本发明涉及一种抗肿瘤药物的研发，其具有薁并吡唑稠环结构，具有良好的吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)抑制活性，能够用于ido酶介导疾病的治疗或预防。
背景技术：
吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,ido)是由ido基因编码的酶类，是将人体内色氨酸降解为犬尿氨酸的限速酶，犬尿氨酸可直接抑制效应t细胞的功能，同时微环境中色氨酸耗竭也会抑制t细胞增殖，从而通过多途径发挥免疫抑制的作用。肿瘤细胞表达ido使得其所处的微环境出现“色氨酸饥饿”，抑制t细胞增殖，同时，色氨酸代谢产物对t细胞亦存在细胞毒性作用。肿瘤诱导ido表达主要受干扰素影响，而其机制是肿瘤微环境中的cd4+cd25+调节性t细胞(treg)高表达可溶性ctla所致。很多肿瘤高表达ido从而逃避t细胞的攻击。因此，ido抑制剂能调节肿瘤微环境的色氨酸含量，避免肿瘤微环境中t细胞增殖受抑制，成为潜在的免疫治疗靶点。
目前正开发ido的小分子抑制剂来治疗或预防ido相关的疾病，例如wo99/29310、ep1501918、wo2004/094409、cn103547579等，试验数据表明，ido酶抑制剂可以用于激活t细胞，能够用于免疫抑制、肿瘤耐受或排斥反应、慢性感染、hiv感染、自身免疫性疾病等的治疗或预防，是上述疾病患者可选择的重要的治疗策略。目前，已有ido抑制剂在ⅰ/ⅱ期临床研究在进行中，评估其在晚期癌症中的疗效和安全性。
目前报道的ido酶抑制剂化合物种类依然较少，亟需提供更多结构新颖、具有良好抑制活性的ido酶抑制剂，为广大患者提供新的选择。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有ido酶抑制活性的薁并吡啶稠环化合物及其制备方法和应用。
所述薁并吡啶稠环化合物具有通式i所示结构：
其中基团r选自氢、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c6-c12芳基、取代或未取代的c1-c6杂芳基、取代或未取代的c3-c9环烷基、取代或未取代的c1-c6杂环烷基；r1选自氢、烷基、卤素、氰基、硝基、三氟甲基。
进一步的，基团r选自由羟基、氰基、取代或未取代的c3-c6环烷基、取代或未取代的c6-c12芳基、取代或未取代的c1-c6杂芳基、取代或未取代的c1-c6杂环烷基取代的c1-c6烷基；或基团r选自由卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、硝基、羟基、三氟甲基取代的苯基或吡啶基或环己基；
所述取代的是指由选自卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、硝基、羟基、三氟甲基的基团进行的取代。
所述薁并吡唑稠环化合物具体选自以下化合物：
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述薁并吡唑稠环化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物，以及药学上可接受的载体。其中，药学上可接受的盐是指能够与所述化合物通过酸碱反应成盐的常见的药学上可接受的酸，如盐酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、醋酸、甲酸、柠檬酸、亚磷酸、琥珀酸等，形成的盐；水合物是指所述化合物或其盐与水形成的结晶性产物，可以是半水合物、一水合物或多水合物；溶剂化物是指溶剂与所述化合物或其盐形成的结晶性产物，包含常见的溶剂类型，例如甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、dmf等。
本发明还涉及一种所述薁并吡唑稠环化合物的应用，用于制备治疗或预防肿瘤、hiv、自身免疫性疾病的药物，所述治疗或预防是通过调节ido酶抑制活性实现的。进一步的，所述肿瘤可以选自肺癌、肝癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、白血病、骨癌、胰腺癌、泌尿系统的癌症等；自身免疫性疾病选自老年痴呆、狼疮、风湿性关节炎等。
本发明所述薁并吡唑稠环化合物是通过以下步骤制备获得的：
具体包括以下反应过程：
1)，2-羰基-3-(n,n-二甲基胺基亚甲基)薁的制备
称取一定量的2-羟基薁于圆底烧瓶，有机溶剂溶解，再加入1.0-3.0当量的碱，室温下搅拌5分钟，滴加1.0-1.2当量的n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛，加热回流反应，待反应结束，减压浓缩后硅胶柱层析分离纯化，得到2-羰基-3-(n,n-二甲基胺基亚甲基)薁；
当r为取代或未取代的c1-c6烷基时
2)，称取一定量的2-羰基-3-(n,n-二甲基胺基亚甲基)薁于圆底烧瓶，乙醇溶解，再加入1.0-4.0当量水合肼，加热回流反应，待反应结束，减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，获得薁并吡唑稠环化合物；
3)，将步骤2)制备获得的薁并吡唑稠环化合物溶于乙腈，再加入1.0-2.0当量相应的卤代化合物，碱性条件下，加热回流，待反应结束，减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，得到目标产物；
当r为取代或未取代的c6-c12芳基、取代或未取代的c1-c6杂芳基、取代或未取代的c3-c9环烷基、取代或未取代的c1-c6杂环烷基时
