本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒的试剂盒及方法。
背景技术：
流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。甲型流感病毒根据h和n抗原不同，又分为许多亚型，其中h1n1、h2n2、h3n2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。自从1968年首次出现以来，甲型h3n2流感病毒一直是主要的流感病毒传播亚型。
流感是一种以高热、肌痛、头痛、咽喉痛和咳嗽为特征的呼吸系统疾病，一般来说，流感具有自限性，但可能会危及包括幼儿、孕妇、老年人等免疫力低下人群的生命。流感疫苗根据流行株每年更新一次，如果在发病后24-48小时内给予抗病毒药物治疗，可有效对抗流感。因此，早期准确诊断流感对于及时干预治疗以及控制疾病传播起着关键作用。流感和其他呼吸道感染的临床症状非常相似，因此通过临床表现很难区分，只有通过实验室诊断才能鉴别。流感病毒的诊断方法包括病毒分离培养、抗原/抗体检测和分子生物学方法如逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)。病毒分离培养耗时较长，需要几天到几周的时间才能得到结果，在流感流行期间不适用。抗原/抗体检测操作复杂，在感染早期敏感性不高。rt-pcr有快速、灵敏和特异等优点，但需要昂贵的实验设备和经过培训的实验室人员，其很难在基层医疗单位使用。
随着分子生物学的发展，许多新的分子诊断技术也被开发出来。2000年报道了一种新的核酸扩增方法—环介导等温扩增(lamp)，其原理是使用具有链置换活性的dna聚合酶和一组专门设计的引物在恒温条件下快速高效地扩增靶dna。与传统的检测方法相比，lamp的4个引物是根据靶序列的6个不同区域设计的，具有高度特异性，一旦有引物不匹配将导致反应不会发生。另外，lamp检测比pcr灵敏度高10-100倍，可以检测10拷贝甚至更少的模板。与传统的pcr相比，lamp更快捷，不需要反复的升温降温过程。更重要的是，lamp反应成本低廉，操作简单，仅需要水浴锅等简单设备就能完成反应。在反应体系中加入逆转录酶即可完成逆转录环介导等温扩增反应(rt-lamp)，可用于检测rna病毒。rt-lamp方法目前已成功应用于检测各种rna病毒，包括登革病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒等。rt-lamp扩增结果可以通过使用染料直接查看，从而缩短检测时间。目前针对甲型h3n2流感病毒尚缺乏快速、准确、操作简单、成本低廉的，同时满足基层医疗单位需求的检测方法。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中甲型h3n2流感病毒检测速度慢、成本高以及操作复杂的技术问题，目的在于提供一种环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒的试剂盒，以满足基层医疗单位的检测需求。
本发明的环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒的试剂盒包括引物组，所述引物组由seqidno:1所示的上游外部引物f3、seqidno:2所示的下游外部引物b3、seqidno:3所示的上游内部引物fip和seqidno:4所示的下游内部引物bip组成。
具体地，上游外部引物f3:5'-catcatgcagtgccaaac-3'；
下游外部引物b3:5'-acaaaaaggtcccattcctt-3'；
上游内部引物fip:
5'-aactctgaaccagctcagtagcggaacgctagtgaaaacaatc-3'；
下游内部引物bip:
5'-cgacagtcctcaccgaatccagccatcacaatgagggt-3'。
所述试剂盒还包括环介导等温扩增反应试剂和指示剂。
所述试剂盒还包括甲型h3n2流感病毒阳性质控标准品和/或作为阴性对照的无核糖核酸酶的去离子水。
所述环介导等温扩增反应试剂包括：bst3.0dna聚合酶(m0374s，纽英伦生物技术公司)、逆转录酶(ep0752，赛默飞世尔科技公司)和10mmdntp混合物(a610056，生工生物)。
所述指示剂为伊万绿色荧光染料(evagreen荧光试剂)、钙黄绿素或羟基萘酚蓝指示剂hnb金属离子指示剂，优选hnb，浓度优选为120μm。
可通过颜色变化观察反应终点。在反应产物中加入evagreen荧光试剂，在紫外灯下观察颜色变化，绿色荧光为阳性，无绿色荧光为阴性；或在反应结束后加入钙黄绿素和mncl2，肉眼观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。
hnb是一种金属离子指示剂，其颜色随溶液ph变化而改变，lamp反应过程中mg2+与lamp反应产物焦磷酸镁结合产生大量沉淀，溶液中mg2+浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为蓝色。
hnb与evagreen荧光试剂相比，不会受引物二聚体影响而产生假阳性，且不会对反应体系形成干扰，可直接添加在反应体系中，反正结束后直接肉眼观察颜色变化，不需要打开反应管，降低了污染的可能。
