本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种植物次生代谢产物获取的装置及其应用。
背景技术：
番石榴(psidiumguajaval.)是桃金娘科(myrtaceae)番石榴属(psidium)植物，原产热带美洲，现在很多热带、亚热带地区广为栽培，在我国主要分布于海南、广西、广东、福建和台湾等地。番石榴除果实可食用外，叶片还具有重要的药理作用。
次生代谢产物是由次生代谢产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，分为醌类、黄酮类、甾体及其甙、单宁类、苯丙素类、萜类、生物碱七大类，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。药用植物中次生代谢产物是其发挥药用作用的关键成分。
迄今从番石榴叶中已分离并获得的有三萜类、黄酮类、鞣质类、倍半萜类等成分。目前番石榴叶片可产生主要的次级代谢产物包括乌苏酸ⅰ、齐墩果酸ⅱ、对羟基苯乙酸ⅴ、酪醇ⅵ、菜油甾醇ⅷ、琥珀酸ⅸ、β-谷甾醇ⅹ、过氧麦角甾醇ⅺ、d-阿洛醇ⅻ等。
一般情况下，植物次生代谢产物是从种植或自然分布的植物体中提取得到，但是往往容易造成对植物的采摘过度和乱砍乱伐等问题。采用植物组织培养能减少对保护植物本身的破坏，同时也能更容易获得目的产物。然而，传统的植物组织培养面临着人工消耗大、低通量和单次培养物单一的情况。针对这些问题，对反应器进行改进是必须的。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种培养效果高、装置结构简单的番石榴次生代谢产物培养用装置及其应用。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种番石榴次生代谢产物培养用装置，包括培养罐体、培养液储罐与多层培养架；所述培养罐体包括外培养罐与设于所述外培养罐内的内培养罐，所述培养液储罐包括第一培养液储罐与第二培养液储罐，所述多层培养架包括可拆卸固设于所述内培养罐内的圆形培养架和可拆卸固设于所述外培养罐内的环形培养架；所述内培养罐通过第一连接管与第一培养液储罐连通形成第一密闭空间，所述外培养罐通过第二连接管与第二培养液储罐连通形成第二密闭空间，且所述第一密闭空间与所述第二密闭空间互不连通；所述内培养罐上设有用于通过气压调节第一培养液储罐中培养液是否进入内培养罐的第一气压调节系统，所述外培养罐上设有用于通过气压调节第二培养液储罐中培养液是否进入外培养罐的第二气压调节系统。上述第一连接管、第二连接管要保证其末端靠近第一培养液储罐与第二培养液储罐的底部，以便通过压力控制培养液是否进入内、外培养罐。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置中，优选的，所述内培养罐上还设有用于与所述第一气压调节系统相配合、控制所述内培养罐内气压的第三气压调节系统；所述外培养罐上还设有用于与所述第二气压调节系统相配合、控制所述外培养罐内气压的第四气压调节系统。第三气压调节系统和第四气压调节系统分别与第一气压调节系统和第二气压调节系统相配合，能起到进一步稳定罐内气压的作用，可调节培养液进入量并维持内培养罐与外培养罐气压，使培养罐内培养环境处于较稳定状态，在促进培养植物组织生长的同时，使培养罐内培养组织细胞大小较为均一，便于后续回收处理。本发明中，一般优选使培养液的高度达到罐体装置的1/2以上，更优选培养液高度为罐体的1/2-2/3。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置中，优选的，所述第一气压调节系统包括连接端口一、空气过滤器一、泵一及用于依据罐内气压控制泵一开启或关闭的控制器一，所述空气过滤器一通过连接端口一与内培养罐连接，所述泵一与空气过滤器一连接；所述第二气压调节系统包括连接端口二、空气过滤器二、泵二及用于依据罐内气压控制泵二开启或关闭的控制器二，所述空气过滤器二通过连接端口二与外培养罐连接，所述泵二与空气过滤器二连接；所述第三气压调节系统包括连接端口三、空气过滤器三与排气阀三，所述空气过滤器三通过连接端口三与内培养罐连接，所述排气阀三位于所述空气过滤器三的进气端；所述第四气压调节系统包括连接端口四、空气过滤器四与排气阀四，所述空气过滤器四通过连接端口四与外培养罐连接，所述排气阀四位于所述空气过滤器四的进气端。