本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及一种敲除toll样受体3(htlr3)的a549细胞模型。
背景技术：
：免疫系统的最基本功能是识别外源抗原并诱导机体产生一系列反应清除外源致病性物质，以保持机体的稳定性。机体对病毒和细菌的初次免疫应答一般认为是非特异性的，但是，toll样受体(toll-likereceptor,tlr)的发现则说明机体可特异性识别病毒和细菌的免疫应答。天然免疫细胞所识别的主要靶分子称为病原相关的分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns,pamps)，pamps是众多微生物共有的一种保守的模式分子，广泛存在于病原体细胞表面，如内毒素、肽聚糖、鞭毛蛋白、双链rna以及酵母细胞壁上的甘露糖等。识别pamps的受体称为模式识别受体(patternrecognitionreceptor，prrs)。tlrs分子即是一类重要的prr，迄今已在哺乳类动物中发现10种tlr，称为tlr受体家族。tlr3是toll样受体(tlr)家族中的重要成员之一，是病毒双链rna的模式特异性识别受体，通过独特的信号传导途径在抗感染、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的发生发展过程中重要作用，是疾病防治和药物开发的重要靶点。tlr3最丰富的表达在胎盘和胰腺。tlr3识别配体后通过含tir结构域的转接蛋白(trif)途径活化转录因子nf-κb和干扰素调节因子3(irf3)，诱导炎症细胞释放炎症因子并介导炎症反应，同时诱导i型干扰素的释放，介导抗病毒天然免疫。单纯疱疹病毒性脑炎2由hsv-ii型病毒引起，约占单纯疱疹病毒性脑炎6％～15％，hsv-2主要引起生殖器疱疹，由其所致hse主要见于新生儿，分娩时生殖道分泌物与胎儿接触是导致新生儿感染的主要原因。hsv-2原发感染也见于年轻人，可通过性接触传播，引起成年人的无菌性脑膜炎。因此在这些病毒感染，如单纯疱疹病毒性脑炎2、人类免疫缺陷病毒-1等中，tlr3通过诱导组织损伤介导病毒的扩散从而加重疾病的严重程度。人tlr3基因定位于4q35，其开放读码框有4个外显子编码，由2715核苷酸组成，编码由904个氨基酸组成蛋白质，其中前21个氨基酸组成信号肽，第21-904为成熟的tlr3分子。tlr3的信号传导包括两条途径，即髓样细胞分化因子88(myd88)依赖和非依赖途径。myd88依赖的信号传导途径是tlr信号传导的共同途径。在myd88依赖性途径中，当相应配体同tlr结合后可促使受体发生二聚化，其胞质区通过tir结构域募集myd88，结合后引发的下游因子作用，主要包括以下几个方面：(1)myd88与tlr胞内区的tir区结合，作为接头蛋白募集irak(il-1受体相关激酶)；(2)irak结合tnf受体相关因子6(traf6)从而活化tak1；(3)traf6的活化引起两条不同途径的信号转导：一条包括p38mapk家族和c-junn-端激酶jnk；另一条是包括rel家族转录因子nf-κb的途径。此外，两个接头蛋白(trif或ticam-1)能介导tlr3诱导的ifn-β的产生，所以该接头蛋白可能与myd88非依赖的信号传导途径有关。tlr3可通过myd88依赖途径诱导炎症性细胞因子如il-1、tnf-α、il-6和il-12的表达，参与非特异性抗病毒反应，同时通过myd88非依赖途径诱导共刺激分子cd80和cd86以及ifn-β、ip-10等抗病毒性细胞因子的表达，参与诱导dc的分化成熟以及抗病毒免疫反应。此外，tlr3可能还能诱导其他信号途径：(1)dsrna诱导的tlr3介导的561基因的表达依赖于tlr3胞内区酪氨酸残基的磷酸化，酪氨酸激酶抑制剂能抑制561基因的表达。tlr3的胞内区有5个酪氨酸，突变分析提示tyr759的磷酸化对该基因的诱导起着关键的作用，推测这些酪氨酸位点可能是蛋白激酶或接头蛋白的锚定位点，诱导不同的信号途径激活靶基因；(2)tlr3可直接与traf6结合启动下游途径，诱导nf-κb和mapk的活化，所以研究tlr3是否诱导其他信号途径对激活先天免疫起着重要作用。现阶段，以tlr3为靶点的药物仍处于探讨阶段，进入临床应用中还存在一些问题，如疾病的病理特征不明确、药物安全性不高、tlr3信号传递机制不够细化等。技术实现要素：本发明的目的是提供一种敲除toll样受体3(htlr3)的a549细胞模型。本发明首先保护sgrna组合，由如下两个sgrna组成：sgrna-1和sgrna-2；所述sgrna-1的靶序列如序列表的序列7自5’端第435-454位所示；所述sgrna-2的靶序列如序列表的序列7自5’端第794-813位所示。本发明还保护一种特异rna分子，包括如下两个区段：sgrna-1和sgrna-2；所述sgrna-1的靶序列如序列表的序列7自5’端第435-454位所示；所述sgrna-2的靶序列如序列表的序列7自5’端第794-813位所示。本发明还保护dna组合，由如下两个dna分子组成：编码所述sgrna-1的dna分子ⅰ和编码所述sgrna-2的dna分子ⅱ。