2)′，称取一定量的2-羰基-3-(n,n-二甲基胺基亚甲基)薁于圆底烧瓶，乙醇溶解，再加入1.0-4.0当量相应肼衍生物的盐酸盐，加热回流反应，待反应结束，减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，获得目标化合物。
进一步的，步骤1)中，有机溶剂包括乙醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、乙酸乙酯；所述碱包括碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、醋酸钠、醋酸钾、碳酸铯、三乙胺、吡啶；步骤3)中，所述碱包括碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、三乙胺、吡啶。
本发明提供的化合物结构新颖，细胞试验证明，其具有良好的ido酶抑制活性，是潜在的肿瘤、hiv、自身免疫性疾病治疗或预防的活性化合物，具有极大的药物研发价值。
具体实施方式
实施例1
2-羰基-3-(n,n-二甲基胺基亚甲基)薁的合成
称取2-羟基薁(7.21g，50mmol)于圆底烧瓶，150ml乙醇溶解，再加入na2co3(8.48g，80mmol)，室温下搅拌5分钟，滴加1.0-1.2当量的n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(6.55g，55mmol)，加热回流反应，tlc监测反应进程，待反应结束，减压浓缩后，经硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷与乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得到2-羰基-3-(n,n-二甲基胺基亚甲基)薁(5.77g，29mmol)，产率58％。
c13h13no,ms(esi-ms):m/z＝199.11，1hnmr(600mhz，hccl3)，6.69(1h),6.58(1h),6.42-6.46(5h),3.13(6h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，187.1,166.2,163.5,158.4，144.9,138.0,136.4,135.3,128.6,123.3,122.5,44.7。
实施例2
薁并吡唑稠环的合成
称取2-羰基-3-(n,n-二甲基胺基亚甲基)薁(10.00g，50mmol)于圆底烧瓶，100ml乙醇溶解，再加入40％重量的水合肼溶液(12.51g，约100mmol)，加热回流反应，tlc监测反应进程，待反应结束，减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇混合溶液梯度洗脱，获得薁并吡唑稠环化合物(6.90g，41mmol)，产率82％。
c11h8n2,ms(esi-ms):m/z＝168.09，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),7.57(1h)，7.43(1h)，7.32(1h)，7.13(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，141.1,138.6,136.7,134.8,133.2,132.4,127.3,124.7,123.0,121.2,104.7。
实施例3
化合物
称取2-羰基-3-(n,n-二甲基胺基亚甲基)薁(10.00g，50mmol)于圆底烧瓶，150ml乙醇溶解，再加入苯肼盐酸盐(7.95g，55mmol)，加热回流反应，tlc监测反应进程，待反应结束，减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇混合溶液梯度洗脱，获得目标产物(10.7g，44mmol)，产率88％。
c17h12n2,ms(esi-ms):m/z＝244.09，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),8.19(1h),7.43-7.60(7h),7.11(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.9,139.2,136.7,135.8，130.2,127.4,126.3,124.5,123.1,102.6。
实施例4
化合物
与实施例3制备过程相同，收率85％。
c18h14n2,ms(esi-ms):m/z＝258.11，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),8.18(1h),7.41-7.61(6h),7.11(2h)，2.41(3h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ,140.9,139.3,136.6,135.8,130.3,127.5,126.4,124.5,123.2,102.5,21.3。
实施例5
化合物
与实施例3制备过程相同，收率87％。
c17h11fn2,ms(esi-ms):m/z＝262.28，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),8.19(1h),7.42-7.61(6h),7.12(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，160.4,140.6,138.3,136.6,135.3,134.6,127.3,124.4,124.1,123.0,121.3,116.1,115.4,102.5。
