专利名称：：Toll样受体3(TLR3)的限制性激动剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及提供一种可用作抗病毒剂、抗增殖剂、免疫剌激剂或它们的任何组合的Toll样受体(TLR3)激动剂。本发明提供了医疗方法和药物制造工艺。
背景技术：
：如多聚(I:C)等双链RNA己被用作TLR3激动剂。但其作为药物的有用性受其毒性限制。因而要寻求可通过特异性耙向TLR3而不耙向属于该家族的其它受体从而用作抗病毒剂、抗增殖剂和/或免疫刺激剂的改进药物。例如，理想的药物将具有增加的治疗指数(例如，产生毒性效果的剂量除以产生治疗效果的剂量的比例，如LD^/ED5o)以用于治疗初期感染或己确立的感染、治疗癌前病况或癌症病况或者诱导由TLR3介导的炎症响应。双链核糖核酸(dsRNA)通过包括2'，5'-寡腺苷酸合成酶/RNA酶L和p68蛋白激酶途径的dsRNA依赖的细胞内抗病毒防御机制来触发天然免疫(例如，干扰素和其它细胞因子的产生)。来自HEMISPHERxBiopharma的AMPLIGEN⑧多聚(I:d2U)是具有抗病毒性质和免疫剌激性质但展示出减低的毒性的特异性构造的dsRNA。AMPLIGEN⑧多聚(L-C,2U滩过多效活性抑制病毒和癌细胞生长它如同其它dsRNA分子那样调节2',5'-寡腺苷酸合成酶/RNA酶L和p68蛋白激酶途径。此处，据发现多聚(I:C,2U)通过充当TLR3的特异性激动剂而介导其在体内的效果。因此，本发明的一个目的是为需要抗病毒剂、抗增殖剂和/或免疫刺激剂的患者提供治疗。由此满足了对于选择性TLR3激动剂的期待己久的需求。本发明提供了尤其是涉及传染病、细胞增殖和/或接种的治疗受试对象的方法和制备药物的工艺。本发明的进一步的目的和优点描述如下或基于该论述而对于本领域技术人员显而易见。
发明内容本发明可以用于治疗带有初期病毒感染或已确立的病毒感染、以异常细胞增殖(例如，赘生物或肿瘤)为特点的病理状况的受试对象(例如，人或动物)，或者用作免疫剌激剂以对受试对象进行抗病毒感染的接种。优选的是所用的错配双链核糖核酸(dsRNA)的量足以与受试对象的免疫细胞上的Toll样受体3(TLR3)结合。由此可以触发天然免疫。具体而言，可以用特异性构造的dsRNA来激活TLR3而不激活其它Toll样受体如TLR4或者RNA解旋酶如RIG-I或mda-5。受试对象可能感染有病毒，特别是布尼亚病毒(bunyavirus)或更尤其是白蛉热病毒(phlebovirus)。对受试对象施用由足以与TLR3结合的量的特异性构造的dsRNA组成的药物组合物。由此通过恢复时间的减少、免疫力的增加(例如，抗体滴度、淋巴细胞增殖、受感染细胞死亡或自然杀伤(NK)细胞活性的增加)、病毒复制数的降低或其组合而测试到，与未用特异性构造的dsRNA治疗的受试对象相比，受试对象的病毒感染减少或被消除。受试对象可能遭受异常细胞增殖(例如，赘生物或肿瘤、其它转化细胞)的痛苦。可以对受试对象施用由足以与TLR3结合的量的特异性构造的dsRNA组成的药物组合物。由此与未用特异性构造的dsRNA治疗的受试对象的状况相比，细胞增殖得到降低、赘生性细胞被消除和/或受试对象的发病率或死亡率得以改善。可以对受试对象进行抗所述病毒或赘生物的接种。在紧接接种前、接种期间或紧接接种后，对受试对象施用由足以与TLR3结合的量的特异性构造的dsRNA组成的药物组合物。由此刺激对所述疫苗的免疫响应。所述疫苗可以由灭活病毒或减毒病毒、赘生性细胞碎片、一种以上的分离的病毒蛋白或一种以上的分离的肿瘤抗原组成。原位疫苗可以由在该位点处产生的抗原和对其充当佐剂的所述特异性构造的dsRNA组成。所述病毒可以为布尼亚病毒，更尤其是白蛉热病毒。抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞)和粘膜组织(例如，胃上皮或呼吸道上皮)是所述特异性构造的dsRNA在体内的优选靶标。所述病毒或肿瘤可以被呈递，而所述抗原应该易受专门充当TLR3激动剂的所述特异性构造的dsRNA的单独作用。优选通过静脉内输注；皮内、皮下或肌内注射；鼻内或气管内吸入；或口咽接触来施用所述特异性构造的dsRNA。本发明还提供了用于使用和制备药物的工艺。然而应该注意，除非在产品权利要求中叙述了所述工艺的具体步骤，涉及所述产物的权利要求未必受这些工艺限制。根据详细说明和权利要求以及对其的概括，本发明的另外方面将对本领域技术人员显而易见。图i显示多聚(i:c,2U)治疗限制野生小鼠但不限制n^rVj、鼠的肝病和系统性病毒负荷。