本发明还保护一种特异dna分子，包括如下两个区段：编码所述sgrna-1的区段ⅰ和编码所述sgrna-2的区段ⅱ。以上任一所述sgrna-1如序列表的序列11所示。以上任一所述sgrna-2如序列表的序列12所示。以上任一所述dna分子ⅰ如序列表的序列7自5’端第435-536位所示。以上任一所述dna分子ⅱ如序列表的序列7自5’端第794-895位所示。以上任一所述区段ⅰ如序列表的序列7自5’端第435-536位所示。以上任一所述区段ⅱ如序列表的序列7自5’端第794-895位所示。所述特异dna分子具体可如序列表的序列7自5’端第185-895位所示。本发明还保护具有所述特异dna分子的重组载体。所述重组载体中含有cas9元件。所述重组载体具体可为将pu6grnacas9egfp载体中序列表的序列6所示的双链dna分子替换为序列7所示的双链dna分子得到的环形质粒。本发明还保护一种产品，其活性成分为所述sgrna组合，或所述特异rna分子，或，所述dna组合，或所述特异dna分子，或，所述重组载体；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：(a1)对toll样受体3基因进行基因编辑；(a2)构建toll样受体3基因敲除的细胞模型；(a3)构建toll样受体3基因敲除的动物模型；(a4)toll样受体3基因的功能研究；(a5)药物靶点的筛选。本发明还保护所述sgrna组合，或所述特异rna分子，或，所述dna组合，或所述特异dna分子，或，所述重组载体在制备产品中的应用；所述产品的用途如下(a1)-(a5)中的至少一种：(a1)对toll样受体3基因进行基因编辑；(a2)构建toll样受体3基因敲除的细胞模型；(a3)构建toll样受体3基因敲除的动物模型；(a4)toll样受体3基因的功能研究；(a5)药物靶点的筛选。本发明还保护所述sgrna组合，或所述特异rna分子，或，所述dna组合，或所述特异dna分子，或，所述重组载体在敲除细胞中toll样受体3基因中的应用。本发明还保护一种toll样受体3基因敲除的细胞，是将所述的sgrna组合或所述特异rna分子或所述dna组合或所述特异dna分子或所述重组载体转染出发细胞，利用crispr/cas9技术敲除toll样受体3基因得到的。所述出发细胞具体可为a549细胞。本发明还保护所述toll样受体3基因敲除的细胞应用，为如下(b1)-(b3)中的至少一种：(b1)构建toll样受体3基因敲除的动物模型；(b2)toll样受体3基因的功能研究；(b3)药物靶点的筛选。以上任一所述toll样受体3基因为编码序列表的序列2所示的蛋白质的基因。以上任一所述toll样受体3基因为编码区序列如序列表的序列1所示的基因。天然免疫是抵御病毒感染的第一道防线。固有免疫是否健全，决定了是否能够充分启动适应性免疫。病毒感染早期，病毒诱导固有免疫，由模式识别受体(prrs)识别病原相关分子模式(pamp)，并通过不同的信号转导途径诱导促进体内功能最为强大的专职抗原提呈细胞树突状细胞(dendriticcells,dc)生成ⅰ型干扰素等细胞因子，遏制病毒复制。tlr3是最早发现能特异性地识别dsrna的一种病原体相关分子模式识别受体。大多数病毒在其复制的同时就在启动dsrna的合成，感染病毒的濒死细胞会释放dsrna，这些dsrna就会成为感染状况的预警指标，当致病力很强或大量的病毒侵入人体时，就会引发人体内的固有免疫细胞，并通过释放大量的炎症因子，如肿瘤坏死因子、白介素、前列腺素、一氧化氮等造成机体损伤，即免疫介导的神经炎症反应引起的组织继发性损害。tlr3信号通路与神经系统、循环、呼吸、消化等系统均有影响。由上可见，tlr3信号转导通路与抗感染天然免疫反应密切相关，可介导hbv、hcv、hiv、疱疹病毒等感染疾病以及肿瘤、自身免疫性疾病及代谢性疾病的发生发展。本发明过crispr/cas9技术研究并阐明knockouttlr3的a549细胞模型用于完善胞内信号转导途径及机制，并以此建立疾病细胞或动物模型，有助于对疾病的认识，从而寻找新的药物靶点，更好地为临床预防和治疗服务。附图说明图1为实施例2步骤一中的荧光检测结果。图2为实施例2步骤二中的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图3为实施例2步骤三中的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图4为实施例2步骤三中的细胞绿色荧光表达情况检测结果。图5为实施例2步骤三中的测序结果。图6为实施例2步骤四中的westernblot检测。图7为实施例2步骤五中的原位荧光杂交检测结果。图8为pu6grnacas9egfp载体图谱。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。toll样受体3(htlr3)基因的编码区序列如序列表的序列1所示，编码序列表的序列2所示的蛋白质。