专利名称：Toll样受体3拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及Toll样受体3(TLR;3)抗体拮抗剂、编码TLR3抗体拮抗剂或其片段的多核苷酸，以及制造和使用它们的方法。
背景技术：
Toll样受体(TLR)调控天然免疫反应的活化并通过响应细菌、病毒、寄生和(在一些情况下)宿主衍生配体而引发信号转导级联反应来影响适应性免疫的发展(Lancaster 等人，J. Physiol. 563 :945-955,2005) 质膜定位的 TLR(TLR1、TLR2、TLR4 和 TLR6)能识别包括细菌和真菌的蛋白或类脂组分在内的配体。主要为胞内的TLR(TLR3、TLR7和TLR9)分别对dsRNA、ssRNA和未甲基化CpG DNA作出反应。TLR信号转导的调节异常据认为会造成许多问题，正在为此开发治疗策略(Hoffman等人，Nat. Rev. Drug Discov. 4 =879-880, 2005 ； Rezaei, Int.Immunopharmaco1. 6 :863-869,2006 ；ffickelgren, Science 312 184-187,
2006)。例如，正在临床开发分别针对严重脓血症和狼疮的TLR4及TLR7和9的拮抗剂 (Kanzler 等人，Nat. Med. 13 :552-559, 2007)。TLR3信号转导被在发炎或病毒感染期间由坏死细胞释放的dsRNA、mRNA或RNA活化。TLR3活化诱导干扰素和促炎性细胞因子的分泌，并在某些微生物感染期间触发具有保护作用的免疫细胞活化和细胞募集。例如，已将显性负TLR3等位基因与儿童期HSV-I初次感染时对单纯疱疹性脑炎的敏感性增加相关联(Zheng等人，Science 317 :1522-1527
2007)。在小鼠中，TLR3缺乏与柯萨奇病毒攻击时降低的存活率有关(Richer等人，PLoS One 4 :e4127，2009)。但是，已证明未受控制的或异常调节的TLR3信号转导造成某些病毒感染模型中的发病和死亡，所述病毒包括西尼罗病毒、白蛉病毒、牛痘和甲型流感病毒 (Wang 等人，Nat. Med. 10 1366-1373，2004 ；Gowen 等人，J. Immunol. 177 :6301-6307,2006 ； Hutchens 等人，J. Immunol. 180 :483-491，2008 ；Le Goffic 等人，PloS Pathog. 2 :E53， 2006)。已确定了人和鼠TLR3胞外结构域的晶体结构(Bell等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，102 10976-80，2005 ；Choe 等人，Science 309 :581-585, 2005 ；Liu 等人，Science, 320 :379-381,2008)。TLR3呈现由聚糖装饰的螺形马蹄(solenoid horseshoe)的总体形状，具有23个由富亮氨酸重复(LRR)基序组成的串联单元。dsRNA结合位点已被定位到两个不同的区域(Liu等人，Science，320 :379-81, 2008)。已提出信号转导组件是由IfdsRNA 和两个 TLR3 胞外结构域组成(Leonard 等人，Proc. Natl. Acad. Natl. Acad. Sci. (USA) 105 258-263,2008)。已证实TLR3能驱动多种炎性疾病、免疫介导疾病和自身免疫疾病中的致病机制， 这些疾病例如败血性休克(Cavassani等人，J. Exp. Med. 205 3609-2621，2008)、急性肺损伤(Murray 等人，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178 :1227_1237，2008)、类风湿性关节炎 (Kim 等人，Immunol. Lett. 124 :9-17,2009 ；Brentano 等人，Arth. Rheum. 52 :2656-2665, 2005)、哮喘(Sugiura 等人，Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40 :654-662,2009 ；Morishima 等人，Int. Arch. Allergy Immunol. 145 :163—174，2008 ；Stowell 等人，Respir. Res. 10 :43， 2009)、炎性肠病例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎(Zhou等人，J. Immunol. 178 =4548-4556, 2007 ；Zhou 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 104 :7512-7515,2007)、自体免疫性肝脏疾病 (Lang 等人，J. Clin. Invest. 116 :2456-2463,2006)和 I 型糖尿病(Dogusan 等人，Diabetes 57 :1236-1245,2008 ；Lien 和 Zipris, Curr. Mol. Med. 9 :52-68,2009)。此外，已证实 TLR3 表达的器官特异性增加与多种由调节异常的局部炎性反应驱动的病理状况相关，如原发性胆汁性肝硬化中的肝脏组织(Takii等人，Lab Invest. 85 =908-920,2005)、类风湿性关节炎的关节(Ospelt等人，Arthritis Rheum. 58 =3684-3692,2008)和过敏性鼻炎患者的鼻黏膜(Fransson 等人，Respir Res. 6 :100,2005)。在坏死状态下，包括内源性mRNA在内的胞内内含物的释放触发细胞因子、趋化因子和其他因子的分泌，这些细胞因子、趋化因子和其他因子会诱导局部炎症、有利于死亡细胞残留部分的清除和修复损伤的。坏死常常使炎性过程延长，引起慢性或严重炎症 (Bergsbaken等人，Nature Reviews7 :99_109，2009)。