所述外引物f3浓度为0.2μm、外引物b3浓度为0.2μm、内引物fip浓度为1.6μm、内引物bip浓度为1.6μm。
上述检测甲型h3n2流感病毒试剂盒，所述阳性质控标准品为甲型h3n2流感病毒rna片段，其构建方法是合成甲型h3n2流感病毒的dna基因，通过体外转录得到大量的甲型h3n2流感病毒rna片段。
本发明的另一目的在于提供一种利用环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒的方法，该方法包括如下步骤：
s1，提取样本rna；
s2，将样本rna与引物组、环介导等温扩增反应试剂和指示剂混合得到混合物；
s3，混合物置于65℃恒温水浴中反应30min，85℃反应5min灭活bst3.0dna聚合酶。
s4，反应结束后观察颜色变化，以判断样本里是否具有甲型h3n2流感病毒。
在步骤s3中，混合物先短暂离心再置于65℃恒温水浴中反应30min。
本发明的积极进步效果在于：本发明针对甲型h3n2流感病毒基因的6个区域设计4条特异性引物，扩增产物具有高度的特异性。本发明在恒温条件下反应，不需要昂贵的温度循环仪器，仅需要水浴锅等恒温设备，大大降低了检测成本。本发明反应时间仅需要35min，提高了临床上对甲型h3n2流感病毒感染的响应时间，更好的指导患者治疗。本发明仅需要观察颜色变化判断反应结果，不需要打开反应管，避免了交叉污染。本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高等特点，检测h3n2流感病毒方便快捷、价格低廉，适用于基层医疗单位推广使用。
附图说明
图1为实施例1中环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒的试剂盒应用于临床样本时的检测结果照片；
图2为本发明的中环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒试剂盒的灵敏性检测结果照片；
图3为本发明的环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒试剂盒的特异性检测结果照片；
其中，1为甲型h1n1流感病毒；2为乙型流感病毒；3为副流感病毒3；4为呼吸道合胞病毒。
具体实施方式
实施例1环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒试剂盒的应用
1)样本采集
采集患儿呼吸道鼻咽拭子标本，标本置于病毒采样液中保存。
2)采用takaraviralrna提取试剂盒(9766)提取样本rna：
取200μl呼吸道标本置于1.5ml离心管中，加入200μlbuffervgb、20μlproteinasek和1μlcarrierrna，混匀于56℃水浴10min，向离心管中加入200μl无水乙醇，充分混匀。将spincolumn置于collectiontube上，将混合溶液移至spincolumn中，12000rpm离心2min，弃滤液。将500μlbufferrwa加入spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。将700μlbufferrwb加入spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。重复将700μlbufferrwb加入spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。将spincolumn置于collectiontube上，12000rpm离心2min。将spincolumn置于新的1.5mlrnasefreecollectiontube上，在spincolumn膜中央处加入30μlrnasefreedh2o，室温静置5min，12000rpm离心2min洗脱rna。
3)lamp检测：
将表1所示的newenglandbiolabsbst3.0dnapolymerase(m0374s)试剂盒的成分、thermoscientifimaxim逆转录酶(ep0752)、生工生物10mmdntpmixture(a610056)和麦克林hnb指示剂(h810857)配置成lamp反应体系，具体组分的浓度见表1。
表1lamp反应体系组成
将反应管置于65℃恒温水浴锅中反应30min，85℃反应5min灭活bst3.0聚合酶。反应结束后观察颜色变化，lamp反应过程中mg2+与lamp反应产物焦磷酸镁结合产生大量沉淀，溶液中mg2+浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为蓝色，因此紫色为阴性，蓝色为阳性，结果见图1所示。
实施例2环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒试剂盒灵敏度分析
1)样本处理：甲型h3n2流感病毒rna采用takarainvitrot7kit试剂盒(6140)进行体外转录，具体操作如下：通过华大基因公司合成含有t7启动子的甲型h3n2流感病毒的dna基因片段，配置20μl反应体系：10倍的transcriptionbuffer2μl，atp2μl，gtp2μl，ctp2μl，utp2μl，rnaseinhibitor0.5μl，t7rnapolymerase2μl，rnasefreedh2o2.5μl，lineartemplatedna5μl。将混合液轻微离心，42℃反应1.5h。