pu6grnacas9egfp载体图谱见图8，参考文献：qunchen1,2,3,jinquancai1,2,3,qixuewang3,4,yunfeiwang3,4,mingyangliu5,jingxuanyang5,junhuzhou3,4,chunshengkang3,4,minli5,andchuanlujiang1.longnoncodingrnaneat1,regulatedbytheegfrpathway,contributestoglioblastomaprogressionthroughthewnt/b-cateninpathwaybyscaffoldingezh2，publishedonlinefirstnovember14,2017；doi:10.1158/1078-0432.ccr-17-0605.；公众可以从申请人出获得。pu6grnacas9egfp载体中具有cas9元件。实施例1、grna的设计及敲除质粒的构建一、grna的设计针对toll样受体3(htlr3)基因(geneid:7098)，初步选择大量grna靶位点，然后制备针对各个grna靶位点的grna，进行效果验证，筛选效果较好的grna。进一步，将交过较好的grna进行组合，制备具有双grna的rna分子(双grna具有双靶位点)。在toll样受体3(htlr3)基因有1个转录本，4个编码外显子。在第一个编码外显子(序列表的序列自5’端第1-441位)中，设计了三对双grna，具体信息如下：第一对双grna由h-lr3-dgrna1-l和h-tlr3-dgrna1-r组成；h-lr3-dgrna1-l的靶序列为atggctaacagtgcacttgg，h-tlr3-dgrna1-r的靶序列为gttgagatagctcattgtgc。第二对双grna由h-lr3-dgrna2-l和h-tlr3-dgrna2-r组成；h-lr3-dgrna2-l的靶序列为taccttgtgaagttggcggc，h-tlr3-dgrna2-r的靶序列为ttcagtcaaattcgtgcaga。第三对双grna由h-lr3-dgrna3-l和h-tlr3-dgrna3-r组成；h-lr3-dgrna3-l的靶序列为taccttgtgaagttggcggc，h-tlr3-dgrna3-r的靶序列为gttgagatagctcattgtgc。二、载体插入片段的合成1、h-tlr3-dgrna1序列片段的合成(1)oligo设计并合成目的基因上下游引物分别加上pu6grnacas9egfp载体的bbsi两侧同源序列，用于载体的亚克隆，引物序列(5’-3’)如下：(2)将步骤(1)中的b3363m-1至b3363m-16分别配置位浓度为50μm的单条oligo溶液，然后等体积混合，得到oligomix。(3)用步骤(2)配制好的oligomix进行第一轮pcr反应pcr体系：oligomix6μl10×pfubuffer(+mg2+)5μldntp1μlb3363m-11μlb3363m-161μlddh2o36μlpfudnapolymerase0.3μl循环条件：(4)完成步骤(3)后，以第一轮pcr反应的产物为模板，进行第二轮pcr。pcr体系：第一轮pcr产物1μl10×pfubuffer(+mg2+)5μldntp1μlb3363m-11μlb3363m-161μlddh2o41μlpfudnapolymerase0.3μl反应条件与第一轮相同。第一轮pcr可得到混有目的基因条带的非单一条带pcr产物混合物，再用第一轮的pcr产物为模板，通过第二轮pcr则可获得单一的目的基因条带，pcr反应完成后，利用agarose电泳并切胶回收h-tlr3-dgrna1基因片段(序列表的序列3)。2、h-tlr3-dgrna2序列片段的合成(1)oligo设计并合成目的基因上下游引物分别加上pu6grnacas9egfp载体的bbsi两侧同源序列，用于载体的亚克隆，引物序列(5’-3’)如下：b3364m-1gtggaaaggacgaaacaccgtaccttgtgb3364m-2ctatttctagctctaaaacgccgccaacttcacaaggtacggtgtttcgtb3364m-3cggcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatb3364m-4gactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaactb3364m-5tgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttccttcaccgagggcctattb3364m-6tcgtatatgcaaatatgaaggaatcatgggaaataggccctcggtgaaggb3364m-7tgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattgb3364m-8tatctttgtgtttacagtcaaattaattccaattatctctctaacagccttgtab3364m-9gaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaab3364m-10gcaaactacccaagaaattattactttctacgtcacgtattttgtactaab3364m-11agtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcb3364m-12tactttcaagttacggtaagcatatgatagtccattttaaaacataattttaaaactb3364m-13atatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttb3364m-14gaacggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaab3364m-15gaaaggacgaaacaccgttcagtcaaattcgtgcagagttttagagctagb3364m-16ctatttctagctctaaaactctgcacga(2)将步骤(1)中的b3364m-1至b3364m-16分别配置位浓度为50μm的单条oligo溶液，然后等体积混合，得到oligomix。(3)用步骤(2)配制好的oligomix进行第一轮pcr反应pcr体系：oligomix6μl10×pfubuffer(+mg2+)5μldntp1μlb3364m-11μlb3364m-161μlddh2o36μlpfudnapolymerase0.3μl循环条件：(4)完成步骤(3)后，以第一轮pcr反应的产物为模板，进行第二轮pcr。pcr体系：第一轮pcr产物1μl10×pfubuffer(+mg2+)5μldntp1μlb3364m-11μlb3364m-161μlddh2o41μlpfudnapolymerase0.3μl反应条件与第一轮相同。第一轮pcr可得到混有目的基因条带的非单一条带pcr产物混合物，再用第一轮的pcr产物为模板，通过第二轮pcr则可获得单一的目的基因条带，pcr反应完成后，利用agarose电泳并切胶回收h-tlr3-dgrna2基因片段(序列表的序列4)。3、h-tlr3-dgrna3序列片段的合成(1)oligo设计并合成目的基因上下游引物分别加上pu6grnacas9egfp载体的bbsi两侧同源序列，用于载体的亚克隆，引物序列(5’-3’)如下：b3365m-1gtggaaaggacgaaacaccgtaccttgtgb3365m-2ctatttctagctctaaaacgccgccaacttcacaaggtacggtgtttcgtb3365m-3cggcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatb3365m-4gactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaactb3365m-5tgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttccttcaccgagggcctattb3365m-6tcgtatatgcaaatatgaaggaatcatgggaaataggccctcggtgaaggb3365m-7tgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattgb3365m-8tatctttgtgtttacagtcaaattaattccaattatctctctaacagccttgtab3365m-9gaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaab3365m-10gcaaactacccaagaaattattactttctacgtcacgtattttgtactaab3365m-11agtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcb3365m-12tactttcaagttacggtaagcatatgatagtccattttaaaacataattttaaaactb3365m-13atatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttb3365m-14caacggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaab3365m-15gaaaggacgaaacaccgttgagatagctcattgtgcgttttagagctagab3365m-16ctatttctagctctaaaacgcacaatg(2)将步骤(1)中的b3365m-1至b3365m-16分别配置位浓度为50μm的单条oligo溶液，然后等体积混合，得到oligomix。(3)用步骤(2)配制好的oligomix进行第一轮pcr反应pcr体系：循环条件：(4)完成步骤(3)后，以第一轮pcr反应的产物为模板，进行第二轮pcr。pcr体系：第一轮pcr产物1μl10×pfubuffer(+mg2+)5μldntp1μlb3365m-11μlb3365m-161μlddh2o41μlpfudnapolymerase0.3μl反应条件与第一轮相同。