对8周龄的7Z及^小鼠组(图1A、1C、1G和1E)和野生型小鼠组(图1B、1D、1E和1F)用PTV进行病毒攻击(第0天)并在感染后24小时用10)Lig多聚(I:C,2U)或盐水安慰剂治疗。图中显示了在感染后指示天数收集的样品的平均血清ALT水平(图1AlB)、肝评分(liverscore)(图1C1D)、肝病毒滴度(图1E1F)和血清病毒滴度(图1G1H)。数据表示每组5只动物的平均值和标准偏差。多聚(I:C,2U)，mdsRNA。IU，国际单位。与盐水治疗的对照相比申P〈0.05;"户<0.01。图2显示了在多聚(I:C,2U)接触后未受感染的7Xir"小鼠和野生型小鼠中的IFN-卩的诱导。对8周龄的小鼠组以10昭多聚(I:C,2U)进行腹膜内(i.p.)注射并确定在接触后指示时间收集的血清样品的系统性IFN-卩水平。数据表示每组3只动物的平均值和标准偏差。具体实施例方式本发明可以治疗属于巴尔的摩分类系统(Baltimoreclassificationsystem)的第III组、第IV组或第V组的RNA病毒的感染。所述RNA病毒拥有核糖核酸(RNA)作为其遗传材料并且不用DNA中间体进行复制。所述RNA通常为单链(ssRNA)但偶尔可以为双链(dsRNA)。可以根据其RNA的有义性(sense)或极性将RNA病毒进一步分为负义RNA病毒和正义RNA病毒。正义病毒RNA与病毒mRNA相同因而能被宿主细胞立即翻译。负义病毒RNA与mRNA互补因而在翻译前必须由RNA聚合酶转化为正义RNA。这样，正义病毒的纯化RNA能直接造成感染，尽管它可能比完整病毒颗粒的感染性弱。负义病毒的纯化RNA由于其需要被转录为正义RNA因而自身没有感染性。感染人类和动物的RNA病毒包括属于以下科的那些RNA病毒双核糖核酸病毒科(A'mm^^ae)和呼肠孤病毒科(ieowWa^)(第III组的dsRNA病毒)；云力脉炎病毒禾斗(jrfen'v/n'(i(3e)、星状病毒禾斗(^(WraWn'c/ae)、杯状病毒科(Ca//c/vzW^fae)、肝炎病毒禾斗(//e/evzW^ze)和杆状套病毒科(/om'Wn'^e)(第IV组的正义ssRNA病毒)；以及沙粒病毒科04r￡"crwW<iae)、博尔纟内病毒禾斗(5om頻Wc^)、布尼亚病毒禾斗(5ww_yav/n'cbe)、纤丝病毒禾斗CF7/oWnWae)、晶ll粘病毒禾斗(尸aramyxov/n'(i(3e)和弹状病毒科(7/wk/ovzW^ze)(第V组的负义ssRNA病毒)。此外已知特异性构造的双链核糖核酸(dsRNA)可以治疗来自黄病毒科(尸/"vMn^e)、月干脱氧核糖核酸病毒科(/^;%^"(^/^&￡)、正茅占病毒科(Ot/om;^ov/n'^i!e)、小核糖核酸病毒科(尸/cor"avzWJae)、逆转录病毒科(i"ravzW&e)和批盖病毒科(7bg"Wn'&e)的RNA病毒的感染。这些科的病毒可以包括在本发明的范围内，也可以不包括在本发明的范围内。经历异常增殖的受施对象的细胞可以是赘生物或肿瘤(例如，癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤)，特别是由肿瘤病毒(例如，携带转化基因或癌基因的DNA病毒或RNA病毒)转化的细胞或者受与癌症相关的病毒感染的细胞。例如，艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)与鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)及其它B淋巴瘤相关；人类乙肝病毒和丙肝病毒(HBV和HCV)与肝癌相关；人类疱疹病毒8(HHV8)与卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)相关；人类乳头瘤病毒属(例如，HPV6、HPVll、HPV16、HPV18或其组合)与宫颈癌、肛门癌和生殖器疣相关；以及人类嗜T淋巴细胞病毒(humanT-lymphotrophicvims(HTLV))与T细胞白血病和淋巴瘤相关。癌症包括发自胃肠道系统(例如，食道、结肠、小肠、回肠、直肠、肛门、肝、胰、胃)、泌尿生殖系统(例如，膀胱、肾、前列腺)、肌肉骨骼系统、神经系统、肺部系统(例如，肺)或生殖器系统(例如，子宫颈、卵巢、睾丸)等器官系统的癌症。多核糖肌苷酸与多核糖(腺苷酸12尿苷酸)部分杂交并可以由rWd2U)n表示。可用的其它特异性构造的dsRNA可以基于选自多聚(C。