TLR3在坏死部位的活化会促成这些异常的炎性过程并通过释放的TLR3配体产生进一步的促炎正反馈环路。从而，TLR3拮抗在涉及慢性或严重炎症和/或坏死的多种疾病中可能是有益的。对TLR3活化的下调也可代表肿瘤学适应征的新治疗策略，所述肿瘤学适应征包括肾细胞癌和头颈鳞状细胞癌(Morikawa等人，Clin. Cancer Res. 13 :5703-5709,2007 ； Pries等人，Int. J. Mol. Med. 21 =209-215, 2008) 此外，已将编码活性降低的蛋白质的 TLR3l423F等位基因与对晚期“干性”年龄相关性黄斑变性的防护相关联(Yang等人，N. Engl. J. Med. 359 :1456-1463,2008)，这表明TLR3拮抗剂在这种疾病中可能是有益的。与炎性病症及其他病症有关的病变，例如与感染有关的那些病变，具有明显的健康和经济影响。然而，尽管在医学的许多领域有进步，但相比之下可用于许多这些病症的治疗选择和治疗方法很少。从而，存在着抑制TLR3活性来治疗TLR3相关病症的需求。
图1示出了抗人TLR3(huTLR3)单克隆抗体在NF-κ B报道基因测定中的影响。图2Α和2Β示出了抗人TLR3单克隆抗体在BEAS-2B测定中的影响(抑制百分数)。图3Α和;3Β示出了抗人TLR3单克隆抗体在NHBE测定中的影响。图4示出了抗人TLR3单克隆抗体在PBMC测定中的影响。图5Α和5Β示出了抗人TLR3单克隆抗体在HASM测定中的影响。图6Α、6Β和6C示出了抗人TLR3单克隆抗体与TLR3突变体的结合。图7Α示出了叠合在人TLR3E⑶的结构上的针对单克隆抗体15EVQ的表位(黑色) 和针对C1068单克隆抗体的表位(灰色)(上图)以及针对单克隆抗体12QVQ/QSV的表位 (黑色，下图)。图7Β示出了与单克隆抗体15EVQ复合的TLR3ECD蛋白的局部化H/D交换摄动图。图8Α和8Β示出了大鼠/小鼠抗小鼠TLR3单克隆抗体(替代抗体 (surrogate))在A)NF-κ B测定和B) ISRE报道基因测定中的影响。图9示出了替代单克隆抗体(单克隆抗体、单克隆抗体C1811)在MEFCXCL10/IP-10测定中的影响。图10示出了替代单克隆抗体与TLR3的结合的特异性。上分图同种型对照物；下分图单克隆抗体C1811。图11示出了替代单克隆抗体对AHR模型中的penH水平的影响。图12示出了替代单克隆抗体对AHR模型中的支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中的总嗜中性粒细胞数目的影响。图13示出了替代单克隆抗体对AHR模型中的支气管肺泡灌洗液中的CXCLlO/ IP- ο水平的影响。图14示出了替代单克隆抗体对DSS模型中的组织病理学评分的影响。图15示出了替代单克隆抗体对T细胞转移模型中的A)组织病理学评分和B)嗜中性粒细胞流入的影响。图16示出了替代单克隆抗体对CIA模型中的临床评分的影响。图17示出了替代单克隆抗体对CIA模型中的临床AUC评分的影响。图18示出了替代单克隆抗体对C57BL/6小鼠在鼻内施予甲型流感/PR/8/34后的存活的影响。单克隆抗体在-ι天开始给予。图19示出了替代单克隆抗体对施予甲型流感/PR/8/34后的临床评分的影响。单克隆抗体在-1天开始给予。图20示出了替代单克隆抗体对施予甲型流感/PR/8/34后14天的体重的影响。单克隆抗体在-1天开始给予。图21示出了替代单克隆抗体对(A)WT DIO动物和(B)TLRIO DIO动物在葡萄糖攻击(challenge)后的血液葡萄糖水平的影响。图22示出了替代单克隆抗体对WT DIO动物中的胰岛素水平的影响。图23示出了单克隆抗体15EVQ对NHBE细胞中的(A)NTHi水平和⑶鼻病毒诱导的 CXCL10/IP-10 和 CCL5/RANTES 水平的影响。图M示出了单克隆抗体15EVQ对HUVEC细胞中的(A) sICAM_l水平和⑶存活力的影响。图25示出了动物在甲型流感感染3天后施用替代单克隆抗体之后的存活率。图沈示出了在甲型流感感染3天后施用替代单克隆抗体之后的临床评分。图27示出了动物在甲型流感感染3天后施用替代单克隆抗体之后的体重变化。图 28 在 A 中示出了 huTLR3ECD 与 Fab 12QVQ/QSV、Fab 15EVQ 和 Fab cl068 的四元复合物的分子结构，以条带(ribbon)和表面(surface)显示方法表示。TLR3ECD为浅灰色，N末端以N标示；所有的Fab分子显示为暗灰色，以条带表示。B.表位标为浅灰色，并如A中的Fab那样标示在TLR3ECD上。在图观、四和30中，为了清楚起见，将Fab 12QVQ/ QSV, Fabcl068 和 Fab 15EVQ 在标注中分别缩写为 Fabl2、Fab 1068 和 Fabl5。图29示出了 Fab 15EVQ的中和机制。A.示出了 dsRNA:TLR3信号转导单元(SU)， 其中Fab 15EVQ表位在两个TLR3E⑶(浅灰色和暗灰色，且标为TLR!3)中的一个中突出显示 (浅灰色)。dsRNA配体显示为浅灰色的双螺旋。B.示出了 Fab 15EVQ结合，该结合在空间上抑制dsRNA结合，从而抑制SU的形成。具有更高亲和力的Fab 15EVQ的结合将防止SU 形成或者将解开预形成的SU。
图30示出了 Fab 12QVQ/QSV和Fab cl068的机制以及TLR3信号转导单元(SU)的簇集。A. Fab 12QVQ/QSV和Fab cl068可结合(或者共结合)单一 SU。B.两个SU在约76 个碱基对的dsRNA上的最接近簇集的模型。为清楚起见，三个表位在不同的分子中突出显示。C. Fab 12QVQ/QSV和Fabcl068的结合能防止SU簇集，这是因为抗体和邻近的SU之间的空间冲突所致。两个指向左边的箭头定量表示由于抗体所致的SU分隔的不同程度(底部箭头指Fab 12QVQ/QSV，上部箭头指Fab cl068)。图31示出了示例性抗体的连续编号、Kabat编号和Chothia编号之间的对应关系。 ⑶R和HV以灰色突出显示。图32示出了单克隆抗体15EVQ的VL与人Vkl构架区的比对。Chothia超可变环区以下划线表示，互补位残基(paratope residue)以双下划线表示，构架区差异以灰色突出显示。VkI基因是等位基因，除非另外指明。残基编号是连续的。图33示出了单克隆抗体15EVQ的VH与人Vh5构架区的比对。序列特征如在图32 中所标示。图34示出了单克隆抗体12QVQ/QSV的VL与人Vk3构架区的比对。序列特征如在图32中所标示。图35示出了单克隆抗体15EVQ或单克隆抗体12QVQ/QSV的VL和VH与人J κ构架区、JX构架区或Jh构架区的比对。序列特征如在图32中所标示。
