt030-2肿瘤生长。在不同时间点，对来自每组的小鼠实施安乐死，收集其脑，包埋在石蜡中并进行免疫组织化学(ihc)以评估表达人cd3的细胞(即人t细胞)的存在。具体地，在施用t细胞后一周(实验的第13天)，从每个cart细胞处理组中对三只小鼠实施安乐死，因此这些小鼠不包括在图29的xenogen成像分析中；然后在t细胞施用后两周(实验的第21天)对每组小鼠中的两只小鼠实施安乐死。

虽然这不是存活研究，并且因此在特定时间点对小鼠均实施安乐死以评估脑中的t细胞运输(下文所述)，每天监测小鼠的痛苦或一般毒性的任何明显体征。用ict或icv方案治疗的小鼠没有表现出任何体重减轻，并且在整个实验中是欢快的、警觉的和反应性的。因此，无论t细胞施用的途径如何，都没有任何与疗法相关的副作用的体征。

如图29a-c所示，如预期的，il13(eq)bbζ/cd19t+tcm的ict递送表现出针对pbt030-2肿瘤的稳健抗肿瘤活性。然而，il13(eq)bbζ/cd19t+tcm的icv递送似乎提供比在ict施用的情况下观察到的更大的针对ic移植的pbt030-2肿瘤的治疗益处，尤其是针对对侧(左)半球中的肿瘤损伤。

为了确定施用途径是否影响t细胞迁移至肿瘤部位的能力，在t细胞施用后一周和两周对来自每组的小鼠的脑进行cd3+t细胞的ihc分析。如图30所示，在接受了ict或icv施用的t细胞的小鼠的左侧和右侧肿瘤部位均发现人cd3+t细胞。这些数据代表在t细胞施用后一周时每组中的3只小鼠，和两周时每组中的2只小鼠。

该研究证明在该nsg小鼠模型中，t细胞的瘤内和室内施用两者都是良好耐受的。此外，可以在已经用il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7载体转导的tcm量化运行细胞的ict和icv递送两者的情况下观察到肿瘤部位处t细胞的体内多灶性抗肿瘤效力和ihc检测。该研究进一步提示icv递送的t细胞可以比ict递送的t细胞具有更大的功效。

实施例15：对il-13rα2cart细胞评估治疗胶质母细胞瘤的1期临床试验

该实施例描述了评估复发性il13rα2+gbm患者中每周颅内输注自体il13bbζtcm的安全性、可行性和生物活性的临床试验的初步发现。如下面更详细描述的，登记的患者经历白细胞单采术(leukapheresis)以收集自体pbmc，并且与il13bbζ+tcm制备同时，在放置储库/导管装置的情况下进行肿瘤活组织检查或切除。在基线mr和pet成像以及手术恢复后，按照4周治疗方案治疗患者，所述4周治疗方案由3周每周一次(3-weekly)颅内输注il13bbζ+tcm，然后休息一周进行毒性和疾病评估组成。三个切除患者的此第一低剂量分组的至今结果提示了手术切除后的il13bbζtcm的局部递送是安全且耐受良好的，没有观察到归于疗法的3级或更高的毒性，并且重要的是，证明了cart细胞施用后的抗肿瘤活性的早期证据。对于可获得样品的所有患者，在治疗后通过流式细胞术在肿瘤囊肿液或脑脊液(csf)中检测cart细胞至少7天。一名特别感兴趣的患者出现复发性多灶性gbm，包括脊柱中的一个转移部位和广泛的柔脑膜疾病。该患者最初按照方案进行治疗，其中将il13bbζtcm6次局部输注入后颞枕区中的最大复发性肿瘤灶的切除腔中。令人鼓舞的是，此种cart细胞注射部位保持稳定，在7周内没有疾病复发的证据，而远离cart细胞注射部位的其他疾病病灶继续进展。然后根据同情使用方案对该患者进行治疗，5周每周一次室内输注il13bbζtcm，而不进行任何其他治疗干预。在最后的室内cart细胞输注后一周，所有颅内和脊柱肿瘤均已消退，大多数按体积计减少超过75％，并且该患者在cart细胞治疗开始后4个月保持临床稳定。