U)和多聚(CnG)的共聚多核苷酸(其中n是429的整数)，或可以为多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸的复合物的错配类似物，所述错配类似物通过修饰rVrCn以便沿着多核糖胞苷酸(rQO链引入未配对碱基(尿嘧啶或鸟嘌呤)而形成。作为另一种选择，可以通过修饰多核糖肌苷酸(rln)的核糖基主链(例如，通过包括2，-0-甲基核糖基残基)从r(I》r(C)dsRNA衍生出错配dsRNA。错配dsRNA可以与如赖氨酸纤维素等稳定RNA的聚合物复合。在这些rl"C。的错配类似物中，优选的错配类似物的通式为iVr(Cn.,4U)n且在通过参考引入的美国专利第4,024,222号和第4,130,641号中对其进行了描述。其中所述的dsRNA通常适合于本发明的应用。也见美国专利第5,258,369号。可以通过任何适合的局部途径或系统途径来施用特异性构造的dsRNA，所述局部途径或系统途径包括肠内途径(例如，口服、饲管、灌肠)、局域途径(例如，作用于上表皮的贴剂、作用于直肠或阴道内的栓剂)、肌内、皮内或腹腔内注射；脸颊、舌下或透粘膜；鼻内或气管内吸入或滴注)。可以将所述核酸微粉化用于吸入、溶解于载剂(例如，无菌缓冲盐水或水)中用于注射或滴注或者包封在脂质体或其它载体中用于定向输送。优选可将所述核酸靶向到抗原呈递细胞和上皮上的TLR3受体的载体。可以将药物配制为至少包含有效量的特异性构造的dsRNA的药物组合物，所述药物组合物在无菌条件下制造(并在必要时储存)并且经过低微生物和内毒素污染测试。所述药物可以进而包含生理可接受的载剂或载体。可以理解，优选途径可以根据受试对象的状况和年龄、传染病或肿瘤病的性质以及所选活性成分而有所变化。所述核酸的推荐剂量将取决于受试对象的临床状态和医师或兽医师在治疗病毒感染或肿瘤负荷方面的经验。可以将特异性构造的dsRNA每周两次通过静脉输注以约200mg约400mg对70kg的受试对象给药，不过给药量和/或给药频率可以由医师或兽医师根据受试对象的状况而改变。表达TLR3的细胞或组织、尤其是抗原呈递细胞(例如，树突细胞和巨噬细胞)和内皮(例如，呼吸系统和胃系统)是输送所述核酸的优选位点。可以通过TLR3基因的突变(例如，缺失)、其表达的下调(例如，siRNA)、与TLR3的配体结合位点的竞争物(例如，中和抗体)或受体拮抗剂的结合或者TLR3信号传导途径的下游成分(例如，MyD88或TRIF)的干扰来抑制或阻断特异性构造的dsRNA的效果。AMPLIGEN⑧多聚(I:d2U)提供了以前无法获得的用于剖析出TLR3激活对免疫系统的效果的选择剂。如TLR衔接子MyD88和TRIF等其它试剂分别通过所有TLR或TLR3/TLR4介导信号传导。因而，激活或抑制通过MyD88或TRIF的信号传导将不使生物学效应限于由TLR3介导的那些生物学效应。由于AMPLIGEN⑧多聚(I:CuU)需要TLR3的存在和它的信号传导才能发挥受体激动剂的作用，因此可以在施用所述激动剂之前测试受试对象的细胞或组织中不存在TLR3突变、存在TLR3蛋白、TLR3介导的信号传导完整或它们的任何组合。可以在施用所述激动剂之前、期间或之后进行对TLR3活性的所述确认。所述激动剂可以用于限制对TLR3激活的免疫响应而不激活其它Toll样受体或RNA解旋酶。下列实施例对本发明的具体实施方式进行进一步说明而不是意图限制本发明的上述范围。实施例庞塔托鲁病毒(PuntaTorovims(PTV))在发生学上与引起裂谷热和白蛉热的病毒密切相关。与高致病性白蛉热病毒不同，PTV对人的感染产生的疾病通常限于温和的热性疾病。对小型啮齿类动物的感染模型己经有所描述，所述感染模型产生与在人和驯化有蹄类动物的裂谷热病毒感染中观察到的相似的累及肝脏的急性病。几个小组已经描述了仓鼠对由PTV感染诱导的严重疾病的易感性。这些啮齿类动物模型的可利用性使得PTV成为用于抗病毒研究的裂谷热病毒的可行性替代物，这是因为裂谷热病毒高度受限并且需要高级的防范设施。为此，已经用白蛉热病毒诱导的急性病的PTV模型对有前景的抗病毒药物进行了许多评估。而且，几项大型研究涉及对免疫调节剂的评估并且已表明PTV对IFN诱导物极为敏感。1型IFN的重要性在小鼠PTV感染模型中得到证实。用抗IFN-oc/卩的中和抗体的处理完全破坏了在成年小鼠中报告的抗感染性。己经一致证实如多聚(I:C)或多聚(I:C,2U)等有效力的I型IFN诱导物可高度有效地保护断乳小鼠不受致命的PTV攻击。