发明内容
本发明的一个方面是分离的抗体或其片段，其中该抗体结合SEQ ID Ν0:2的toll 样受体 3 (TLR3)氨基酸残基 K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、 R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595 和 K619。本发明的另一个方面是分离的抗体或其片段，其中该抗体结合SEQ ID NO :2的 toll 样受体 3(TLR3)氨基酸残基 S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、 T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195 和 A219。本发明的另一个方面是具有重链可变区和轻链可变区的分离的抗体或其片段，其中该抗体以重链可变区 Chothia 残基 W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、YlOO 和 DlOOb 和轻链可变区 Chothia 残基 Q27、Y32、N92、T93、L94 和 S95 结合具有 SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列的TLR3。本发明的另一个方面是具有重链可变区和轻链可变区的分离的抗体或其片段，其中该抗体以重链可变区 Chothia 残基 N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99 和 YlOO 和轻链可变区 Chothia 残基 G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92 和 D93 结合具有 SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的TLR3。本发明的另一方面是一种与TLR3反应的分离的抗体，其中该抗体具有以下特性的至少一种a.以< IOnM 的 Kd 结合人 TLR3 ；b.在1 μ g/ml下，在体外聚(I:C)NF-kB报道基因测定中降低人TLR3生物活性> 50% ；c.在 10 μ g/ml 下，抑制用 < 100ng/ml 聚(I: C)刺激的 BEAS-2B 细胞的 IL-6 或CXCL10/IP-10 产量的> 60% ；d.在 0. 4 μ g/ml 下，抑制用 < 100ng/ml 聚(I: C)刺激的 BEAS-2B 细胞的 IL-6 或 CXCL10/IP-10 产量的> 50% ；e.在5μ g/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞的IL-6产量的> 50% ；f.在1 μ g/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞的IL-6产量的> 50% ；g.在1μ g/ml下，抑制PBMC细胞的由聚(I:C)诱导的IFN-Y、IL-6或IL-12产量的> 20% ；h.在体外NF-kB报道基因测定中以IC50 < 10 μ g/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性； 或者i.在体外ISRE报道基因测定中以IC50 < 5 μ g/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性。本发明的另一方面是一种与TLR3反应的分离的抗体，其与这样的单克隆抗体竞争TLR3结合，其中该单克隆抗体包含某些重链互补决定区(OTR) 1、2和3的氨基酸序列、某些轻链CDR 1、2和3的氨基酸序列、某些重链可变区(VH)的氨基酸序列或某些轻链可变区 (VL)的氨基酸序列。本发明的另一个方面是一种同时包含重链可变区和轻链可变区的与TLR3反应的分离的抗体，其中该抗体包含某些重链互补决定区(CDR) 1、2和3的氨基酸序列和某些轻链 ⑶R 1、2和3的氨基酸序列。本发明的另一个方面是一种同时包含重链可变区和轻链可变区的与TLR3反应的分离的抗体，其中该抗体包含某些重链可变区(VH)的氨基酸序列和某些轻链可变区(VL) 的氨基酸序列。本发明的另一个方面是一种同时包含重链可变区和轻链可变区的与TLR3反应的分离的抗体，其中该抗体包含某些重链的氨基酸序列和某些轻链的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种分离的抗体重链，其包含SEQ ID NO :6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、
202、164、212、213、214、215或216所示的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种分离的抗体轻链，其包含SEQ ID NO :5、7、9、11、13、15、 17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211 或