上文描述了本研究中使用的car，il13(eq)bbζ。图9中描绘了未成熟car的序列，包括cd19t标志物。整个未成熟序列(seqidno：1)包括：22个氨基酸的gmcsf信号肽(seqidno：2)，112个氨基酸的il-13序列(seqidno：3；氨基酸取代e13y以粗体显示)；229个氨基酸的igg4序列(seqidno：4；氨基酸取代l235e和n297q以粗体显示)；22个氨基酸的cd4跨膜序列(seqidno：5)；42个氨基酸的4-1bb序列(seqidno：6)；3个氨基酸的gly接头；112个氨基酸的cd3ζ序列(seqidno：7)；24个氨基酸的t2a序列(seqidno：8)；和323个氨基酸的cd19t序列(seqidno：9)。

使用来自每位患者的自体细胞来制备cd8+cd4+tcm细胞，然后用表达il13(eq)bbζ的上文所述的慢病毒载体转染。简言之，使用装置以免疫磁性选择cd45ro+/cd62l+tcm从外周血单个核细胞(pbmc)富集tcm。用抗cd3/cd28dynal珠活化这些细胞，用sin慢病毒载体转导，该载体指导il13(eq)bbζcar的表达。用il-2/il-15体外扩增活化/遗传修饰的il13(eq)bbζ/cd19t+tcm细胞，然后冷冻保存。

下面描述两名均患有复发/难治性gbm的患者的治疗。通过rickham导管在约5-10分钟内手动进行腔内施用cart细胞，然后通过以0.5ml/小时对流增强递送(ced)递送多达1.0ml无防腐剂的生理盐水(pfns)冲洗。通过放置到侧室中的rickham导管在约5-10分钟内手动进行cart细胞的室内施用。然后这继之以通过手动推动技术在5-10分钟内递送多达0.5ml无防腐剂的生理盐水(pfns)冲洗。pfns冲洗意味着清除施用管线并将剩余的cart细胞推过导管。

在图31中描绘了cart细胞制备和治疗的时间过程。在制备过程的同时，研究参与者经历其肿瘤的切除，然后放置rickham导管和基线成像。

患者upn097经历肿瘤切除并在循环1中用2x10⁶个细胞以及在循环2中用10x10⁶个细胞处理。在循环1和循环2两者中，将细胞施用于通过切除留下的腔。在第二个循环后，由于快速的肿瘤进展，患者upn097被取消研究。

患者upn109在循环1中用2x10⁶个细胞以及在循环2和3中用10x10⁶个细胞处理。休息期后，患者upn109在循环4、5和6中用10x10⁶个细胞处理。在循环1-6中，施用细胞。在循环7中，患者用2x10⁶个细胞治疗。在循环8和9中，患者用10x10⁶个细胞治疗。在循环7-10中，施用是室内施用。

图32a呈现了通过cd19监测的cart细胞持久性的分析。该分析显示在循环2后8天良好的t细胞持久性。图32b显示如通过细胞上的il13rα2表达监测的gbm细胞的存在减少。

图33a和图33b描绘了在用于瘤内施用的导管区域中来自患者upn097的成像结果。在图33a中，可以看到处理前存在很少的cd3+或cd8+t细胞。图33b(其是取自左侧额叶肿瘤腔壁的治疗后第16天的样品)显示大面积的坏死肿瘤和cd3+和cd8+细胞的显著存在。

如图34a-d所示，在两个治疗循环中ifn-γ(th1细胞因子)增加，而il-13水平(th2细胞因子)没有显著变化(图34a和图34b)。il-6(一种肿瘤相关细胞因子)在循环1期间下降，并且在循环2期间保持在较低水平(图34c)。il-8(另一种肿瘤相关细胞因子)在循环1期间减少，但在循环2期间向其循环1前水平增加(图34d)。

患者upn109呈现复发性多灶性gbm，包括脊柱中的一个转移部位和广泛的柔脑膜疾病。如上所述，通过将il13bbζtcm六次局部输注入最大复发性肿瘤病灶的切除腔中治疗该患者。虽然cart细胞注射部位保持稳定而没有疾病复发的证据超过7周，但远离cart细胞注射部位的其他疾病病灶继续进展(数据未显示)。如上所述，该患者然后接受每周5次il13bbζtcm的室内输注。图35a-b呈现横向脑切片(图35a)和矢状脑切片(图35b)的mri和/或pet图像。图35c呈现在室内治疗完成之前(左)和之后1周(右)脊柱的横向(顶部)和额部(底部)部分，其中每个图像中以红色箭头指示肿瘤损伤部位。