实施例6
化合物
与实施例3制备过程相同，收率79％。
c18h14n2o,ms(esi-ms):m/z＝274.11，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),8.17(1h),7.41-7.60(6h),7.11(2h),3.81(3h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，158.2,140.5,138.1,136.7,135.3,134.4,127.4,124.5,124.0,123.1,121.4,116.2,115.3,102.4,55.9。
实施例7
化合物
与实施例3制备过程相同，收率87％。
c18h11n3,ms(esi-ms):m/z＝269.10，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.28(2h),8.17(1h),7.40-7.58(6h),7.10(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，144.6,138.4,136.2,135.1,134.2,127.2,124.4,124.0,123.1,121.3,118.1,110.3,102.3。
实施例8
化合物
与实施例3制备过程相同，收率85％。
c17h10f2n2,ms(esi-ms):m/z＝280.08，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),8.18(1h),7.52(1h),7.37(2h),7.19(1h),7.12(2h),7.02(1h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，150.4,147.6,138.1,136.5,135.3,134.5,127.4,124.3,124.2,123.0,121.3,117.2,115.4,111.3,102.5。
实施例9
化合物
与实施例3制备过程相同，收率81％。
c16h11n3,ms(esi-ms):m/z＝245.10，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.44(1h),8.37(1h),8.30(2h),8.18(1h),7.42-7.70(4h),7.11(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，147.1,140.1,138.5,136.9,135.4,134.7,127.9,124.3,124.0,123.6,121.3,99.7。
实施例10
化合物
在圆底烧瓶中，将通过实施例2所述方法制备获得的薁并吡唑稠环化合物(8.42g，50mmol)溶于100ml乙腈，碳酸铯(32.58g，100mmol)，碘化亚铜(1.91g，10mmol)催化，再加入碘丙烷(10.21g，60mmol)，避光条件下加热回流反应，tlc监测反应进程，待反应结束，过滤，水洗，有机相减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷与乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得到目标产物(7.12g，34mmol)，收率68％。
c14h14n2,ms(esi-ms):m/z＝210.27，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),7.96(1h),7.52(1h),7.38(1h),7.14(2h),4.45(2h),1.71(2h),0.91(3h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.1,138.9,138.5,136.4,134.7,127.3,126.3,124.5,123.1,121.3,99.9,59.1,23.1,11.5。
实施例11
化合物
在圆底烧瓶中，将通过实施例2所述方法制备获得的薁并吡唑稠环化合物(8.41g，50mmol)溶于100ml乙腈，碳酸铯(32.55g，100mmol)，碘化亚铜(1.92g，10mmol)催化，再加入2-碘代乙醇(12.05g，70mmol)，避光条件下加热回流反应，tlc监测反应进程，待反应结束，过滤，水洗，有机相减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷与乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得到目标产物(7.12g，26mmol)，收率52％。
c13h12n2o,ms(esi-ms):m/z＝212.25，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),7.97(1h),7.52(1h),7.38(1h),7.14(2h),3.93(2h),3.64(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.6,138.8,138.6,136.6,134.8,127.3,126.0,124.5,123.1,121.3,100.1,60.1,58.5。
实施例12
化合物
与实施例10制备方法相同，收率71％。