本发明中，所有空气过滤器的过滤孔径优选为0.22μm。所有控制器的作用在于控制相应泵的开启与关闭，以实现培养液是否进入内培养罐或外培养罐。可以通过改变控制器的程序控制，实现泵的间歇工作或连续工作，以实现间歇培养或连续培养。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置中，当内培养罐(或外培养罐)内气压过高时，开启第一气压调节系统(或第二气压调节系统)的泵，将罐内气体抽出，气压降低并引入培养液。当内培养罐(或外培养罐)内气压过低时，开启第三气压调节系统(或第四气压调节系统)的排气阀，使罐内气体与空气接触，升高气压。本发明中，优选的，排气阀三也与控制器一连接，并受控制器一控制其开启与否，用于与泵一协同作用，用于稳定内培养罐内的气压；排气阀四也与控制器二连接，并受控制器二控制其开启与否，用于与泵二协同作用，用于稳定外培养罐内的气压。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置中，优选的，所述内培养罐设于所述外培养罐的中上部，其二者的竖直中心轴线相互重叠。内培养罐设于外培养罐的中上部，使外培养罐下部空间具有一定容纳培养液的空间，也使于装设混合搅拌装置。其二者的竖直中心轴线相互重叠便于环形培养架的装设。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置中，优选的，所述外培养罐的底部设有桨叶搅拌装置(优选的，第一连接管为桨叶搅拌装置的转轴)。本发明中，通过第二气压调节系统可以实现第二培养液储罐内的培养液与环形培养架上的培养组织接触与否，但此时，第二培养液储罐内的培养液的用量会很大。利用桨叶搅拌装置的离心力，可使进入外培养罐内的培养液与环形培养架上的培养组织接触，可通过桨叶搅拌装置的转速、转动时间等控制进入外培养罐中的培养液与环形培养架上的培养组织接触的时间，这样可以大大减小第二培养液储罐内的培养液的用量。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置中，优选的，所述内培养罐的底部呈倒锥形，所述第一连接管设于所述倒锥形的尖部，所述第一连接管与内培养罐连接处设有滤网；所述第二连接管设于所述外培养罐的底部，所述第二连接管与外培养罐连接处设有滤网。滤网的存在，可以避免从培养架上掉落的培养组织进入培养液中。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置中，优选的，所述圆形培养架包括多块圆形隔片和用于将圆形隔片固定的支柱，所述环形培养架包括多层块环形隔片和用于将圆形隔片固定的支柱，所述每块圆形隔片和环形隔片底部均设有用于防止培养组织从隔片上掉落的生物滤膜。生物滤膜的存在，可以减小培养组织从培养架上掉落，也可以增大培养组织的附着面积，扩大培养量。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置的尺寸可以依据需要改变，以适用培养需求。第一气压调节系统、第二气压调节系统、第三气压调节系统与第四气压调节系统与罐体的连接方式也可灵活多变，只在能实现本发明目的即可。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置还包括有辅助装置，其包括加热装置，用以提供培养液的温度控制；光照装置，用以保证培养时的光照；co2输入装置，可与泵进气口相连，以调整通入培养罐内的空气组分，使培养组织生长更加健壮；传感探针，可实时监测培养液中的ph及各种成分的变化，以便于更好的控制培养环境。
本发明番石榴次生代谢产物培养用装置的原理如下：以内培养罐为例，当把培养组织接种到圆形培养架上后，开启第一气压调节系统，内培养罐内的气压在泵的作用下会降低，此时第一培养液储罐内的液体会进入内培养罐，从而与圆形培养架上的培养组织接触达到培养的目的。当需要将培养液与培养组织分离时，只需将内培养罐内的气压恢复至常压即可，此时培养液在重力作用下会返回第一培养液储罐。通过改变控制器的程序，可以实现连续操作或实现精准控制的间歇操作。