实施例16：关于室内施用的病例报告

在表现出癫痫大发作后，50岁龄男性最初诊断为在右颞叶中患有低级脑肿瘤。4个月的监测后，根据mri，此右颞叶肿瘤表现出增加的增强，并且患者经历肿瘤切除，其确认whoiv级胶质瘤(gbm)的诊断。然后患者接受护理标准辅助质子辐射，总剂量为59.4钴gy当量，同时使用替莫唑胺(每天140mg)，然后进行4个循环的替莫唑胺，同时使用novocure装置(novottf-100a)达三个月。在原发性肿瘤切除后6个月，pet和mri图像显示疾病进展的证据。

然后在通过ihc确认原发性右颞叶肿瘤中的il13rα2表达后，用自体il13rα2靶向性cart细胞治疗患者(图36)，h评分为100(图37)。然后通过白细胞单采术收集外周血单个核细胞(pbmc)，然后通过如前所述的两步消减选择程序富集cd4+cd8+tcm。在il13bbζtcm制备期间，按评估成纤维细胞生长因子抑制剂(nct01975701)的分开的临床方案治疗患者，并且通过疗法而进展，头痛，意识错乱和定向障碍的症状增加。另外，在t细胞注射之前，患者逐渐减少类固醇。

在原发性肿瘤切除术后10个月，对于五个鉴定的进展中的gbm损伤中的三个，患者经历另一次手术切除(图38)，包括放置有储库/导管装置的右后颞枕区(t1)中的最大损伤，并在右额叶(t2，t3)中的两个损伤。未通过手术切除左侧颞区的另外两个肿瘤(t4，t5)。手术切除后6天，患者接受两个4周的治疗方案，每个方案由每周三次腔内(ict)输注il13bbζtcm，然后一周的毒性评估和疾病评估组成。该患者以低剂量2x10⁶个car+t细胞开始治疗，然后5次输注10x10⁶个car+t细胞(图39)。根据同情使用方案，在这六次ict输注之后，将第二根导管置于右侧室中，允许患者再接受il13bbζtcm的5次脑室内(icv)治疗循环，再次以低剂量2x10⁶个cart细胞开始，接着四次输注10x10⁶个cart细胞(图40)。

由于有限的治疗产物，仅五次icv输注循环是可行的。总体上，患者接受11次细胞输注，总剂量为94x10⁶car+t细胞。治疗过程涵盖15周，在每第三个循环之后和最后两次icv输注之后发生毒性和疾病评估(即，mri和pet成像)的评估周。在此cart细胞治疗过程中，患者未接受其他治疗干预，并且在此报告了涵盖11个输注循环的直至190天评估期的发现。随后，制备第二il13bbζtcm产物，并且在第192天开始，该患者大约每3周继续接受该第二制造产物的icv输注。

实施例17：研究设计

这些研究(包括同情使用方案)得到机构审查委员会批准，并且患者提供书面知情同意书。适任性(eligibility)包括在先组织学确认的il13rα2+iv级胶质瘤的诊断，其现在是复发性的，年龄＞18岁，karnofsky表现状态(kps)＞60，足够的心肺功能和存活期望＞4周。患者必须在登记前至少12周完成初始放射疗法，并且在t细胞疗法期间不得具有任何其他活性恶性肿瘤、感染或间发疾病或接受其他研究试剂或需要超过2mgtid(3x/天)的地塞米松。

该患者最初在我们正在进行的i期研究(nct02208362)中进行治疗，以评估每周颅内输注自体il13rα2靶向性cart细胞(il13bbζtcm)在诊断为复发/难治性il13rα2+高级胶质瘤(whoiii和iv级)的患者中的安全性和可行性。这是一项双臂研究，其中t细胞直接施用于肿瘤(层1＝瘤内)或肿瘤切除腔(层2＝腔内)中。在完成六次腔内(ict)输注循环后，然后在允许il12bbζtcm的脑室内(icv)递送的分开同情使用方案下对该患者进行治疗。