225所示的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种分离的抗体重链，其包含SEQ ID NO :102、130、131、132、 133、134、135、160、204、206、208、220、166 或 168 所示的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种分离的抗体轻链，其包含SEQ ID NO :155、156、157、158、
203、205、207、165、167或227所示的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种编码抗体重链的分离多核苷酸，该抗体重链包含SEQ ID NO :6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、 128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215 或 216 所示的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种编码抗体轻链的分离多核苷酸，该抗体轻链包含SEQ ID NO :5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211或225所示的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种编码抗体重链的分离多核苷酸，该抗体重链包含SEQ ID NO :102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166 或 168 所示的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种编码抗体轻链的分离多核苷酸，该抗体轻链包含SEQ ID NO :155、156、157、158、203、205、207、165、167 或 227 所示的氨基酸序列。本发明的另一方面是一种药物组合物，其包含本发明的分离的抗体和药用载体。本发明的另一方面是一种载体，其包含至少一种本发明的多核苷酸。本发明的另一方面是一种宿主细胞，其包含本发明的载体。本发明的另一方面是一种制造与TLR3反应的抗体的方法，其包括培养本发明的宿主细胞并回收由宿主细胞产生的抗体。本发明的另一方面是一种治疗或预防炎性病症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗或预防该炎性病症的时间。本发明的另一个方面是一种治疗或预防全身炎性病症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗或预防该全身炎性病症的时间。本发明的另一方面是一种治疗II型糖尿病的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗II型糖尿病的时间。本发明的另一方面是一种治疗高血糖症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗高血糖症的时间。本发明的另一方面是一种治疗高胰岛素血症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗胰岛素抗性的时间。本发明的另一方面是一种治疗或预防病毒感染的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗或预防病毒感染的时间。
具体实施例方式本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。本文所用的术语“拮抗剂”意指一种分子，其通过任何机制部分或完全抑制另一分子(例如受体或胞内介体)的作用。如本文所用，“TRL3抗体拮抗剂”或“与TLR3反应的”抗体描述了一种抗体，其能够直接或间接显著抵消、减少或抑制TLR3生物活性或TLR3受体活化。例如，与TLR3反应的抗体能直接结合TLR3并中和TLR3活性，即阻断TLR3信号转导以减少细胞因子和趋化因子释放或者NF-κ B活化。本文所用的术语“抗体”在广义上表示并包括免疫球蛋白或抗体分子(包括多克隆抗体)、单克隆抗体(包括鼠、人、人适应、人源化和嵌合单克隆抗体和抗体片段)。通常，抗体是显示出对特定抗原的结合特异性的蛋白或肽链。完整抗体是由两条相同轻链和两条相同重链构成的异四聚化糖蛋白。通常，各条轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量不同。各条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥键。各条重链在一个末端具有可变结构域(可变区)(VH)，后面跟着多个恒定结构域(恒定区)。各条轻链在一端具有可变域(VL)和在其另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并且轻链可变域与重链的可变域对齐。任何脊椎动物物种的抗体轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列被指定为两种明显不同类型之一， 艮P κ和λ。免疫球蛋白可以根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、 IgE、IgG 和 IgM。IgA 和 IgG 进一步再被分为同种型 IgA1. IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 和 Ig(i4。术语“抗体片段”意指完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段、双抗体、单链抗体分子和由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体。免疫球蛋白轻链可变区或重链可变区由一个“构架”区和间夹的三个“抗原结合位点”组成。抗原结合位点用如下不同的术语定义(i)术语互补决定区(CDR)基于序列变异性(Wu和Kabat, J. Exp. Med. 132 =211-250,1970)。