本发明中，培养液提供的环境可根据培养组织的特性进行选择，可选择合适的培养环境、逆境胁迫环境或添加诱导因子等，培养液可以在培养中途改变。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述番石榴次生代谢产物培养用装置的应用，将所述装置用于同时培养番石榴丛生芽或番石榴愈伤组织以获得番石榴次生代谢产物，包括以下步骤：
(1)向第一培养液储罐与第二培养液储罐中加入培养液，将番石榴顶芽及相连的1-5节茎段接种到圆形培养架上，同时将番石榴顶芽接种到环形培养架上，通过第一气压调节系统与第二气压调节系统控制培养液浸没圆形培养架与环形培养架的时间进行扩增培养，圆形培养架上得到番石榴丛生芽，环形培养架上得到番石榴愈伤组织；
(2)更换第一培养液储罐与第二培养液储罐中的培养液，通过第一气压调节系统与第二气压调节系统控制培养液浸没圆形培养架与环形培养架的时间进行培养得到次生代谢产物；
(3)收集第一培养液储罐与第二培养液储罐中的培养液，从培养液中提取次生代谢产物。
上述应用中，优选的，所述步骤(1)中，所述番石榴顶芽及附近茎段接种到圆形培养架前用50％-75％酒精浸泡30s-1min，再以0.1％升汞处理6-8min，最后以无菌水冲洗3-4次(更优选的，选用番石榴顶芽及相连的2-3节茎段以75％酒精浸泡30s，再以0.1％升汞处理8min，最后以无菌水冲洗4次)，并控制接种量为100-120个分开接种4层，每层25-30个(更优选接种密度100个，分开接种4层，每层25个)；所述番石榴顶芽接种到环形培养架前用50％-75％酒精浸泡30s-1min，再以0.1％升汞处理6-8min，最后以无菌水冲洗3-4次，并控制接种量为120个，分开接种4层，每层30个。
所述第一培养液储罐中加入的培养液的配方为：ms+蔗糖20g+0.4mg/lnaa，所述培养液的ph为5.8，所述培养液与圆形培养架的浸没频率为5min/6h，所述内培养罐内的培养条件为：光照强度2000-2400lux(更优选2000lux)，光照时间12h/d，培养温度25±2℃(更优选25±0.5℃)，培养时间10-15d(更优选12d)。
所述第二培养液储罐中加入的培养液的配方为：ms+蔗糖30g+0.5mg/lnaa，所述培养液的ph为5.8，所述培养液与圆形培养架的浸没频率为4min/4h，所述内培养罐内的培养条件为：光照强度2000-2400lux(更优选2200lux)，光照时间12h/d，培养温度25±2℃(更优选25±0.5℃)，培养时间6-10d(更优选10d)。
上述应用中，优选的，所述步骤(2)中，所述第一培养液储罐中加入的培养液的配方为：ms+5.0mg/l6-ba+蔗糖30g+0.5mg/lnaa，所述培养液的ph为5.8，所述培养液与圆形培养架的浸没频率为12min/2h，所述内培养罐内的培养条件为：光照强度2000lux，光照时间8h/d，培养温度25±2℃(优选25±1℃)，培养时间40-60d(更优选为60d)。
所述第二培养液储罐中加入的培养液的配方为：ms+7.0mg/l6-ba+蔗糖30g+0.5mg/lnaa，所述培养液的ph为5.8，所述培养液与圆形培养架的浸没频率为8min/2h，所述内培养罐内的培养条件为：光照强度2000-2200lux(更优选2200lux)，光照时间8h/d，培养温度25±2℃(优选25±1℃)，培养时间40-60d(更优选为45d)。
上述应用中，优选的，在步骤(3)番石榴次生代谢产物的提取过程中，将番石榴丛生芽或番石榴愈伤组织取出后，同时将培养液进行回收，以制备型薄层色谱进行分离纯化。
上述应用中，优选的，步骤(1)中向第一培养液储罐与第二培养液储罐中加入培养液后，再对整个装置进行高温灭菌处理，除去了初始培养液需单独灭菌处理再放置入储液罐的不便，避免了初始培养液染菌的风险。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明装置包括内培养罐与外培养罐，其分别形成两个独立的培养环境，利用同一装置即可实现两种番石榴组织的同时培养，可大大减小培养时间，提高培养效率。
2、本发明装置操作简便，培养组织的培养环境易于控制，易于实现特定培养环境以得到特定次生代谢产物。