累积证据表明两种途径参与了由于与RNA病毒的复制中间体即dsRNA接触而造成的激活事件。除TLR3响应途径以外，近来揭露了由含半胱天冬酶(caspase)募集域(CARD)的RNA解旋酶细胞质传感器介导的不依赖TLR3的途径。通过这些dsRNA传感器的信号传导经由汇集来共享调节IFN-J3(抗病毒免疫调节中的关键因子)生成的各种激酶和转录因子的不同途径发生。由于其内体限制，TLR3很可能参与对经细胞吞噬过程内化的dsRNA的识别。RNA解旋酶dsRNA检测子(detector)(由视黄酸诱导的蛋白I(RIG-I)和黑素瘤分化相关基因-5(mda-5))的细胞内定位可以感知细胞内的病毒感染。近期证据表明mda-5在I型IFN对多聚(I:C)的响应中起着较TLR3更为主导的作用。此处提供的数据表明了TLR3在多聚(I:CpU)对保护性免疫的诱导中的作用。动物受试对象在耶鲁大学衍生出7Zi^-小鼠并回交到C57BL/6背景(Alexopoulou等，Nature413:732-738，2001)。在犹他州立大学将它们在特定的无病原体条件下培育并舍养。从Jackson实验室(BarHarbor,ME)获得C57BL/6小鼠(野生型)。在所有实验中使用年龄匹配的雌性小鼠。这些研究中使用的所有动物操作遵照由美国农业部和犹他州立大学动物管理委员会(Utah免疫调节剂一、、多聚(I:C,2U)由HEMISPHERxBiopharma(Philadelphia,PA)以2.4mg/mL的浓度提供。在注射前立即用无菌盐水将它稀释至适当浓度。产生阳离子脂质体-DNA复合物(CLDC)的材料由JuvarisBioTherapeutics,Inc.(Pleasanton,CA)提供。Gowen等此前描述了脂质体、DNA和注射用CLDC的制备(AntiviralRes.69:165-172，2006)。重组艾美球虫属原虫(Eimeriaprotozoan)抗原(rEA)由BarrosResearchInstitute(Holt,MI)提1"共且如Gowen等所述使用(Antimicrobiol.AgentsChemother.50:2023-2029,2006)。病毒唑由ICNPharmaceuticals(CostaMesa,CA)供应。将所有材料通过腹膜内(i.p.)途径施用。在感染有PTV的rZJ3^小鼠和野生型小鼠中的多聚(I:C,2U)的评估从美国军事医学传染病研究所(Frederick，MD)的DominiquePifat博士处获得PTV(Adames株)。在原始病毒贮存物通过LLC-MK2细胞(美国典型培养物保藏中心，AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA)四次传代后制备病毒贮存物。对断乳的7Xi3—A小鼠和C57BL/6小鼠(34周龄)通过皮下(s.c.)注射接种2xl04的细胞培养半数感染量(CCID5o)的PTV。在第一项研究中，在感染攻击24小时后将单剂量的10昭多聚(I:C12U)、1昭CLDC或盐水安慰剂在腹膜内施用。此外也包括了其中从病毒攻击之前4小时开始在5天中每天施用2次治疗的病毒唑治疗组。在21天中观察各组中的小鼠的死亡。在第二项研究中，用l]agrEA治疗组替代CLDC组和病毒唑组。此外，包括额外的动物用于分析感染第3天时的肝病。从在感染第3天时处死的小鼠(n=5)收集血清并以04的标准对肝的肝性黄疸评分0为正常而4为最大黄色变色。用购自PointeScientific,Inc.(LincolnPark,MI)的ALT(SGPT)试剂组确定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。进行时间性研究以比较用多聚(I:C,2U)治疗的7!i^—7—小鼠和野生型小鼠中的系统病毒载量和肝脏病毒载量、肝性变色和ALT水平。将8周龄小鼠组(11=5)在用多聚(1:(:1211)或盐水的治疗性干预后的感染的第2、3、4或5天处死以收集样品。也收集第1天的样品以便提供感染过程早期的基线。在该研究中采用较大龄的小鼠，因为据报道它们对PTV感染更具抵抗力从而有助于在感染较晚期进行的分析。如Sidwell等(Antimicrob.Agents.Chemother.32:331-336,1988)所述利用感染细胞培养测试对病毒滴度进行测试。简言之，将特定体积的肝匀浆或血清连续稀释并一式三孔地加入96孔微板中LLC-MK2细胞单层的孔中。