通常，抗原结合位点具有六个CDR ； 三个在 VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，三个在 VL (LCDR1、LCDR2、LCDR； ) (Kabat 等人，kquences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,Md. , 1991) (ii)术语“超可变区”、“HVR”、“HV”指抗体可变结构域的在结构上超可变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk，Mol. Biol. 196 :901-917,1987)。通常，抗原结合位点具有六个高变区，三个在VH中(H1、H2、H3)， 三个在VL中(L1、L2、L3。)Chothia和Lesk将结构保守的HV称为“正则结构”。(iii)由 Lefranc 提出的“IMGT-CDR，，(Lefranc 等人，Dev. Comparat. Immunol. 27 :55-77,2003)是基于T细胞受体与免疫球蛋白的V域的比较。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://WWW_ imgt_org)提供了这些区域的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描绘(delineation)之间的对应性在 Lefranc 等人的 Dev. Comparat. Immunol. 27 :55-77, 2003 中描述。(iv)抗原结合位点还可基于特异性决定残基用法(Specificity Determining Residue Usage, SDRU) (Almagro，Mol.Recognit. 17 :132-143，2004)来描绘，其中特异性决定残基(SDR)是指免疫球蛋白的直接参与抗原接触的氨基酸残基。SDRU是不同类型的抗原的SDR的数目和分布的精确度量，由对抗原-抗体复合物的晶体结构的分析来限定。(ν)抗原结合位点还可定义为从抗原-抗体复合物的晶体结构鉴定的抗体互补位残基。本文所用的术语“复合序列”指这样的抗原结合位点，其被定义为包括所有分别由 Kabat、Chothia或IMGT描绘的氨基酸残基，或者任何其他合适的抗原结合位点描绘。本文所用的“Chothia 残基”是根据 Al-Lazikani (Al-Lazikani 等人，J. Mol. Biol. 273 =927-48,1997)编号的抗体VL和VH残基。两种最常用的编号系统Kabat (Kabat 等人，Sequences of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, NIH, Bethesda, MD, 1991)和 Chothia (Chothia 和 Lesk，Mol. Biol. 196 :901-17,1987)之间相对于连续多肽编号的对应性在图31中针对本发明的示例性抗体进行了显示。“构架”或“构架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。构架通常分成四个区域FR1、FR2、FR3和FR3，它们形成每个可变区中的三个抗原结合位点的骨架。因为抗原结合位可以由上面所述的各种术语定义，所以构架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。本文所用的“轻链可变区κ 1(Vk 1)构架”或“VK 1”指具有由人Vk 1功能基因或它们的等位基因中的任何一个所编码的氨基酸序列的构架。示例性的功能性人Vkl 基因是 IGKV1-5*01、IGKV1-6*01、IGKV1_8*01、IGKV1_9*01、IGKV1_12*01、IGKV1_13*02、 IGKV1-16*0U IGKV1-17*0U IGKV1-27*0U IGKV1-33*0U IGKV1-37*0U IGKV1-39*01, IGKV1D-8*0UIGKV1D-12*0UIGKV1D-13*0UIGKV1D-16*0UIGKV1D-17*0UIGKV1D-33*0U IGKV1D-37*01、IGKV1D_39*01、IGKV1D_42*01 或 IGKV1D_43*01。免疫球蛋白基因的命名是公知的。本文所用的“轻链可变区λ3(νλ3)构架”或“νλ3”指具有由人νλ3功能基因或它们的等位基因中的任何一个所编码的氨基酸序列的构架。示例性的功能性人νλ 3基因是 IGLV3-1*01、IGLV3-9*01、IGLV3_10*01、IGLV3_12*01、IGLV3_16*01、IGLV3_19*01、 IGLV3-21*01、IGLV3-22*01、IGLV3_25*01、IGLV3_27*01和 IGLV3_32*01。本文所用的“重链可变区Vh5构架”或“Vh5”指具有由人Vh5功能基因或它们的等位基因中的任何一个所编码的氨基酸序列的构架。示例性的功能性人Vh5基因是 IGHV5-51*01 和 IGHV5-1*01。本文所用的“重链可变区Vh6构架”或“Vh6”指具有由人Vh6功能基因或它们的等位基因中的任何一个所编码的氨基酸序列的构架。示例性的功能性人Vh6基因是 IGHV6-1*01。本文所用的“轻链k J区(JK)构架”或“JK ”指具有由人JK功能基因或它们的等位基因中的任何一个所编码的氨基酸序列的构架。示例性的功能性人Vk基因是IGKJ1、 IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4 和 IGKJ5。本文所用的“轻链λ J区(JX )构架”或“JX ”指具有由人JX功能基因或它们的等位基因中的任何一个所编码的氨基酸序列的构架。示例性的功能性人JX基因是IGLJ1、 IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6 和 IGLJ7。本文所用的“重链J区(Jh)构架”或“Jh”指具有由人Jh功能基因或它们的等位基因中的任何一个所编码的氨基酸序列的构架。