本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对serpina1基因突变位点检测的引物组，特别涉及用iontorrent半导体芯片测序技术对serpina1基因突变进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。
背景技术：
α1-抗胰蛋白酶缺乏症（α1-atdeficiency）是一种由α1-at基因（serpina1基因）突变引起的常染色体隐性遗传病，其特征是血清中α1-at水平下降。突变型最初在北欧、高加索人种中发现，以后传遍欧洲，又由于移民传至美国和其他国家。自1963年以来laurell与eriksson发现α1-抗胰蛋白酶(α1-antitypsin，简称α1-at)缺乏与肺气肿有密切关系，认为α1-at缺乏是家族性肺气肿的主要原因。α1-at的缺乏与婴幼儿肝硬化，肝癌的发病均有密切关系。
正常人血清中含有一种抑制蛋白酶活性的重要物质α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-at，omim#107400）。α1-at是由肝细胞分泌的糖蛋白，α1-at释放入血浆后构成α1-at球蛋白的主要成分。α1-at是人类血浆中最主要的一种蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor，简称pi)，它能与多种丝氨酸蛋白酶结合形成复合体，包括弹性蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，凝血酶及细菌蛋白酶，其重要的作用在于抑制中性粒细胞的弹性蛋白酶，弹性蛋白酶可作用于肺泡壁的弹性蛋白及其组织的结构蛋白而造成组织损害，因而α1-at的主要生理功能是保护下呼吸道及其他组织免受弹性蛋白酶的损伤。
α1-at不仅存在于血浆中，还广泛分布于尿液、唾液、支气管分泌物、泪液、脑脊液、羊水、初乳等体液，以及某些组织细胞的胞浆中。能抑制血清中大约90%的胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胶原酶、凝血酶和弹性蛋白酶等的活性。
serpina1基因（α1-at基因）位于14q32.1，为常染色体上的复等位基因，呈常染色体共显性遗传。该基因全长约12.3kb，含有7个外显子（a~g）、6个内含子（i~vi。最常见的α1-at基因突变型是s型和z型，都属于单碱基改变型。s型较z型更常见，还有一种无效型（null-null）很少见，其他突变型更罕见。s突变型是α1-at基因的外显子iii中发生单个碱基取代，致使合成的α1-at分子中的264glu被264val代替。这使得α1-at分子中的离子键丢失，改变了α1-at分子内部的结构，分子稳定性受到影响。z突变型是α1-at外显子e中发生单个碱基取代，其合成的α1-at分子中的342glu被342lys代替，这也使离子键丢失，α1-at分子的稳定性也受影响。无效突变个体的α1-at合成细胞中，α1-atmrna转录物缺失，表型的血清中完全测不到α1-at，z型和无效型个体都易发生肺气肿。
目前了解pi系统至少有33个等位基因型，m是最常见的基因型，正常人群中以pimm型最多见，在美国大约95%的人是pimm表现型。其血清α1-at含量基本正常。纯合子pizz型最少见，其血清α1-at严重缺乏，低于2mg/ml(仅为正常值的10%～20%)，血清α1-at明显缺乏是由于分子的c端第53位点上的赖氨酸被谷氨酸置换后，影响α1-at纯合子在婴儿期即可出现梗阻性黄疸。中间表现型pimz、pisz、pims等型的血清α1-at可能低至正常的40%以下，一般不会伴有肝脏病。
α1-抗胰蛋白酶缺乏症致病基因serpina1突变位点：
上述突变位点已覆盖绝大部分由于serpina1基因缺陷导致的α1-抗胰蛋白酶缺乏症。
目前检测serpina1基因突变位点的方法有pcr-sscp、经典测序等，存在通量低、成本贵等问题，对pcr产物长度也有一定限制。
iontorrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定dna链，随后依次掺入单核苷酸dgtp、dctp、datp、dttp。随着每个碱基的掺入，释放出h+，h+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对h+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。
iontorrent半导体芯片测序技术与传统sanger法及二代测序技术比较，iontorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对h+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1g通量的测序检测仅需2~3小时，是传统sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。
目前尚没有报道iontorrent半导体芯片测序技术专门用于serpina1基因突变位点的检测。
技术实现要素：
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对serpina1基因突变的定性、定量检测的方法及其引物。
为解决上述问题，本发明采取以下技术方案：
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的α1-抗胰蛋白酶缺乏症相关serpina1基因的7个热点突变位点核酸序列信息，用primerexpresssoftware5.0软件设计pcr引物。
用于检测serpina1基因位点serpina1(p.l41p)、serpina1(p.f52del)、serpina1(p.s53f)、serpina1(p.g67e)的引物，是由序列表中seqidno:1和seqidno:2组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattatgagttcgccttcagcctat-3’seqidno:1；
下游引物：5’-ccaggatttcatcgtgagtgtc-3’seqidno:2。