c19h22n2,ms(esi-ms):m/z＝278.40，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),7.96(1h),7.52(1h),7.37(1h),7.14(2h),4.46(2h),1.69(2h),1.50(1h),1.37-1.45(10h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.7,138.7,138.5,136.6,134.8,127.3,126.1,124.5,123.2,121.3,100.2,54.7,33.5,31.4,26.1,25.7。
实施例13
化合物
与实施例10制备方法相同，收率63％。
c19h22n2o,ms(esi-ms):m/z＝294.40，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),7.97(1h),7.52(1h),7.37(1h),7.14(2h),4.46(2h),3.54(1h),1.68(2h),1.51(1h),1.39-1.47(8h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.6,138.7,138.6,136.7,134.8,127.3,126.1,124.5,123.2,121.3,100.1,69.7,54.7,34.3,33.8,31.4,29.2。
实施例14
化合物
与实施例10制备方法相同，收率66％。
c18h22n4,ms(esi-ms):m/z＝294.41，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),7.97(1h),7.53(1h),7.37(1h),7.12(2h),5.46(2h),3.74(2h),2.28(8h),2.11(3h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.6,138.7,138.5,136.7,134.8,127.2,126.2,124.5,123.2,121.3,100.1,57.7,55.5,46.4,45.1。
实施例15
化合物
与实施例10制备方法相同，收率70％。
c17h19n3o,ms(esi-ms):m/z＝281.36，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),7.98(1h),7.53(1h),7.36(1h),7.13(2h),5.46(2h),3.75(2h),3.55(4h),2.38(4h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.6,138.6,138.5,136.7,134.8,127.3,126.2,124.5,123.2,121.3,100.1,66.7,55.8,54.4,45.2。
实施例16
化合物
与实施例10制备方法相同，收率74％。
c16h16n2,ms(esi-ms):m/z＝236.33，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),7.97(1h),7.52(1h),7.37(1h),7.12(2h),4.46(2h),1.65(2h),1.05(1h),0.22-0.38(4h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.8,138.7,138.5,136.6,134.7,127.2,126.2,124.5,123.2,121.3,100.2,54.7,36.8,8.4,4.2。
实施例17
化合物
与实施例10制备方法相同，收率77％。
c18h20n2,ms(esi-ms):m/z＝264.36，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),7.98(1h),7.52(1h),7.38(1h),7.12(2h),4.46(2h),1.69(2h),1.45(1h),1.28-1.39(8h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.7,138.9,138.3,136.4,134.7,127.2,126.4,124.5,123.2,121.3,100.1,54.7,35.8,32.4,31.2,25.1。
实施例18
化合物
在圆底烧瓶中，将通过实施例2所述方法制备获得的薁并吡唑稠环化合物(8.40g，50mmol)溶于100ml乙腈，碳酸钾(13.83g，100mmol)，再加入溴化苄(9.41g，55mmol)，加热回流反应，tlc监测反应进程，待反应结束，过滤，水洗，有机相减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷与乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得到目标产物(10.85g，42mmol)，收率84％。
c18h14n2,ms(esi-ms):m/z＝258.32，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),7.97(1h),7.52(1h),7.35-7.39(6h),7.12(2h),5.47(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.6,138.8,138.2,136.4,134.8,128.6,127.5,126.4,126.0,124.5,123.2,121.3,100.2,57.4。
实施例19
化合物
与实施例18制备方法相同，收率80％。