实施例18：细胞产物制造和输注

本文详述了编码4-1bb共刺激性il13rα2靶向性car，il13bbζ的慢病毒载体。简而言之，密码子优化的car序列含有在单一位点处突变(e13y)以减少与il13rα1的潜在结合的膜栓系的人il-13配体、含有阻止fc受体介导的识别的两个突变(l235e；n297q)的人igg4fc间隔物、人cd4跨膜域、人共刺激4-1bb胞质信号传导域和人cd3ζ胞质信号传导域。然后，t2a核糖体跳跃序列将该il13bbζcar序列与截短的人cd19序列(cd19t)(一种惰性的非免疫原性细胞表面标志物)分开。

对于il13bbζtcm制造，在白细胞单采术当天，通过ficoll-paque(gehealthcare)上的密度梯度离心分离pbmc，然后在pbs/edta中洗涤两次。然后将pbmc在pbs中洗涤一次，重悬浮于含有10％胎牛血清(fcs)(hyclone)的xvivo15培养基(biowhittaker)中，转移至300cc转移袋中，并在室温(rt)下在3-d旋转器上储存过夜。次日，将5x109pbmc在300cc转移袋中在含有10％fcs的xvivo15中与临床级抗cd14(1.25ml)，抗cd25(2.5ml)和抗cd45ra(2.5ml)微珠(miltenyibiotec)在rt下温育30分钟。然后根据制造商的说明书(miltenyibiotec)使用clinimacs^tm消减模式立即消减cd14+，cd25+和cd45ra+细胞。离心后，将未标记的阴性细胞级份重悬浮于含有0.5％人血清白蛋白(hsa)(cslbehring)的clinimacs^tmpbs/edta缓冲液(miltenyibiotec)中，然后以0.6ml用临床级生物素化-dreg56mab(cohnmccbg)在rt下标记30分钟。然后洗涤细胞并重悬于终体积100ml含有0.5％hsa的clinimacs^tmpbs/edta中，并转移到新的300cc转移袋中。与1.25ml抗生物素微珠(miltenyibiotec)温育30分钟后，根据制造商的说明书在clinimacs^tm上用阳性选择纯化cd62l+级分(tcm)，并重悬于含有10％fcs的xvivo15中。

在富集2小时内，用gmp人t扩充剂cd3/cd28(invitrogen)以1∶3比率(t细胞∶珠)刺激26.9x10⁶个tcm，并在32vuelife组织培养袋(afc)中在5.5ml含有10％fcs，具有5μg/ml硫酸鱼精蛋白(apppharmaceutical)，50u/mlrhil-2和0.5ng/mlrhil-15的xvivo15中以moi0.3用临床级il13bbζ-t2a-cd19t_ephiv7转导，所述组织培养袋置于37℃，5％co2的培养架上的水平位置。然后根据需要加入x-vivo1510％fcs维持培养物，使细胞密度保持在4x10⁵-2x10⁶活细胞/ml，培养的每周一，周三和周五补充细胞因子(终浓度为50u/mlrhil-2和0.5ng/mlrhil-15)。基于培养体积，将t细胞转移至730vuelife袋(afc)。在慢病毒转导后7天，使用dynalclinexvivomagneticparticleconcentrator袋磁体除去cd3/cd28dynabeads，并将无珠t细胞排入新的730vuelife袋中。如guavapca所测定的，繁殖培养物直至产生约4.53x10⁸个细胞，此时收获培养物，在含有2％hsa的isolyte(braun)中洗涤，然后以约1.3x10⁷个细胞/ml重悬于cryostorcs5(biolifesolutions)中以使用mr.frosty(nalgene)和便携式控制速率冷冻系统(custombiogenics)进行冷冻保存。质量控制测试包括存活力、效力(cd19t表达)、身份(cd3表达)、转基因拷贝数(wpreqpcr)、复制能力病毒测试(在印第安纳大学(universityofindiana)的vsv-gqpcr和正式rcl测试)、残留珠计数、和无菌性。

如上所述，t2a核糖体跳跃序列12然后将该il13bbζ序列与cd19t(标记细胞转导的惰性非免疫原性细胞表面标志物)分开(图39a)。该t2a连接导致il13bbζ和cd19t两者从单个转录物的协调表达。