使用分光光度计测定rna浓度，通过分子量计算rna模板拷贝数为2.2×108copies/μl，10倍梯度稀释至101，每个梯度取2μl作为模板，拷贝数为108～101copies/μl。
2)取9个0.5ml离心管，分别标记为108～101、阴性对照管；配置25μl反应体系，各管中依次加入以下成分，其浓度如下：
反应混合液：10倍稀释的isothermalamplificationbufferii、6mmmgso4、1.4mmdntp、320u/mlbst3.0dna聚合酶、4u/μl逆转录酶、120μmhnb。
引物：f30.2μm、b30.2μm、fip1.6μm、bip1.6μm。
加样：离心管中分别加入108～101copies/μl的甲型h3n2流感病毒rna及rnase-freewater2μl。
lamp反应：短暂离心后将反应管置于65℃恒温水浴锅中反应30min，85℃反应5min灭活bst3.0聚合酶。反应结束后观察颜色变化，紫色为阴性，蓝色为阳性。
检测结果如图2所示，可见该试剂盒检测的灵敏度达到了103copies/μl。
实施例3环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒试剂盒实时特异性分析
1)样本处理：采用takaraviralrna提取试剂盒(9766)提取呼吸道常见病毒：甲型流感病毒h1n1、乙型流感病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒的rna，具体步骤如下：取200μl病毒液置于1.5ml离心管中，加入200μlbuffervgb、20μlproteinasek和1μlcarrierrna，混匀于56℃水浴10min，向离心管中加入200ul无水乙醇，充分混匀。将spincolumn置于collectiontube上，将混合溶液移至spincolumn中，12000rpm离心2min，弃滤液。将500μlbufferrwa加入spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。将700μlbufferrwb加入spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。重复将700μlbufferrwb加入spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。将spincolumn置于collectiontube上，12000rpm离心2min。将spincolumn置于新的1.5mlrnasefreecollectiontube上，在spincolumn膜中央处加入30μlrnasefreedh2o，室温静置5min，12000rpm离心2min洗脱rna。将以上几种病毒rna及甲型h3n2流感病毒rna分别作为反应模板。
2)取6个0.5ml离心管，分别标记为甲型h1n1流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、甲型h3n2流感病毒、阴性对照管；配置25μl反应体系，各管中依次加入以下成分，其浓度如下：
反应混合液：10倍稀释的isothermalamplificationbufferii、6mmmgso4、1.4mmdntp、320u/mlbst3.0dna聚合酶、4u/μl逆转录酶、120μmhnb。
引物：f30.2μm、b30.2μm、fip1.6μm、bip1.6μm。
加样：离心管中分别加入甲型h1n1流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、甲型h3n2流感病毒的rna及rnase-freewater各2μl。
lamp反应：短暂离心后将反应管置于65℃恒温水浴锅中反应30min，85℃反应5min灭活bst3.0聚合酶。反应结束后观察颜色变化，紫色为阴性，蓝色为阳性。
检测结果如图3所示，可见该试剂盒检测只有甲型h3n2rna作为模板时产物呈蓝色，其余呼吸道病毒及阴性对照均呈紫色，表明本试剂盒具有较好的特异性。
序列表
<110>上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心
<120>环介导等温扩增检测甲型h3n2流感病毒的试剂盒及方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>甲型h3n2流感病毒(influenzaavirush3n2)
<400>1
catcatgcagtgccaaac18
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>甲型h3n2流感病毒(influenzaavirush3n2)
<400>2
acaaaaaggtcccattcctt20
<210>3
<211>43
<212>dna
<213>甲型h3n2流感病毒(influenzaavirush3n2)
<400>3
aactctgaaccagctcagtagcggaacgctagtgaaaacaatc43
<210>4
<211>38
<212>dna
<213>甲型h3n2流感病毒(influenzaavirush3n2)
<400>4
cgacagtcctcaccgaatccagccatcacaatgagggt38