示例性的功能性人Jh基因是IGHJ1、IGHJ2、 IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5 禾口 IGHJ6。本文所用的“种系基因”或“抗体种系基因”是由未经历过成熟过程的非淋巴样细胞所编码的免疫球蛋白序列，该成熟过程会导致遗传重排和突变以表达特定免疫球蛋白。本文所用的“骨架”指由人种系基因所编码的轻链或重链可变区的氨基酸序列。因此，骨架同时涵盖构架和抗原结合位点。本文所用的术语“抗原”意指任何具有直接或间接产生抗体的能力的分子。蛋白编码核酸包括在“抗原”的定义内。术语“同源物”意指与参考序列具有40%至100%序列同一性的蛋白质序列。人 TLR3的同源物包括来自与已知的人TLR3序列具有40%至100%序列同一性的其他物种的多肽。两条肽链之间的同一性百分数可通过使用Vector NTI v. 9. 0. 0 (Invitrogen, Carlsbad, CA)的AlignX模块的默认设置值进行成双比对来确定。所谓“TLR3”是指人 TLR3 (huTLR3)及其同源物。全长huTLR3的核苷酸序列和氨基酸序列分别以SEQ ID NO=I 和2示出。huTLR3胞外结构域(EOT)的核苷酸和氨基酸序列分别以SEQ ID No :3和4示出ο本文所用的术语“基本相同”意指相比较的两个抗体或抗体片段氨基酸序列是相
12同的或具有“非实质差异”。非实质差异是抗体或抗体片段氨基酸序列中有1、2、3、4、5或 6个氨基酸的置换。与本文所公开的序列基本相同的氨基酸序列也是本申请的一部分。在一些实施例中，序列同一性可以是约90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%或更高。同一性百分比可以如上所述来确定。相比较的示例性肽链是重链或轻链可变区。本文所用的术语“与...结合”意指所描述的各试剂可以在混合物中一起、作为各单一试剂同时地或作为各单一试剂以任何顺序连续地施予到动物。本文所用的术语“炎性病症”意指部分地由细胞因子、趋化因子或炎性细胞(例如嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)的活性所介导的对细胞损伤的局部化反应，在大多数情况下其特征在于疼痛、发红、肿胀和组织功能丧失。本文所用的术语“炎性肺部病症”意指影响肺或与肺有关的炎性病症。本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)是指从基本上同种的抗体的群体所获得的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体具有高度特异性，其通常针对单一抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的基本上同种的性质，并不要求用任何特定方法产生抗体。例如，鼠单克隆抗体可以由Kohler等人的杂交瘤方法(Nature 256 :495-497,1975)来制造。可以用美国专利No. 4，816，567中所公开的方法制备这样的嵌合单克隆抗体，其包含衍生自供体抗体(通常为鼠动物)的轻链和重链可变区和与之相结合的衍生自受体抗体(通常为另一种哺乳类物种，如人类)的轻链和重链恒定区。可以通过本领域技术人员已知的技术(例如美国专利No. 5，225，539所公开的技术)来制备这样的人适应单克隆抗体，其具有衍生自非人供体免疫球蛋白(通常是鼠)的CDR和其分子的衍生自一种或多种人免疫球蛋白的剩余免疫球蛋白衍生部分。可用于人适应的人构架序列可以由本领域技术人员从相关数据库选择。任选地，可以通过诸如 Queen 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) ,86 :10029-10032,1989)禾口 Hodgson等人(Bi0/Techn0l0gy，9 =421,1991)所公开的技术，通过掺入改变了的构架支持残基来进一步修饰人适应单克隆抗体以保持亲合力。缺乏任何非人序列的完全人单克隆抗体，可通过例如Lonberg等人，Nature 368 856-859，1994 ；Fishwild 等人，Nature Biotechnology 14 :845-851,1996 ；和 Mendez 等人，Nature Genetics 15 146-156，1997中提到的技术从人免疫球蛋白转基因小鼠制备。 人单克隆抗体也可通过例如Knappik等人，J. Mol. Biol. 296 =57-86, 2000和Krebs等人， J. Immunol. Meth. 254 :67-84 2001中提到的技术从噬菌体展示文库制备和优化。抗体的片段例如Fab、F(ab' ) 2、Fd和dAb片段可通过抗体的切割或者通过重组工程来产生。例如， Fab和F(ab’)2片段可通过用酶如胃蛋白酶处理抗体来产生。本文所用的术语“表位”意指抗体特异性结合的抗原部分。表位通常由诸如氨基酸或多糖侧链的部分(moiety)的化学活性(例如，极性、非极性或疏水性)表面定群 (grouping)构成，并可以具有特异性三维结构特征以及特异性电荷特征。表位可以是本质上线性的，或者可以是不连续的表位，例如构象表位，其是通过抗原的非邻近氨基酸之间的空间关系形成，而非通过线性系列的氨基酸的空间关系形成。构象表位包括由抗原的折叠产生的表位，其中抗原线性序列的不同部分的氨基酸在三维空间中紧邻。本文所用的术语“互补位”指抗体的为抗原所特异性结合的部分。互补位可以是本质上线性的，或者可以是不连续的，通过抗体的非邻近氨基酸之间的空间关系形成，而非通过线性系列的氨基酸的空间关系形成。“轻链互补位”和“重链互补位”或“轻链互补位氨基酸残基”和“重链互补位氨基酸残基”分别指与抗原接触的抗体轻链和重链残基。本文所用的术语“特异性结合”是指抗体以比对其他抗原或蛋白质更大的亲和力与预定抗原结合。通常，抗体以1(ΤΜ或更小的解离常数(Kd)结合，并且与预定抗原结合的 Kd为其与除预定抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他指定多肽)结合的Kd的至少不到1/2。