在接触病毒6天后确定病毒致细胞病变效应(CPE)并如Reed&Muench(Am.J.Hyg.27:493-497,1938)所述计算50%终点。多聚(I:C,2U)治疗后的TLR3一小鼠和野生型小鼠中的IFN-卩用10!ig多聚(I:C,2U)治疗8周龄的TLR3^小鼠组和野生型小鼠组(每组n=3)。在接触后第0、1.5、3、6和24小时收集血清。用来自PBL(Piscataway,NJ)的ELISA试剂如制造商所说明来测定系统IFN-J3水平。统计分析使用时序(log-rank)分析评估存活数据中的差异。Fisher精确检验(双尾)用于评估总存活者的增加。进行Mann-Whitney检验(双尾)以便分析死亡前平均天数、病毒滴度和血清ALT水平的差异。Wilcoxon分级总和分析用于平均肝评分比较。学生t检验(双尾)用于确定由多聚(I:d2U)治疗的T7^y—小鼠和野生型小鼠之间的IFN-p水平差异。TLR3缺陷小鼠在由多聚(I:Ci2U)治疗后无法发展对PTV感染的保护性免疫多聚(I:Ci2U)是此前已报道的可给予C57BL/6断乳小鼠抵抗致命PTV攻击的完全保护、降低病毒滴度并限制肝功能障碍以及与PTV感染相关疾病的药物(Sidwell等，Ann.N.Y.Acad.Sci.653:344-35,1992)。为了确定TLR3活性是否在多聚(I:C,2U)对抵抗PTV的抗病毒防御的诱导中起重要作用，在第一项研究中对34周龄rzj^z—小鼠和野生型小鼠在感染攻击后24小时进行治疗。在用多聚(I:C,2U)治疗的7X^3—/—小鼠组中没有存活者(表1)。相反，用CLDC剌激的8只小鼠中5只在感染巾存活，CLDC很可能主要通过存在于质粒DNA主链中的CpG基序的TLR9识别起作用。在野生型小鼠中，dsRNA和CLDC都保护了100%的小鼠(表1)，证实所述免疫调节药物制剂具有高度活性。由于病毒唑常规性保护90%以上的野生型小鼠不受致命PTV攻击，因而也将病毒唑治疗作为额外的正对照包括在内。可以注意到病毒唑仅保护75%(8只中的6只)的7X/^—A小鼠免于死亡，然而在野生型动物中观察到完全的保护(表1)。这可能是山于所用的HJ户小鼠(约3周龄)与稍大的野生型小鼠(约34周龄)相比较小。作为另一种选择，TLR3缺失可能降低这些小鼠限制感染和对抗疾病的能力。CLDC和病毒唑都显著改善了存活结果。表1.CLDC而非错配dsRNA(多聚(I:C,2U))引发TLR3缺陷的小鼠中对PTV感染的保护性免疫"1^1^f1存活/总数死亡前天数b~时序平均值范围Prob>Chi_______SqA多聚(I:CuU)，^4.1±0.34~5~~0.677510吗**CLDC,1昭5/83.7±0,6340馬3病毒唑，6/8"6.0±2.8480.000375mg/kg/R无菌盐水0/94.2±1.036野生型多聚(I:d2U)，10/10'"<0細110CLDC'1昭10/10***<0.0001病毒啤，io/i(T*<o.oooi75mg/kg/闩__无菌盐水1/114.5±0.746__a在病毒攻击后24小时在腹膜内施用单剂量多聚(I:C,2U)、CLDC和盐水治疗。将病毒唑从病毒攻击前4小时开始在5天中每天腹膜内给予2次。b在第21天前死亡的小鼠的平均死亡前天数和死亡前天数范围。'P<0.05;"P<0.01;"》<0.001(与各自的盐水治疗对照相比)。进行第二项研究以便确证初始发现。除了具有更接近的年龄匹配的小鼠(约4周龄)以外，在感染第3天处死额外5只小鼠以便评估PTV感染造成的肝病的差异。如表2所示，多聚(LCnU)再次无法保护7Xiy—小鼠不受高致死剂量的病毒影响并且如降低的血清ALT水平和肝评分所反映无法限制肝病。通过TLRll起作用的正对照免疫调节剂rEA对避免小鼠死亡和显著降低血清ALT水平高度有效。正如预期，用多聚(LCnU)和rEA治疗野生型小鼠引发了抵抗高致命攻击接种物的100%的保护(表2)。有趣的是，已知可诱导I型IFN的多聚(I:C,2U)治疗极大地消除了肝性黄疸，而未显示出可诱导I型IFN的rEA没有降低任何一个小鼠种系的肝评分。在比较7X/r"和野生型的盐水治疗安慰剂组和rEA治疗组时没有明显差异，这表明两个种系同等地易受PTV感染且相似地对rEA响应。表2.TLR11激动剂rEA而非错配dsRNA(多聚(I:C^U))保护TLR3缺陷的小鼠不受致命PTV疾病影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>a在病毒攻击后24小时在腹膜内施用单剂量多聚(I:C,2U)、rEA和盐水治疗。