3、本发明获得的植物组织品质较为均一，易于纯化，便于后续的回收处理，能减轻后续提纯处理的过程，节约成本。
4、本发明装置结构简单、易于生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明番石榴次生代谢产物培养用装置的拆分结构示意图。
图2为本发明番石榴次生代谢产物培养用装置的结构示意图。
图例说明：
101、空气过滤器一；102、空气过滤器二；103、空气过滤器三；104、空气过滤器四；201、连接端口一；202、连接端口二；203、连接端口三；204、连接端口四；4、内培养罐；5、外培养罐；6、圆形培养架；7、环形培养架；8、第二连接管；9、第一连接管；10、搅拌装置；11、密封盖一；12、第一培养液储罐；13、密封盖二；14、第二培养液储罐；1501、泵一；1502、泵二；1601、控制器一；1602、控制器二；1703、排气阀三；1704、排气阀四；20、一体盖。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
如图1和图2所示，本实施例的番石榴次生代谢产物培养用装置，包括培养罐体(采用耐高温高压、透明的材料)、培养液储罐与多层培养架；培养罐体包括外培养罐5与设于外培养罐5内的内培养罐4(内培养罐4设于外培养罐5的中上部，其二者的竖直中心轴线相互重叠)，培养液储罐包括第一培养液储罐12与第二培养液储罐14，多层培养架包括可拆卸固设于内培养罐4内的圆形培养架6和可拆卸固设于外培养罐5内的环形培养架7(通过铁丝钩接于内培养罐4或外培养罐5的内壁，以免培养液的上升或下降导致培养架晃动)；内培养罐4通过第一连接管9与第一培养液储罐12连通形成第一密闭空间，外培养罐5通过第二连接管8与第二培养液储罐14连通形成第二密闭空间，且第一密闭空间与第二密闭空间互不连通；内培养罐4上设有用于通过气压调节第一培养液储罐12中培养液是否进入内培养罐4的第一气压调节系统，外培养罐5上设有用于通过气压调节第二培养液储罐14中培养液是否进入外培养罐5的第二气压调节系统。
本实施例中，第一连接管9、第二连接管8要保证其末端靠近第一培养液储罐12与第二培养液储罐14的底部。
本实施例中，内培养罐4上还设有用于与第一气压调节系统相配合、控制内培养罐4内气压的第三气压调节系统；外培养罐5上还设有用于与第二气压调节系统相配合、控制外培养罐5内气压的第四气压调节系统。
本实施例中，第一气压调节系统包括连接端口一201、空气过滤器一101、泵一1501及用于依据罐内气压控制泵一1501开启或关闭的控制器一1601，空气过滤器一101通过连接端口一201与内培养罐4连接，泵一1501与空气过滤器一101连接；第二气压调节系统包括连接端口二202、空气过滤器二102、泵二1502及用于依据罐内气压控制泵二1502开启或关闭的控制器二1602，空气过滤器二102通过连接端口二202与外培养罐5连接，泵二1502与空气过滤器二102连接；第三气压调节系统包括连接端口三203、空气过滤器三103与排气阀三1703，空气过滤器三103通过连接端口三203与内培养罐4连接，排气阀三1703位于空气过滤器三103的进气端；第四气压调节系统包括连接端口四204、空气过滤器四104与排气阀四1704，空气过滤器四104通过连接端口四204与外培养罐5连接，排气阀四1704位于空气过滤器四104的进气端。
本实施例中，外培养罐5与内培养罐4的顶部为带盖子的敞口结构。外培养罐5与内培养罐4的顶部平齐，其二者的盖子为一体结构，即一个一体盖20可以实现外培养罐5与内培养罐4的密封。第三气压调节系统的连接端口2设于盖子的顶部，第四气压调节系统的连接端口2设于外培养罐5的中上部，高于环形培养架7的顶部。第一气压调节系统与第二气压调节系统的连接端口2分别位于内培养罐4与外培养罐5的侧面。
本实施例中，第一培养液储罐12与第二培养液储罐14上分别设有密封盖一11与密封盖二13，密封盖一11与密封盖二13的存在便于更换培养液，密封盖一11与密封盖二13上开有可供第一连接管9与第二连接管8通过的孔。
本实施例中，外培养罐5的底部设有桨叶搅拌装置10，以便于进入外培养罐5内的培养液在离心力的作用下与环形培养架7接触。桨叶搅拌装置10以第一连接管9为转轴，驱动方式为常规驱动方式。