第一轮pcr可得到混有目的基因条带的非单一条带pcr产物混合物，再用第一轮的pcr产物为模板，通过第二轮pcr则可获得单一的目的基因条带，pcr反应完成后，利用agarose电泳并切胶回收h-tlr3-dgrna3基因片段(序列表的序列5)。三、敲除质粒的构建1、采用bbsi对pu6grnacas9egfp载体进行酶切并回收酶切后的载体质粒。2、利用entryonestepcloningkit(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：c114-01)，将步骤二得到的h-tlr3-dgrna1基因片段，重组克隆到线性化的pu6grnacas9egfp载体中，反应体系如下：5×ceentrybuffer4μlpu6grnacas9egfp1μlh-tlr3-dgrna2μlexnaseentry2μlddh2o11μl使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min，得到敲除质粒a1769。经测序，敲除质粒a1769是将pu6grnacas9egfp载体中序列表的序列6所示的双链dna分子替换为序列7所示的双链dna分子得到的环形质粒。序列表的序列7中，第185-429位和第545-793位为u6启动子，第430-433位为上游接头序列，第435-454位为h-lr3-dgrna1-l的靶序列，第455-536位为grna骨架序列，第794-813位为h-tlr3-dgrna1-r的靶序列，第814-817位为下游接头序列，第818-895位为grna骨架序列。3、采用步骤二得到的h-tlr3-dgrna2基因片段替代h-tlr3-dgrna1基因片段，按照步骤2进行操作，得到敲除质粒a1771。经测序，敲除质粒a1771是将pu6grnacas9egfp载体中序列表的序列6所示的双链dna分子替换为序列8所示的双链dna分子得到的环形质粒。序列表的序列8中，第185-429位和第545-793位为u6启动子，第430-433位为上游接头序列，第435-454位为h-lr3-dgrna2-l的靶序列，第455-536位为grna骨架序列，第795-814位为h-tlr3-dgrna2-r的靶序列，第815-818位为下游接头序列，第819-896位为grna骨架序列。4、采用步骤二得到的h-tlr3-dgrna3基因片段替代h-tlr3-dgrna1基因片段，按照步骤2进行操作，得到敲除质粒a1811。经测序，敲除质粒a1811是将pu6grnacas9egfp载体中序列表的序列6所示的双链dna分子替换为序列9所示的双链dna分子得到的环形质粒。序列表的序列9中，第185-429位和第545-793位为u6启动子，第430-433位为上游接头序列，第435-454位为h-lr3-dgrna3-l的靶序列，第455-536位为grna骨架序列，第794-813位为h-tlr3-dgrna3-r的靶序列，第814-817位为下游接头序列，第818-895位为grna骨架序列。实施例2、细胞转染及检测一、细胞转染1、将a549细胞(中国科学院细胞库，scsp-503)接种于6孔板中(1.5×106细胞/孔)，采用含10％fbs的dmem培养液于37℃5％co2培养24h。2、完成步骤1后，取所述6孔板，吸去培养基，将转染复合物加入孔中，混匀，37℃5％co2培养5h。转染复合物：a：250μl无血清dmem培养基+2.5μg敲除质粒a1769；b：250μl无血清dmem培养基+5μlgp-transfect-mate(genepharma)，混匀，室温放置5min；将a和b混合后室温放置20min。3、完成步骤3后，取所述6孔板，吸去转染复合物，加入1.5ml含10％fbs的完全培养液。37℃5％co2继续培养至转染后48h，流式细胞仪上分选荧光(绿色荧光)细胞，筛选转染a1769的细胞。4、采用敲除质粒a1771替代敲除质粒a1769，按照步骤2和3进行操作，筛选转染a1771的细胞。5、采用敲除质粒a1811替代敲除质粒a1769，按照步骤2和3进行操作，筛选转染a1811的细胞。荧光检测结果见图1(nc为未进行转染的a549细胞)。二、转染细胞的pcr检测收集步骤1转染a1769的细胞、转染a1771的细胞、转染a1811的细胞和未进行转染的a549细胞(nc)，分别提取细胞的基因组dna，以基因组dna为模板，采用引物h-tlr3-2f和引物h-tlr3-2r进行pcr扩增。h-tlr3-2f(5’-3’)：tcaaaagagagacattgcagct；h-tlr3-2r(5’-3’)：gcaatatttgtggcaaattggatt。扩增后得到的pcr扩增产物进行dna定量，按照每孔相同的dna量上样，进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。从琼脂糖凝胶电泳的结果看，经过pcr扩增后，实验组样品a1769、a1771、a1811均有预期大小的小条带出现，三个质粒都造成了基因缺失突变，缺失片段的大小与理论大小一致。