用于检测serpina1基因位点serpina1(p.e264v)的引物，是由序列表中seqidno:3和seqidno:4组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattaaatgccaccgccatcttc-3’seqidno:3；
下游引物：5’-ttggggaatcaccttctgtct-3’seqidno:4。
用于检测serpina1基因位点serpina1(p.e342k)、serpina1(p.p369l)的引物，是由序列表中seqidno:5和seqidno:6组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattaaaggctgtgctgaccatcg-3’seqidno:5；
下游引物：5’-aagagaggagacttggtattttgttc-3’seqidno:6。
采用多重pcr的方法用上述引物组对待检测样本进行pcr扩增。
将pcr扩增产物进行扩增子文库的构建、isp（ionsphere™particles,ion微球）模板的制备，在iontorrentpgm系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
本发明利用多重pcr方法结合iontorrent半导体芯片测序技术同时对α1-抗胰蛋白酶缺乏症相关serpina1基因的7个热点突变位点进行并行检测，检测结果用于筛选抗胰蛋白酶缺失疑似个体相关基因相应位置是否存在突变，评价被检测者发生抗胰蛋白酶缺失的风险。其优势在于通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。
具体实施方式
本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1、用于serpina1基因突变检测的引物组的设计。
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的α1-抗胰蛋白酶缺乏症相关serpina1基因的7个热点突变位点核酸序列信息，用primerexpresssoftware5.0软件设计pcr引物。
用于检测serpina1基因位点serpina1(p.l41p)、serpina1(p.f52del)、serpina1(p.s53f)、serpina1(p.g67e)的引物，是由序列表中seqidno:1和seqidno:2组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattatgagttcgccttcagcctat-3’seqidno:1；
下游引物：5’-ccaggatttcatcgtgagtgtc-3’seqidno:2。
用于检测serpina1基因位点serpina1(p.e264v)的引物，是由序列表中seqidno:3和seqidno:4组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattaaatgccaccgccatcttc-3’seqidno:3；
下游引物：5’-ttggggaatcaccttctgtct-3’seqidno:4。
用于检测serpina1基因位点serpina1(p.e342k)、serpina1(p.p369l)的引物，是由序列表中seqidno:5和seqidno:6组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattaaaggctgtgctgaccatcg-3’seqidno:5；
下游引物：5’-aagagaggagacttggtattttgttc-3’seqidno:6。
每个检测序列片段的上游引物5’端均包含一段用于识别样本信息的barcode序列5’-agtagaatta-3’。
实施例2、serpina1基因突变的检测。
1）样本基因组dna的获取。
用qiagendna抽提试剂盒提取全血样本的基因组dna。
2）pcr的扩增和测序。
以步骤1）提取的样本基因组dna为模板，在实施例1所述引物的引导下，进行多重pcr扩增(95℃5min;95℃15s，60℃1min，共40个循环)，获得的扩增产物依次进行扩增子文库的构建，isp（ionsphere™particles,ion微球）模板的制备，以及芯片上样和在iontorrentpgm系统上进行测序。
3）分析并获得结论。
用igv2.0软件对测序结果进行分析，统计以下7个serpina1基因突变位点的读序结果，根据检测结果对每个突变位点进行判断其为野生型或突变性，如为野生型，则结果提示为“wild_type”，如为突变型，则结果提示为“mutation(homo)”。
如在所有检测位点中存在“mutation(homo)”结果，则本次检测的结论为：“该受检者所检serpina1基因中检出×××（突变位点）突变阳性，提示罹患α1-抗胰蛋白酶缺乏症风险高”。
如在所有检测位点中均为“wild_type”结果，则本次检测的结论为：“该受检者所检serpina1基因中未检出突变”。
本次检测共检测1个样本，检测结果及结论见下表。
序列表
<110>上海联吉医学检验所有限公司
<120>一种serpina1基因突变的检测方法及其引物组
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agtagaattatgagttcgccttcagcctat30
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ccaggatttcatcgtgagtgtc22
<210>3
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
agtagaattaaatgccaccgccatcttc28
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ttggggaatcaccttctgtct21
<210>5
<211>29
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
agtagaattaaaggctgtgctgaccatcg29
<210>6
<211>26
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
aagagaggagacttggtattttgttc26