词语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语 “与抗原特异性结合的抗体”或“抗原特异性抗体”例如TLR3特异性抗体互换使用。可以使用下面所述的标准程序来测量解离常数。本文所用的术语“TLR3生物活性”或“TLR3活化”是指任何由于配体结合到TLR3而出现的活性。TLR3配体包括dsRNA、聚(I C)和内源mRNA，如从坏死细胞释放的内源mRNA。 示例性的TLR3活化导致响应TLR3配体而活化NF- κ B。NF- κ B活化可在用聚(I C)诱导受体时使用报道基因测定法(Alexopoulou等人，Nature 413 :732-738,2001 ； Hacker等人， EMBO J. 18 =6973-6982,1999)进行测定。另一种示例性的TLR3活化导致响应TLR3配体而活化干扰素响应因子(IRF-3、IRF-7)。TLR3介导IRF活化可以使用由干扰素刺激的反应元件(ISRE)驱动的报告基因来分析。另一种示例性的TLR3活化导致促炎细胞因子和趋化因子 G^i^nTNF-a、IL-6、IL-8、IL-12、CXCL5/IP-10*RANTES)的分泌。从细胞、组织释放或流通中的细胞因子和趋化因子可以使用公知的免疫测定法例如ELISA免疫测定法来测量。本文使用如下的常规单字母和三字母氨基酸代码
权利要求
1.一种分离的抗体或其片段，其中所述抗体结合SEQ ID N0:2的toll样受体3(TLR3) 氨基酸残基 K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、 N515、N516、N517、H539、N541、S57UL595 和 K619。
2.一种分离的抗体或其片段，其中所述抗体结合SEQ ID N0:2的toll样受体3(TLR3) 氨基酸残基 S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、 E189、D192、A195 和 A219。
3.一种包含重链可变区和轻链可变区的分离的抗体或其片段，其中所述抗体以重链可变区 Chothia 残基 W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、YlOO 和 DlOOb 和轻链可变区Chothia残基Q27、Y32、N92、T93、L94和S95结合具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的 TLR3。
4.根据权利要求3所述的分离的抗体，其中所述抗体具有以下性质中的至少一种a.以<IOnM的Kd结合人TLR3 ；b.在lyg/ml下，在体外聚(I:C)NF-KB报道基因测定中降低人TLR3生物活性> 50% ；c.在10μ g/ml 下，抑制用 < 100ng/ml 聚(I: C)刺激的 BEAS-2B 细胞的 IL-6 或 CXCLlO/ IP-10 产量的> 60% ；d.在0.4 μ g/ml下，抑制用< 100ng/ml聚(I C)刺激的BEAS-2B细胞的IL-6或 CXCL10/IP-10 产量的> 50% ；e.在5μg/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I: C)刺激的NHBE细胞的IL-6产量的> 50% ；f.在1μg/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞的IL-6产量的> 50%；g.在1μg/ml下，抑制PBMC的由聚(I:C)诱导的IFN-γ、IL_6或IL-12产量的> 20% ；h.在体外NF-kB报道基因测定中以IC50< 10μ g/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性；或者i.在体外ISRE报道基因测定中以IC50< 5 μ g/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性。
5.根据权利要求3所述的分离的抗体，其中所述抗体包含长度为12个氨基酸的重链互补决定区(CDR) 3 (HCDR3)。
6.根据权利要求3所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有分别与SEQID N0:82、 86和84所示的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列的重链互补决定区(OTR) 1、2 和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和具有分别与SEQ ID NO :79、80和87所示的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1、2和3 (IXDR1、IXDR2、IXDR3)。
7.根据权利要求3所述的分离的抗体，其包含轻链构架和重链构架，所述轻链构架与轻链可变区κ 1)构架(VK 1)的氨基酸序列具有至少90%同一性，所述重链构架与重链可变区Vh5构架(VM)的氨基酸序列具有至少90%同一性。
8.根据权利要求7所述的分离的抗体，其中所述Vkl构架由IGKV1-39*01编码，具有 SEQ ID NO :221所示的氨基酸序列，所述Vh5构架由IGHV5-51*01编码，具有SEQ ID N0: 222所示的氨基酸序列。
9.一种包含重链可变区和轻链可变区的分离的抗体或其片段，其中所述抗体以重链可变区 Chothia 残基 N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99 和 Y100 和轻链可变区 Chothia 残基 G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92 和 D93 结合具有 SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列的TLR3。