在第21天前死亡的小鼠的死亡前天数的平均值和范围。e在感染第3天确定；每组4只5只小鼠。dALT，丙氨酸氨基转移酶；以国际单位/升测定。e(H正常肝)4(最大变色)的评分。*P<0.05;**P<0.01;"*P<0.00I(与各自的盐水治疗对照相比)。TLR3缺陷小鼠无法响应于多聚(I:d2U)而降低疾病严重性和病毒载量尽管PTV在断乳C57BL/6小鼠中高度致命，但据报道8周龄的动物可抵抗感染。因而，用较大龄小鼠进行了跨越整个感染和疾病过程的时程研究以便进一步评估TLR3对多聚(I:CuU)免疫疗法的保护性效果的贡献。如图1A中所见，在A小鼠和野生型小鼠中直到感染的第3天才出现显著水平的ALT并且在第4天达到峰值然后回落。ALT水平在多聚(I:CnU)治疗的7XiJ7—小鼠与盐水治疗的7Xi3"小鼠之间没有差异，而在接受dsRNA治疗的野生型小鼠中ALT水平保持在基线附近(图1A1B)。有趣的是，尽管在感染第3天和第4天看到了较大变化，盐水治疗的野生型小鼠比其TLR3缺陷的对应体呈现出高3倍的平均ALT水平。对于由粗略视觉检査评估的肝损伤而言，在盐水治疗的小鼠中由变色指示的疾病在第2天首次可见并在第4天达到峰值(图1C1D)。与ALT数据所反映的肝病一致的是，仅在响应于多聚(I:C,2U)的野生型小鼠中展示出与盐水治疗对照相比肝性黄疽在第4天和第5天显著减少。而且，在野生型小鼠中观察到对更大的肝病严重性的暗示，因为它们的第4天平均肝评分与TZJJ,小鼠相比更高(分别为3.7士0.3和3.4±0.4)。并且与前述攻击研究屮所见的缺乏保护(表1和表2)—致的是，数据表明TLR3在多聚(I:C,2U)治疗后介导抵抗PTV的保护性免疫中起着极其重要的作用。此外也检测了在多聚(I:CuU)或盐水治疗后的感染进程中对肝病毒负荷和系统病毒负荷的控制。出乎意料的是，没有发现肝病毒载量的明显差异，这部分是由于通过野生型小鼠所见的高度变化性(图1E1F)。多聚(I:C,2U)治疗的野生型小鼠中的平均滴度在第2天和第3天较高，但所述平均滴度不像通过血清ALT水平和肝评分在几个情形中所展示那样在统计学上显著。可以注意到，与7Uy-小鼠相反，早至第1天就在几只野生型动物中检测到病毒(图1E1F)。尽管血清病毒在感染第1天检测不到，但其到第2天时突然达到峰值，例外的是dsRNA治疗的野生型小鼠，它们能够将感染控制在勉强可以检测的水平，如大于3个对数值的病毒减少所示(图1G1H)。再一次，可见于野生型动物中的多聚(I:C,2U)治疗的效果在TLR缺陷的小鼠中丧失。与rzj^一小鼠和野生型小鼠的肝病毒载量的比较相同，没有在盐水治疗组的峰值滴度中系统性地看到显著差异(图1G1H)。但7Z/J—'vj、鼠中的平均病毒滴度在第3天后急剧下降超过3个对数值，而在野生型中仅观察到逐渐的降低。盐水治疗的小鼠组之间的比较确证了所暗示的通过野生型动物所见的更严重的肝病特征。在野生型动物中可以在较早期(第1天)检测到肝病毒而系统性病毒持续得更久(图1E1H)。TLR3缺陷的小鼠不响应于多聚(I:C,2U)治疗而产生IFN-卩dsRNA是宿主抗病毒防御的确立中的关键因子IFN-卩的主要诱导物。为了测试功能性TLR3的缺乏是否改变IFN-p响应模式，以所有实验中所用的10吗多聚(I:C,2U)剂量治疗野生型小鼠组和rLRyvj、鼠组，并在不同时间点确定系统性的IFN-(3生成。在1.5小时的接触期后，与7Xiy—小鼠相比在野生型小鼠中观察到IFN-卩水平的显著增加(图2)。在3小时时，IFN-(3水平在野生型小鼠中达到峰值而在7Uy—小鼠中保持在基础水平。到6小时时，IFN-(3水平在野生型小鼠中已经重新回到基线(图2)。在对TZJ3^小鼠评估的任何时间点都没有IFN-P诱导的迹象。在1.5小时和3小时取样时间的IFN-P生成的差异显著，并且该差异可能是多聚(I:C,2U)无法在TLR3缺陷的动物中引发抵抗PTV感染的保护性免疫的因素。讨论有数项证据反驳dsRNA依赖的蛋白激酶(PKR)(dsRNA的经典细胞质传感器)是用于I型IFN诱导和抗病毒宿主防御的突出途径。上述结果显示模式识别受体TLR3对于在小鼠中通过多聚(I:d2U)引发的保护性免疫至关重要。对其它细胞质dsRNA传感器及其在宿主抗病毒免疫中的参与的近期发现表明mda-5是I型IFN诱导及引起的抗病毒状态的主要机制。然而，发现缺乏TLR3的动物无法在用多聚(I:C,2U)的单剂量治疗后发展抵抗PTV感染的保护性免疫和限制与PTV感染相关的疾病。