通过预期条带灰度分析三种质粒的基因编辑效率，其中a1769质粒达到40％，而a1811质粒和a1771质粒的编辑效率分别只有6.8％及21.9％，因此后续实验选取a1769质粒作为稳敲tlr3的靶点。三、转染a1769的细胞筛选从步骤一得到的转染a1769的细胞中选择若干个单克隆，通过流式分选出带有gfp的单克隆细胞后续再进步扩大培养，按照步骤二的方法对筛选出的细胞进行检测并判断基因缺失情况。结果如图3所示。图3的结果显示，泳道1、7、14对应的细胞样品的基因编辑效率最高，效果最好，分别编号为1号、7号和14号细胞样本。1号、7号和14号细胞样本的细胞形态及绿色荧光表达情况观察结果见图4。选择效果更好的1号和14号样本进行测序。测序结果如图5所示。分析表明，1号细胞样品是含有缺失244bp和缺失243bp两种突变的混合株。14号细胞样品是缺失243bp突变的纯合细胞株(经测序，14号细胞样品与野生型a1769细胞的差异仅在于缺失了序列表的序列10所示的dna分子)。四、westernblot检测提取14号细胞样品的总蛋白，采用westernblot检测tlr3的表达情况(采用gapdh作为内参蛋白)。检测tlr3蛋白的一抗：mouseanti-tlr3monoclonalantibody，ab13915，abcam(1:500稀释)；检测gapdh蛋白的一抗：monoclonalanti-gapdhantidodyproducedinmouse,g8795,sigma](1:10000稀释)。结果如图6所示。结果表明，14号细胞样品中的tlr3蛋白不表达，将14号细胞命名为a549-tlr3-/-。五、原位荧光杂交检测待测细胞：a549和a549-tlr3-/-。探针信息如下：将上述三条探针分别用depc水溶解为1μg/μl的探针溶液，将三种探针溶液等体积混合，加入70μlbufferc70ul，加depc水补足100μl，得到探针混合液。73℃水浴锅变性5min。依次按照如下步骤操作：1、检测待测细胞采用4％多聚甲醛固定后，吸弃4％多聚甲醛，0.1％buffera(depc水处理)消化15min。2、吸弃0.1％buffera，pbs洗两次，每次5min。3、吸弃pbs，每孔加入100μl2×sscbufferb，37℃培养箱放置30min。4、吸弃2×sscbufferb，加入100μl70％乙醇，室温放置3min。5、吸弃70％乙醇，加入100μl85％乙醇，室温放置3min。6、吸弃85％乙醇，加入100μl无水乙醇，室温放置3min。7、吸弃无水乙醇，室温干燥。8、bufferc提前在37℃水浴锅孵育2h。9、每张玻片配制100μl探针混合液，即探针5μl-0.6μl(可先做预实验确定所需的探针浓度)，bufferc70μl，加depc水补足至100μl。设置探针浓度为50μg/ml，20μg/ml，12.5μg/ml，6μg/ml四个梯度。每孔加入100μl探针混合液，37℃培养箱放置过夜。10、杂交次日，将样本从37℃培养箱取出，每孔加入100μl65℃预热的4×bufferb与0.1％bufferd等体积混合得到的混合液，洗涤5min。11、吸弃4×bufferb/0.1％bufferd，每孔加入2×bufferb，室温洗涤5min。12、吸弃2×bufferb，每孔加入1×bufferb，室温洗涤5min。13、吸弃1×bufferb，每孔加入100uldapi稀释液(pbs1:500稀释，bbi)，避光染色20min，吸弃，加入100ulpbs，荧光显微镜观察。上述步骤中的buffera、buffera、buffera和buffera均来自于上海吉玛制药技术有限公司fish试剂盒，货号：f05035。结果如7所示。图7中，a549细胞中可以观察到红色荧光表达，而a549-tlr3-/-细胞中无红色荧光。上述结果表明，成功构建了knockout模式识别受体tlr3的a549细胞模型。序列表<110>苏州吉玛基因股份有限公司上海吉玛制药技术有限公司<120>敲除toll样受体3（htlr3）的a549细胞模型<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2715<212>dna<213>人(homosapiens)<400>1atgagacagactttgccttgtatctacttttgggggggccttttgccctttgggatgctg60tgtgcatcctccaccaccaagtgcactgttagccatgaagttgctgactgcagccacctg120aagttgactcaggtacccgatgatctacccacaaacataacagtgttgaaccttacccat180aatcaactcagaagattaccagccgccaacttcacaaggtatagccagctaactagcttg240gatgtaggatttaacaccatctcaaaactggagccagaattgtgccagaaacttcccatg300ttaaaagttttgaacctccagcacaatgagctatctcaactttctgataaaacctttgcc360ttctgcacgaatttgactgaactccatctcatgtccaactcaatccagaaaattaaaaat420aatccctttgtcaagcagaagaatttaatcacattagatctgtctcataatggcttgtca480tctacaaaattaggaactcaggttcagctggaaaatctccaagagcttctattatcaaac540aataaaattcaagcgctaaaaagtgaagaactggatatctttgccaattcatctttaaaa600aaattagagttgtcatcgaatcaaattaaagagttttctccagggtgttttcacgcaatt660ggaagattatttggcctctttctgaacaatgtccagctgggtcccagccttacagagaag720ctatgtttggaattagcaaacacaagcattcggaatctgtctctgagtaacagccagctg780tccaccaccagcaatacaactttcttgggactaaagtggacaaatctcactatgctcgat840ctttcctacaacaacttaaatgtggttggtaacgattcctttgcttggcttccacaacta900gaatatttcttcctagagtataataatatacagcatttgttttctcactctttgcacggg960cttttcaatgtgaggtacctgaatttgaaacggtcttttactaaacaaagtatttccctt1020gcctcactccccaagattgatgatttttcttttcagtggctaaaatgtttggagcacctt1080aacatggaagataatgatattccaggcataaaaagcaatatgttcacaggattgataaac1140ctgaaatacttaagtctatccaactcctttacaagtttgcgaactttgacaaatgaaaca1200tttgtatcacttgctcattctcccttacacatactcaacctaaccaagaataaaatctca1260aaaatagagagtgatgctttctcttggttgggccacctagaagtacttgacctgggcctt1320aatgaaattgggcaagaactcacaggccaggaatggagaggtctagaaaatattttcgaa1380atctatctttcctacaacaagtacctgcagctgactaggaactcctttgccttggtccca1440agccttcaacgactgatgctccgaagggtggcccttaaaaatgtggatagctctccttca1500ccattccagcctcttcgtaacttgaccattctggatctaagcaacaacaacatagccaac1560ataaatgatgacatgttggagggtcttgagaaactagaaattctcgatttgcagcataac1620aacttagcacggctctggaaacacgcaaaccctggtggtcccatttatttcctaaagggt1680ctgtctcacctccacatccttaacttggagtccaacggctttgacgagatcccagttgag1740gtcttcaaggatttatttgaactaaagatcatcgatttaggattgaataatttaaacaca1800cttccagcatctgtctttaataatcaggtgtctctaaagtcattgaaccttcagaagaat1860ctcataacatccgttgagaagaaggttttcgggccagctttcaggaacctgactgagtta1920gatatgcgctttaatccctttgattgcacgtgtgaaagtattgcctggtttgttaattgg1980attaacgagacccataccaacatccctgagctgtcaagccactacctttgcaacactcca2040cctcactatcatgggttcccagtgagactttttgatacatcatcttgcaaagacagtgcc2100ccctttgaactctttttcatgatcaataccagtatcctgttgatttttatctttattgta2160cttctcatccactttgagggctggaggatatctttttattggaatgtttcagtacatcga2220gttcttggtttcaaagaaatagacagacagacagaacagtttgaatatgcagcatatata2280attcatgcctataaagataaggattgggtctgggaacatttctcttcaatggaaaaggaa2340gaccaatctctcaaattttgtctggaa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