10.根据权利要求9所述的分离的抗体，其中所述抗体具有以下性质中的至少一种a.以<IOnM的Kd结合人TLR3 ；b.在lyg/ml下，在体外聚(I:C)NF-KB报道基因测定中降低人TLR3生物活性> 50% ；c.在10μ g/ml 下，抑制用 < 100ng/ml 聚(I: C)刺激的 BEAS-2B 细胞的 IL-6 或 CXCLlO/ IP-10 产量的> 60% ；d.在0.4 μ g/ml下，抑制用< 100ng/ml聚(I C)刺激的BEAS-2B细胞的IL-6或 CXCL10/IP-10 产量的> 50% ；e.在5μg/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I: C)刺激的NHBE细胞的IL-6产量的> 50% ；f.在1μg/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞的IL-6产量的> 50%；g.在1μ g/ml下，抑制PBMC的由聚(I:C)诱导的IFN-γ、IL_6或IL-12产量的> 20%。
11.根据权利要求9所述的分离的抗体，其中所述抗体包含长度为10个氨基酸的 HCDR3和长度为10个氨基酸的IXDR3。
12.根据权利要求9所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有与SEQID NO 70,77 和72所示的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列的重链互补决定区(OTR) 1、2和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和具有与SEQ ID NO :67、68和78所示的氨基酸序列有至少90% 同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1、2和3 (IXDR1、IXDR2、IXDR3)。
13.根据权利要求9所述的分离的抗体，其包含轻链构架和重链构架，所述轻链构架与轻链可变区κ 3 (V λ 3)构架(V λ 3)的氨基酸序列具有至少90%同一性，所述重链构架与重链可变区Vh6构架(Vh6)的氨基酸序列具有至少90%同一性。
14.根据权利要求13所述的分离的抗体，其中所述νλ3构架由IGLV3-1*01编码，具有SEQ ID NO :223所示的氨基酸序列，所述Vh6构架由IGHV6-1*01编码，具有SEQ ID N0: 2 所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求1或9所述的分离的抗体或片段，其中所述抗体a.是完全人抗体；b.是人适应抗体；c.缀合到聚乙二醇；d.为IgG4同种型或者e.Fc结构域包含S2^P、P235A或L236A突变。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1或9所述的分离的抗体或片段以及药用载体。
17.一种治疗炎性病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1或9所述的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗或预防所述炎性病症的时间。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述炎性病症是炎性肺部病症、炎性肠病、自身免疫疾病、全身性炎性病症或类风湿性关节炎。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述炎性肺部病症是哮喘、慢性阻塞性肺病 (COPD)、气道高反应性，或者是由非分型流感嗜血杆菌引起。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述全身性炎性病症是细胞因子风暴或高细胞因子血症、全身炎性反应综合征(SIRS)、移植物抗宿主病(GVHD)、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)、严重急性呼吸窘迫综合征(SARS)、灾难性抗磷脂综合征、严重病毒感染、流行性感冒、肺炎、休克或败血症。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述炎性病症与胃肠溃疡有关。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述胃肠溃疡与传染性结肠炎、缺血性结肠炎、 胶原性或淋巴细胞性结肠炎或坏死性小肠结肠炎有关。
23.一种治疗II型糖尿病、高血糖或高胰岛素血症的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1或9所述的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗II型糖尿病、高血糖或高胰岛素血症的时间。
24.一种治疗或预防病毒感染的方法，其包括将治疗有效量的根据权利要求1或9所述的分离的抗体施用给需要其的患者一段足以治疗或预防病毒感染的时间。
25.根据权利要求M所述的方法，其中所述病毒感染是甲型流感病毒感染。
全文摘要
本发明公开了Toll样受体3(TLR3)抗体拮抗剂、编码TLR3抗体拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制造和使用它们的方法。
文档编号C12P21/06GK102482699SQ201080030275
公开日2012年5月30日 申请日期2010年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者A·特普利亚科夫, F·滕, J·罗, K·赫林加, L·桑马特奥, M·坎尼安, M·鲁茨, R·T·萨里斯基, R·劳亨伯格, R·斯维特, S·吴, Y·冯 申请人:詹森生物科技公司