而且，TLR3缺陷造成不受抑制的病毒复制和在用多聚(I:C,2U)治疗的野生型动物中非常明显的iFN-(3响应的缺乏。与患有免疫缺陷(如TLR3缺失)的小鼠的抗病毒研究相关的告诫是效能的缺乏可能部分由于不依赖于多聚(I:C,2U)的由TLR3介导的对PTV感染的响应受扰乱所致。为此，可以想象TLR3的缺失使小鼠易于患更严重的疾病并因此使感染更难治疗。来自第一项研究的结果(表l)表明这可能是由于分别通常保护100%和多于80%的受攻击小鼠的正对照药物病毒唑和CLDC效果较差的情况。然而，这些结果已经受到7Zi3一小鼠年龄的影响，而在该实验中njyvj、鼠的年龄明显较小且比野生型小鼠大概小数天。来自第二项研究的结果支持这个解释，在该研究中对小鼠进行了更严格的年龄匹配从而其均接近4周龄。事实上，在两个小鼠种系对rEA的响应中看到了非常相似的保护并且由盐水安慰剂组观察到相似的致死率(表2)。因而，在较大龄的小鼠中也看到了与7Uy—小鼠对抗PTV感染的能力减弱相反的进一步证据。在用来进一步解析7XiJ一小鼠和野生型小鼠对多聚(I:CuU)响应的能力差异的时程研究中，在安慰剂治疗的小鼠之间的比较表明rZJ3—'"小鼠可能对PTV感染和疾病更具抵抗性。野生型小鼠呈现出更高的ALT水平和肝评分并且病毒尽管具有相似的峰值血清滴度但持续较久从而显示出逐渐的减少，而7T^3"小鼠中的滴度在感染第3天后突然下降。在未受治疗的7Xi^-小鼠和野生型小鼠中的额外攻击研究确证了表明rzjf—小鼠不比其野生型对应体更易受PTV感染的这些发现。对常用dsRNA模拟物多聚(I:C)的宿主响应的内在机制的近期研究提供了有说服力的证据，即细胞质dsRNA传感器mda-5是I型IFN生成的主要响应途径。上述结果表明TLR3是主导的dsRNA响应机制。它对于IFN-卩的抗病毒活性和诱导至关重要。在将这些发现与Gitlin及其同事的发现比较时发现了几个问题。在他们的研究中，通过静脉内(i.v.)注射施用了100吗多聚(I:C)，而本研究中的治疗限于通过腹膜内(i.p.)途径施用10昭多聚(I:C,2U)。10吗的量基于实验，所述实验被设计来确定对于PTV感染模型中的最大抗病毒活性最适当的剂量。可以推测，dsRNA的组成、其施用途径和接种量极大地促成了在I型IFN响应中观察到的差异。似乎mda-5对多聚(I:C)形式的dsRNA具有更大的特异性而TLR3对多聚(I:C,2U)具有更大的亲和力。此外，输送途径很重要，因为似乎在dsRNA的识别中存在细胞类型特异性差异。通过在静脉内(i.v.)输送dsRNA，所述材料最初进入由TLR3水平表达不显著的树突细胞(DC)占据的脾的边缘区，由此造成主要由mda-5介导的I型IFN诱导。相反，腹膜内(i.p.)施用造成与常驻和浸润性炎症腹膜巨噬细胞群的遭遇，其中TLR3介导的激活似乎是所用的主要途径。这个想法得到大量离体研究支持，所述离体研究探究了培养物中由缺乏TLR3和TRIF的腹膜巨噬细胞的dsRNA响应。因而，腹腔中巨噬细胞对dsRNA的直接接触产生的响应模式不同于可以在通过靶向适于mda-5介导的I型IFN诱导的CD8阴性DC的直接系统输送发生接触时观察到响应模式。除了促成在本研究与Gitlin及其同事的研究之间观察到的差异的上述可能根源以外，所用的dsRNA量显著不同。此处，使用了小10倍的dsRNA，这与腹膜内(i.p.)输送途径结合可造成相比而言更低的系统IFN-卩水平。通过静脉内(i.v.)途径施用100jag裸dsRNA产生了比本研究中观察到的过量10倍以上的IFN-(3(参阅Gitlin等，Proc.Natl.AcadSci.USA103:8459-8464，2006)。虽然如此，由较低剂量诱导的IFN-|3量可以绰绰有余地在PTV感染模型中诱导保护性免疫。事实上，1pg以下的多聚(I:C,2U)材料仍然提供了抵抗致命PTV攻击的适当保护，这在病毒感染和用多聚(I:C,2U)的潜在免疫治疗的背景下很可能在生理学上是相关的。考虑到多聚(I:C)的已知毒性，用多聚(I:d2U)的潜在免疫治疗尤为重要。可以推测，在接触腹膜内(i.p.)施用的多聚(I:Q2U)后无法产生I型IFN-P对于采用rzj^—小鼠的攻击研究的结果极为有害。通过参考引入本文引用的专利、专利申请、书籍和其它出版物的全部内容。在陈述数字范围时，应该理解还描述了所述范围内的所有值(例如，110还包括1至IO之间的所有整数值以及如210、15和38等中间范围)。术语"约"可以指与测定相关的统计不确定性或数量上的可变化性，本领域技术人员可以理解所述统计不确定性或数量可变性不影响本发明的操作或其专利性。