c18h14n2o,ms(esi-ms):m/z＝274.32，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),7.96(1h),7.52(1h),7.38(1h),7.12(2h),7.01(1h),6.95(2h),6.77(2h),5.48(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.8,138.6,138.2,136.4,134.8,129.5,128.6,127.5,126.4,126.0,124.5,123.2,121.3,119.6,115.2,100.2,54.4。
实施例20
化合物
与实施例18制备方法相同，收率87％。
c18h11cl3n2,ms(esi-ms):m/z＝361.64，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),7.95(1h),7.56(2h),7.51(1h),7.37(1h),7.12(2h),5.48(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.6,138.5,138.1,137.4,134.8,129.5,128.6,127.5,126.4,126.0,124.5,123.2,121.3,100.2,50.1。
实施例21
化合物
与实施例18制备方法相同，收率79％。
c18h14n2o,ms(esi-ms):m/z＝274.32，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.30(2h),7.96(1h),7.52(1h),7.38(1h),7.12(2h),7.02(1h),6.95(2h),6.63(2h),5.46(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.9,138.6,138.2,136.5,134.8,129.5,128.6,127.5,126.4,126.0,124.7,123.2,121.3,119.4,115.2,100.1,54.9。
实施例22
化合物
与实施例18制备方法相同，收率85％。
c19h13f3n2,ms(esi-ms):m/z＝326.32，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.31(2h),7.96(1h),7.52(1h),7.46(2h),7.38(1h),7.12(2h),7.07(2h),5.48(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，140.7,139.5,138.6,136.5,134.8,128.0,127.5,126.1,124.5,123.2,121.3,100.1,57.3。
实施例23
化合物
与实施例18制备方法相同，收率86％。
c18h12f3n3,ms(esi-ms):m/z＝327.31，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.41(1h),8.30(2h),7.95(1h),7.62(1h),7.51(1h),7.38(1h),7.17(1h),7.11(2h),5.32(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，155.3,149.4,140.6,139.5,138.6,136.1,134.8,127.3,126.2,124.5,123.3,121.3,100.1,60.9。
实施例24
化合物
与实施例18制备方法相同，收率81％。
c17h13n3o,ms(esi-ms):m/z＝275.31，1hnmr(600mhz，hccl3)，8.41(1h),8.30(2h),7.95(1h),7.62(1h),7.51(1h),7.38(1h),7.17(1h),7.11(2h),5.32(2h)；13cnmr(600mhz，hccl3)δ，153.1,149.0,140.6,138.6,136.1,134.8,131.1,126.3,124.7,123.7,123.0,121.2,100.1,60.9。
化合物活性测试实验
材料：缓冲液，50mmmes,ph6.5；0.405mtris,ph8.0；重组人-ido酶(catalog#6030-ao)；l-抗坏血酸，配成500mm的去离子水溶液；l-色氨酸配成10mm的去离子水溶液；催化酶(sigma)，用缓冲液配成100000u/ml的溶液；甲基蓝，配成10mm的去离子水溶液；读数仪器：spectramaxplusbymoleculardevices。
将l-抗坏血酸溶液用tris缓冲液稀释至80mm；用缓冲液配置800uml-色氨酸，9000u/ml催化酶，40um甲基蓝的底物混合溶液；待用。37℃下，将重组人-ido酶用缓冲液稀释至20ng/ul；滴加50ul至培养板中，然后加入50ul不同浓度的薁并吡唑稠环化合物，薁并吡唑稠环化合物终浓度分别设置为0、1、5、10、50、100、200μmol/l，记录酶标仪321nm处读数，与空白对照比对，以1-mt作为阳性对照。重复上述实验三次，计算ic50值。测试结果见表1。
表1：本发明所述薁并吡唑稠环化合物对重组人-ido酶抑制活性数据
从表1可以看出，本发明制备的薁并吡唑稠环化合物对重组人-ido酶具有较好的抑制活性，显著优于已知的1-mt。特别是环己烷取代的乙基取代的衍生物，其ic50值达到21、27μmol/l，具有极好的ido酶抑制活性，是潜在的药用化合物。