本文还详述了用于免疫磁性富集cd62l+cd45ra-cd4+cd8+中枢记忆t细胞(tcm)，慢病毒转导和离体扩增的制备方法。根据临床方案，过程结束(eop)冷冻保存的il13bbζtcm产物进行质量控制释放测试。对于每次输注，将t细胞解冻，洗涤并重新配制成含有2％人血清白蛋白(hsa)的不含药物防腐剂的生理盐水(pfns)中的0.5ml的最终体积。使用21号蝴蝶针将细胞手动注射到rickham储库中，在5-10分钟内递送0.5ml体积，然后通过对流增强递送(ced)以0.5ml/小时递送多达1mlpfns冲洗。

实施例19：临床成像

在siemensviro3tesla扫描仪上获得脑和脊柱的钆后t1加权mri序列。在施用莫迪司(multihance)后获得的轴向t1mpr加权图像上测量损伤。使用gediscoverydsthp60pet-ct扫描仪(70cm轴视场，切片厚度3.75mm)进行用18-f-氟脱氧葡萄糖(18-f-fdg)的成像。使用vitalimagesvitrea版本6.7.2软件获得最大标准化摄取值(suv)。放射科医生概述了造影剂增强肿瘤病灶的区域以测量最大肿瘤面积(mm2)，并且计算肿瘤体积(cm3)。

将质量控制释放的自体il13bbζtcm的冷冻保存的细胞库解冻并重新配制用于输注，其通过用含2％hsa的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，并重悬于含有2％hsa的不含药物防腐剂的生理盐水中进行。使用holter^tmrickhamventricululomyreservoir(codman)，用室导管(integrapudenz)和管心针将治疗性cart细胞递送到胶质瘤切除腔(ict)或侧室(icv)中。对于ict递送，在肿瘤切除时插入储库/导管系统，并且导管的尖端部分地嵌入切除壁中，以允许细胞递送到腔中和进入肿瘤周围的脑组织中。获得术后成像(ct和mri)以确认导管位置和肿瘤切除的程度。

实施例20：il13bbζtcm显示中枢记忆样t细胞表型

将富集的tcm(36x10⁶)离体刺激，慢病毒转导并扩增以在17天内产生638x10⁶个总细胞。最终的t细胞产物(cd3+和tcr+)由cd4(74％)和cd8(16％)t细胞亚组组成，并且表达il13bbζ和cd19t，基因修饰为在这两种细胞表面蛋白上共染色(图39a)。cart细胞产物表现出中枢记忆t细胞表型，表达cd45ro(97％)，cd62l(57％)，ccr7(28％)，cd28(97％)和cd27(59％)(图39a)。产物还表达了一些耗竭标志物，包括tim-3(65％)和lag-3(49％)，但没有显著水平的pd-1和klrg1(图39a)。

实施例21：il13bbζtcm的重复颅内输注的安全性和可耐受性

用通过两种不同的颅内递送途径经由储库/导管装置施用的il13bbζtcm的每周输注治疗患者，所述颅内递送途径是在肿瘤切除(循环1-6)和对脑脊液(csf)的脑室内(icv)递送(循环7-11)之后的腔内(ict)递送。最大细胞剂量10x10⁶个car+t细胞的11个颅内输注是耐受良好的，没有可能或更高归因于所观察到的治疗的3级或更高毒性(nci常见毒性标准)。cart细胞输注后发现的轻度事件包括。

*仅报告具有可能或更高可归因于的t细胞施用的事件；所有发生一次并且根据nci常见毒性标准是1-2级，没有观察到3级或更高级别的事件。

实施例22：临床响应

在治疗时，患者的肿瘤表现出具有不良预后特征的高度侵入性复发性gbm的特征。这包括在护理标准疗法后六个月内初步诊断起的复发的证据，多灶性肿瘤损伤的表现，包括脊柱损伤和广泛的柔脑膜疾病(图38)，去分化gbm的组织学特征和具有ki67方面染色呈阳性的超过60％细胞的高肿瘤增殖率(图37b)。如通过ihc对切除的肿瘤组织的ffpe评估的il13rα2的肿瘤表达在原发性和复发性肿瘤之间相似，h得分分别为100和80(图37)。复发性肿瘤的瘤内il13rα2表达是异质的，10％的细胞显示高染色强度(2-3+)，60％显示低表达(1+)，并且30％的细胞未染色高于背景(0+)。潜在感兴趣的是，在假性栅栏样(pseudopalisading)坏死的肿瘤区域中经常观察到最高水平的il13rα2表达(图37a)，这是对其他gbm肿瘤记录的表达模式。