进入所述权利要求及其合法等同方式的范围的含义内的所有修改和替代应该被包含在其范围内。采用"包括"来叙述的权利要求允许将其它要素包括在所述权利要求的范围内；也可由采用叙述连接词"基本由...组成"(即，允许将其它要素在它们不在实质上影响本发明的操作时包括在所述权利要求的范围内)或"由...组成"(即，仅允许所述权利要求中所列举的通常与本发明相关的要素而不是其它杂质或无关紧要的活动)而不是所述术语"包括"来叙述的那些权利要求来描述本发明。这三个词语中的任何一个可以用于要求本发明的权利。应该理解，除非在权利要求中明确叙述，否则不应将本说明书中所述的要素看作对本发明权利的限制。因而，授予的权利要求是用于确定合法保护范围的基础而不是隐含于所述权利要求的来自说明书的限制。对比之下，仅以具体实施方式为限，将会预期到所要求的发明或破坏新颖性的现有技术明确排除在本发明之外。而且，预计权利要求的限定之间或当中不具有特定关系，除非所述关系在所述权利要求中明确叙述(例如，产品权利要求中的成分排列或方法权利要求中的步骤顺序不是对该权利要求的限定，除非明确如此声明)。本文公开的个体要素的所有可能的组合和排列应视为本发明的方面。相似地，将对本发明的描述的概括认为是本发明的一部分。如上所述，对于本领域技术人员显而易见的是，可以以其它具体形式实施本发明而不背离其精神或本质特征。由于将通过所附权利要求书而非本说明书指明对本发明提供的合法保护范围，因此应该认为所述实施方式仅为说明性而非限制性的。权利要求1.一种启动仅由Toll样受体3(TLR3)介导的天然免疫响应的方法，所述方法包括对受试对象至少施用足以激活TLR3但不激活其它Toll样受体或RNA解旋酶的量的多聚(I:C12U)。2.—种治疗(i)受病毒感染或(ii)带有肿瘤或其它转化细胞的受试对象的方法，所述方法包括施用由足以结合Toll样受体3(TLR3)的量的多聚(I:C,2U)组成的药物组合物以便分别减少或消除(i)所述病毒对所述受试对象的感染或(ii)所述受试对象内所述肿瘤或其它转化细胞的增殖。3.如权利要求2所述的方法，其中，所述受试对象受病毒感染。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述病毒是布尼亚病毒。5.如权利要求4所述的方法，其中，所述病毒是白蛉热病毒。6.—种对受试对象进行抗病毒或肿瘤接种的方法，所述方法包括在受试对象中施用(i)诱导抵抗所述病毒或所述肿瘤的免疫响应的疫苗和(ii)由足以结合Toll样受体3(TLR3)并刺激抵抗所述疫苗的病毒抗原或肿瘤抗原的免疫响应的量的多聚(I:C,2U)组成的药物组合物。7.如权利要求6所述的方法，其中，对所述受试对象进行抗病毒接种。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述病毒是布尼亚病毒。9.如权利要求8所述的方法，其中，所述病毒是白蛉热病毒。10.如权利要求19中任一项所述的方法，其中，所述受试对象是人。11.如权利要求29中任一项所述的方法，其中，所述病毒或所述肿瘤易受专门充当TLR3激动剂的多聚(I:C^U)的单独作用。12.如权利要求29中任一项所述的方法，其中，所述病毒或所述肿瘤表达抗原，所述抗原自发地被多聚(I:C,2U)选作原位靶标而启动抵抗所述抗原的免疫响应。13.如权利要求19中任一项所述的方法，其中，将多聚(Ld2U)静脉内输注。14.如权利要求19中任一项所述的方法，其中，将多聚(I:CuU)皮内、皮下或肌内注射；鼻内或气管内吸入；或在口咽接触。15.--种通式为iVr(C,卜MU)n的错配双链核糖核酸的应用，其中，n是429的整数，所述错配双链核糖核酸用于制造与受病毒感染、带有肿瘤或者接受丫抗病毒或抗肿瘤接种的受试对象的免疫细胞上的Toll样受体3(TLR3)结合的药物。16.—种通式为iVr(C,H4U)n的错配双链核糖核酸，其中，n是429的整数，所述错配双链核糖核酸在无菌条件下制造并且用于治疗受病毒感染、带有肿瘤或者接受了抗病毒或抗肿瘤接种的受试对象。全文摘要一种作为Toll样受体3(TLR3)的激动剂的错配双链核糖核酸，所述错配双链核糖核酸在体外或体内可被用作抗病毒剂、抗增殖剂和免疫刺激剂中的一种或多种。本发明提供了医疗方法和药物的制造工艺。文档编号A01N43/04GK101652062SQ200880007263公开日2010年2月17日申请日期2008年3月5日优先权日2007年3月5日发明者布赖恩·B·高恩申请人:犹他州立大学