本实施例中，内培养罐4的底部呈倒锥形，第一连接管9设于倒锥形的尖部，第一连接管9与内培养罐4连接处设有滤网；第二连接管8设于外培养罐5的底部，第二连接管8与外培养罐5连接处设有滤网。
本实施例中，圆形培养架6包括多块圆形隔片和用于将圆形隔片固定的支柱，环形培养架7包括多层块环形隔片和用于将圆形隔片固定的支柱，每块圆形隔片和环形隔片底部均设有用于防止培养组织从隔片上掉落的生物滤膜。圆形培养架6各层间距为5.0-8.0cm；环形培养架各层间距为5.0-8.0cm。
本实施例中，上述番石榴次生代谢产物培养用装置还包括有辅助装置，其包括加热装置，用以提供培养液的温度控制；光照装置，用以保证培养时的光照；co2输入装置，可与泵进气口相连，以调整通入培养罐内的空气组分，使培养组织生长更加健壮；传感探针，可实时监测培养液中的ph及各种成分的变化，以便于更好的控制培养环境。
本实施例中装置的尺寸可根据实际需求改变，此处给出一组尺寸数据如下：内培养罐的主体直径为20cm，装置主体高度(含椎体部分)为30cm；外培养罐主体直径为35cm，装置主体高度为60cm；培养储液罐罐体主体直径为35cm，装置主体高度为40cm；各连接装置口径均φ25mm；装置中的搅拌装置直径18cm。
本实施例还提供一种上述番石榴次生代谢产物培养用装置的应用，将装置用于同时培养番石榴丛生芽和番石榴愈伤组织以获得番石榴次生代谢产物，包括以下步骤：
(1)扩增培养：向第一培养液储罐12与第二培养液储罐14中加入培养液，再对装置进行高温蒸汽灭菌处理；将番石榴顶芽及相连的1-5节茎段接种到圆形培养架6上，同时将番石榴顶芽接种到环形培养架7上，通过第一气压调节系统与第二气压调节系统控制培养液浸没圆形培养架6与环形培养架7的时间进行扩增培养，圆形培养架6上得到番石榴丛生芽，环形培养架7上得到番石榴愈伤组织；
(2)次生代谢产物生成及诱导：更换第一培养液储罐12与第二培养液储罐14中的培养液，通过第一气压调节系统与第二气压调节系统控制培养液浸没圆形培养架6与环形培养架7的时间进行培养得到次生代谢产物；
(3)次生代谢产物的收集：收集第一培养液储罐12与第二培养液储罐14中的培养液，从培养液中提取次生代谢产物。
本实施例的应用中，步骤(1)中，番石榴顶芽及附近茎段接种到圆形培养架6前用75％酒精浸泡30s，再以0.1％升汞处理8min，最后以无菌水冲洗4次，并控制接种量为100个，分开接种4层，每层25个；番石榴顶芽接种到环形培养架7前用50％酒精浸泡1min，再以0.1％升汞处理8min，最后以无菌水冲洗4次，并控制接种量为120个，分开接种4层，每层30个。
第一培养液储罐12中加入的培养液的配方为：ms+蔗糖20g+0.4mg/lnaa，培养液的ph为5.8，培养液与圆形培养架6的浸没频率为5min/6h，内培养罐4内的培养条件为：光照强度2000lux，光照时间12h/d，培养温度25±0.5℃，培养时间12d。
第二培养液储罐14中加入的培养液的配方为：ms+蔗糖30g+0.5mg/lnaa，培养液的ph为5.8，培养液与圆形培养架6的浸没频率为4min/4h，内培养罐4内的培养条件为：光照强度2200lux，光照时间12h/d，培养温度25±0.5℃，培养时间10d。
本实施例的应用中，步骤(2)中，第一培养液储罐12中加入的培养液的配方为：ms+5.0mg/l6-ba+蔗糖30g+0.5mg/lnaa，培养液的ph为5.8，培养液与圆形培养架6的浸没频率为12min/2h，内培养罐4内的培养条件为：光照强度2000lux，光照时间8h/d，培养温度25±1℃，培养时间60d。
第二培养液储罐14中加入的培养液的配方为：ms+7.0mg/l6-ba+蔗糖30g+0.5mg/lnaa，培养液的ph为5.8，培养液与圆形培养架6的浸没频率为8min/2h，内培养罐4内的培养条件为：光照强度2200lux，光照时间8h/d，培养温度25±1℃，培养时间45d。
本实施例的应用中，在步骤(3)番石榴次生代谢产物的提取过程中，将番石榴丛生芽或番石榴愈伤组织取出后，同时将培养液进行回收，以制备型薄层色谱进行分离纯化，结果表明，最终从培养液中分离得到不同的次生代谢产物。