本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对lct基因突变位点检测的引物组，特别涉及用iontorrent半导体芯片测序技术对lct基因突变进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。
背景技术：
乳糖不耐症主要有四种。
第一种称为原发性乳糖酶缺乏症（primarylactoseintolerance），占全部病例的约70%，病因与乳糖酶表达时信使rna的缺失有关。这种情况在不同地区所占比例和乳糖不耐发生年龄差异很大，工业和商品乳制品不普遍的亚洲和非洲很多地区比较常见，在亚洲和美洲印第安人中约占100%。2002年，芬兰的研究人员还曾发现了基因多样性与成人乳糖不耐症之间的紧密联系。在接受调查的236个芬兰人中，编码乳糖水解酶的基因上游不远处的一个碱基的突变与乳糖不耐症有100%的正相关——也就是说，我们几乎可以肯定这个基因突变是造成这些受试者乳糖不耐症的原因。同时，在这些受试者中，还发现另一处突变与229人的乳糖不耐症形成有关。
第二种是继发性乳糖酶缺乏症（secondarylactasedeficiency），也多为环境因素导致，例如胃肠道的各种疾病。小肠中的寄生虫感染可以导致乳糖酶的合成被永久破坏。肠胃炎也是导致暂时性的乳糖不耐症的一个常见原因，尤其是轮状病毒（rotavirus）感染导致的肠胃炎（也有感染后不发病的报道）。婴幼儿严重营养不良也可能会导致继发性乳糖不耐症。
第三种即发育（新生儿）乳糖酶缺乏症（developmental(neonatal)lactasedeficiency）。妊娠34周后胃肠道才能产生乳糖酶和其他的二糖酶。多见于婴儿，调整饮食对患儿有帮助。
第四种即先天性乳糖酶缺乏症（congenitallactasedeficiency），即某种基因缺陷导致乳糖不耐者不能合成乳糖酶。在婴儿中比较罕见，但对于母乳喂养的患儿来说却是致命的，因为对他们而言母乳或牛奶是主要的能量来源；而这时他们却不能获得维持生存的足够能量。患有这种乳糖不耐症的婴儿只能依靠食用经过处理脱去了乳糖的商品奶制品。该疾病是常染色体隐性遗传的新生儿胃肠道疾患。在小肠粘膜乳糖酶活性降的很低，导致哺乳或进食配方奶后发生大量的水样腹泻，但是十二指肠形态、麦芽糖酶、蔗糖酶及异麦芽糖酶活性均正常；这些婴儿发生严重的渗透性腹泻常伴随脱水、酸中毒和体重下降。尽管这些，先天性乳糖酶缺乏的婴儿在摄入无乳糖酶食物，这些症状可以迅速的平息，能够正常的身体和精神的成长。
先天性乳糖酶缺乏症主要通过介导无意义的lct基因的mrna降解完成，lct基因位于2q21染色体上。
乳糖不耐症在不同地区的发生率差异显著。亚洲人（包括北美印第安人）患乳糖酶缺失症的比例高于欧美人。在泰国，大约97%的人不能耐受乳糖；而在丹麦只有3%；非洲某些地区的原住民也很少发生该病。
先天性乳糖酶缺乏症致病基因突变位点：
人群覆盖比例：lct(p.y1390x)覆盖超过约80%的异常型携带者。
目前检测lct基因突变位点的方法有主要为经典测序等，存在通量低、成本贵等问题，对pcr产物长度也有一定限制。
iontorrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定dna链，随后依次掺入单核苷酸dgtp、dctp、datp、dttp。随着每个碱基的掺入，释放出h+，h+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对h+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。
iontorrent半导体芯片测序技术与传统sanger法及二代测序技术比较，iontorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对h+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1g通量的测序检测仅需2~3小时，是传统sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。
目前尚没有报道iontorrent半导体芯片测序技术专门用于lct基因突变位点的检测。
技术实现要素：
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对lct基因突变的定性、定量检测的方法及其引物。
为解决上述问题，本发明采取以下技术方案：
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的先天性乳糖酶缺乏症致病基因lct的2个热点突变位点核酸序列信息，用primerexpresssoftware5.0软件设计pcr引物。
用于检测lct基因位点lct(p.g1363s)、lct(p.y1390x)的引物，是由序列表中seqidno:1和seqidno:2组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattagccagatactacacagaggtcattac-3’seqidno:1；
下游引物：5’-gtcccaccatcctgaactcc-3’seqidno:2。
采用多重pcr的方法用上述引物组对待检测样本进行pcr扩增。
将pcr扩增产物进行扩增子文库的构建、isp（ionsphere™particles,ion微球）模板的制备，在iontorrentpgm系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
本发明利用多重pcr方法结合iontorrent半导体芯片测序技术同时对先天性乳糖酶缺乏症致病基因lct的2个热点突变位点进行并行检测，检测结果用于筛选新生儿个体这些基因相应位置是否存在突变，评价新生儿个体发生相关单基因遗传病的风险。其优势在于通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。
具体实施方式
本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1、用于lct基因突变检测的引物组的设计。
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的先天性乳糖酶缺乏症致病基因lct的2个热点突变位点核酸序列信息，用primerexpresssoftware5.0软件设计pcr引物。
用于检测lct基因位点lct(p.g1363s)、lct(p.y1390x)的引物，是由序列表中seqidno:1和seqidno:2组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattagccagatactacacagaggtcattac-3’seqidno:1；
下游引物：5’-gtcccaccatcctgaactcc-3’seqidno:2。
每个检测序列片段的上游引物5’端均包含一段用于识别样本信息的barcode序列5’-agtagaatta-3’。
实施例2、lct基因突变的检测。
1）样本基因组dna的获取。
用qiagendna抽提试剂盒提取全血样本的基因组dna。
2）pcr的扩增和测序。
以步骤1）提取的样本基因组dna为模板，在实施例1所述引物的引导下，进行多重pcr扩增(95℃5min;95℃15s，60℃1min，共40个循环)，获得的扩增产物依次进行扩增子文库的构建，isp（ionsphere™particles,ion微球）模板的制备，以及芯片上样和在iontorrentpgm系统上进行测序。
3）分析并获得结论。
用igv2.0软件对测序结果进行分析，统计以下2个lct基因突变位点的读序结果，根据检测结果对每个突变位点进行判断其为野生型或突变性，如为野生型，则结果提示为“wild_type”，如为突变型，则结果提示为“mutation(homo)”。
如在所有检测位点中存在“mutation(homo)”结果，则本次检测的结论为：“该受检者所检lct基因中检出×××（突变位点）突变阳性，提示罹患先天性乳糖酶缺乏症风险高”。
如在所有检测位点中均为“wild_type”结果，则本次检测的结论为：“该受检者所检lct基因中未检出突变”。
本次检测共检测1个样本，检测结果及结论见下表。
序列表
<110>上海联吉医学检验所有限公司
<120>一种lct基因突变的检测方法及其引物组
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agtagaattagccagatactacacagaggtcattac36
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gtcccaccatcctgaactcc20