在按照临床方案登记后，该患者对五个复发损伤中的三个进行手术切除(图38)，并且将储库/导管装置放置在右后颞枕区中最大复发性病灶(t1)的切除腔中。该患者最初按照方案进行治疗，每周6次腔内(ict)输注car+t细胞(2x10⁶循环1；10x10⁶循环2-6)(图1b)，并且在此时间期间，颞枕肿瘤损伤(t1)在手术后保持稳定超过45天而没有进展性疾病的证据(图39c)。然而，mri揭示了左颞叶中的其他未切除的肿瘤病灶(t4和t5)，以及与肿瘤3(t6)相邻的新复发病灶和嗅沟中的损伤(t7)在同一时期段内继续进展(图39c)。此外，还检测到脊柱中的转移性损伤，包括一个大肿瘤(270mm²)和超过一个小肿瘤病灶(＜1cm²)。这些结果虽然是混合的，但令人鼓舞，因为它们提示il13bbζtcm可能已经阻止切除的后颞枕区的疾病复发，然而，它们也提示局部ict传递不足以有效控制远离输液部位的远端位置处的肿瘤进展。

基于这些发现并且得到临床前研究支持，所述临床前研究显示cart细胞的icv递送可以在nsg小鼠模型中运输至多病灶gbm(数据未显示)，该患者按照同情使用方案登记并且通过每周五次icv输注il13bbζtcm(2x106循环7；10x10⁶循环8-11)治疗而没有任何其他治疗干预(图40a)。在三次icv输注(循环9；第133天)后一周，所有肿瘤损伤均显示出显著的消退，并且在最终icv输注(循环11；第156天)后，大多数颅内和脊柱肿瘤根据最大面积和体积测量两者已经消退超过70％(图40b-e，下表7和图41)。在最后一次icv输注(第190天)后6周的随访mr和pet成像(在此期间患者未接受其他治疗干预)显示疾病继续消退，所有肿瘤根据最大面积和体积测量两者均降低≥78％(图40b-e，下表7和图41)。在此190天的时间点，不可能区分疾病对炎症、瘢痕形成和/或硬膜增强的残留放射摄影证据。il13bbζtcm的icv递送引起脊柱中所有转移性肿瘤的几乎完全消除，最大损伤的最大面积减少97％，并且在icv治疗之前存在的超过10个中仅可见一个小肿瘤灶。在icv治疗的时间过程中，并且与肿瘤消退一致，患者能够将系统地塞米松(dexamethosome)从2mgbid降低至0.5mgqd。该患者保持临床稳定并恢复正常的生活和工作活动，从而支持该cart细胞介导的抗肿瘤响应的持久性。这些结果证明了基于严格的rano标准，用il13bbζtcm治疗介导接近完全的响应。

实施例23：cart细胞持久性和cns炎症应答

为了阐明在icv输注il3bbζtcm(循环6-11)后观察到的与抗肿瘤应答相关的免疫学变化，评估csf的细胞浸润，car+t细胞持久性和细胞因子水平。每次icv输注(即循环6-11的第1-2天)后立即，与输注前水平(每个循环的第0天)相比，每mlcsf的细胞数目增加7.0±3.6倍，并且与icv前(c7d0)水平相比增加153±128倍(图42)。csf中的总细胞数通常在7天的治疗循环内降低。如对c9d2所评估的，细胞浸润物包括大比例的cd3+t细胞，内源性和car表达性两者，以及cd14+cd11b+hla-dr+成熟髓样群体(图42a)。仅检测到罕见的cd19+b细胞和cd11b+cd15+粒细胞(图42a)。与流式细胞术数据一致，c11d1上的csf细胞病理学报告存在反应性淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞。

还在icv治疗过程内监测car-t持续性。由于用于循环7和8的csf中的低细胞回收率，分析聚焦于评估循环9和立即在循环10和11后的时间点。重要的是，在评估的所有时间点检测到car+t细胞(图42b)，包括c9d0，其对应于循环8后的第7天，因此证明了在输注后治疗性细胞持久至少7至8天。然而，当肿瘤负荷也显著降低时，输注后csf中的cart数目在后来的循环(c10d1和c11d1)时下降(图40b)。值得注意的是，未检测到循环9内csf中cart细胞的显著扩增，car+细胞数目在输注前(c9d0)起2天后(c9d2)增加1.6倍，然后到第8天(c9d8)减少2.3倍。

每次输注后免疫细胞(包括car+t细胞)的存在对应于csf中细胞因子水平的显著升高。在下表9和10中呈现所测量的30种细胞因子的测量水平和计算的相对于基线的倍数变化。值得注意的是，11种细胞因子在il3bbζtcm输注后立即从icv前基线(c7d0)增加超过10倍，包括细胞因子ifnγ，tnf，il-2，il-10，il-5，il-6，和il-8和趋化因子cxcl9/mig，cxcl10/ip-10，和ccr2/mcp-1和可溶性细胞因子受体il-1rα(图3c)。7种其它细胞因子显示从基线(c7d0)的大于5倍增加，包括g-csf，il-12，il2-r，il-4，il-7，和mip-1b。与icv前(c7d0)相比表现出在il3bbζtcm输注后立即的最高倍数增加的炎性细胞因子是il-2(对于c9d2为＞90倍)和ifn-γ可诱导趋化因子cxcl9和cxcl10(对于c8d1，c9d2，c10d1和c11d2为＞40倍)。这些细胞因子在治疗循环之间的7天内恢复到几乎基线水平。cart细胞输注后不显示显著增加的细胞因子包括il-3、rantes和vegf(表9和10)。

实施例24：患者样品处理和分析

根据临床方案，通过coh的病理学部门收集肿瘤切除材料。

如前所述，在福尔马林固定的石蜡包埋的样品的5μm切片上进行il13rα2免疫组织化学(ihc)，并且类似进行ki67ihc，只是通过ph8.0加热进行抗原修复并且与1∶75稀释的抗k167(dakocorp)温育。il-13rα2免疫反应性由临床神经病理学家评分，并基于表现出胞质和高尔基体样染色的弱(1+)，中等(2+)或强(3+)强度的肿瘤细胞的百分比进行定量。h得分通过以下公式获得：(强染色细胞的3倍百分比)+(中等染色细胞的2倍百分比)+弱染色细胞的百分比，给出0至300的范围。h得分可以如下转化成登记标准中描述的强度评分系统：0代表负(h得分0)，1+低(h得分1-100)，2+中等(h得分101-200)和3+高(h得分201-300)。纳入标准是评分1+染色强度的至少20％的细胞(＞20％，1+)，代表h得分20。适当的阳性(睾丸)和阴性(前列腺)对照用于il-13rα2ihc染色。“+”符号反映膜染色的存在。该测试已在希望之城国家医学中心病理学部分进行，并被视为对于研究是调查性的。该实验室通过1988年临床实验室改进修正案(clia)认证，有资格进行高复杂性临床实验室检测。

在vacutainer管±edta中收集外周血样品。在收到后立即将具有edta的样品进行ficoll处理，并且将外周血单个核细胞(pbmc)在-80℃在crystorcs5中冷冻，然后转移到液氮中长期存储。使不含edta的样品在室温下凝结2-3小时；通过离心收集血清，等分取样成一次性100-200μl等分试样，并储存在-80℃。在3cc注射器中从icv储库收集脑脊液(csf)，向下旋转，并将上清液等分取样并储存在-80℃。将csf细胞重悬浮在具有2％fcs和叠氮化钠的hbss-/-(corningcellgro)中以立即进行流式细胞分析，将剩余的细胞重悬浮并在-80℃冷冻在cryostorcs4中，然后转移至液氮长期存储。

通过流式细胞术使用缀合有荧光染料的对cd3，cd4，cd11b，cd14，cd19，cd27，cd28，cd62l，cd45ra，cd45ro，il-13，tcr-α/β(bdbiosciences)，klrg1，cd15(biolegend)，hla-dr，pd1(ebiosciences)，cd8(fisherscientific)，lag-3(lifespanbiosciences)，ccr7或tim-3(r&dsystems)特异性的抗体以及它们各自的同种型对照进行免疫细胞的细胞表面表型分析。

通过细胞因子珠阵列分析研究参与者血清和csf样品。使用人细胞因子30-plexpanel试剂盒(invitrogen)和(luminex)进行测定。