枯草芽孢杆菌在土壤解磷和纤维素降解方面的应用的制作方法

本发明涉及微生物农药领域，更具体地说是涉及到枯草芽孢杆菌在土壤解磷和纤维素降解方面的应用。
背景技术：
：磷元素是植物生长的必需营养元素之一，在土壤中极易被固定而使其有效利用率降低。利用解磷微生物将土壤中植物难以吸收的磷转化为易吸收利用的形态，是当前提高土壤中磷元素利用率的一个重要途径。此外，开发利用沿海滩涂等盐渍化土壤以及解决因为连作而造成的土壤板结是我国农业生产中十分迫切和重要的任务。利用具有解磷作用的微生物，不仅可以有效提高土壤中磷元素的利用，而且可以将难溶磷酸盐进行转化，降低盐渍化土壤的盐度、缓解土壤板结等问题，为改善土壤环境、提高土壤营养提供了合适的解决方案。木质纤维素是植物光合作用的主要产物，是地球上数量最大的可再生能源物质。纤维素在农作物中的含量很高，可达40％-50％。然而，植物细胞壁中半纤维素和木质素的复杂结构及其对纤维素的包裹作用限制了秸秆资源在畜牧业生产中的大量应用。目前，在工业和饲料生产中实际使用的秸秆大约占总量的30％，其余大部分都被直接燃烧或丢弃，造成了很大的资源浪费和环境污染。当今秸秆还田是世界普遍重视的一项培肥地力的增产措施，秸秆中含有大量的c、n、p、k以及各种微量元素，秸秆还田把作物吸收的大部分营养元素归还土壤，可有效减少化肥的使用量。因此，促进秸秆中纤维成分的降解，合理地利用秸秆资源，对于农业、畜牧业生产和经济发展具有非常重要的意义。而利用微生物降解纤维素现已成为一种高效、经济、安全、无污染的方法。技术实现要素：本发明的目的是提供枯草芽孢杆菌在土壤解磷和纤维素降解方面的应用，所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.2357，保藏日期为2008年1月24日。本发明的目的采用如下技术方案实现。本发明提供枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在土壤解磷和纤维素降解方面的应用。在本发明中，采用枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1培养得到的发酵液，或在所述发酵液中加入载体或载体与助剂的混合物后得到的固态菌剂对土壤进行解磷和纤维素降解。在本发明中，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1采用如下培养基培养获得发酵液：花生饼粉14-16g/l，玉米淀粉19-21g/l，葡萄糖9-11g/l，caco31-3g/l，(nh4)2so40.4-0.6g/l，mgso4·7h2o0.1-0.3g/l，泡敌0.08-0.12g/l，ph7.0-7.5。在本发明中，将含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的溶液浇灌土壤对土壤进行解磷和纤维素降解。优选的技术方案中，在采用含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的溶液浇灌土壤前，在土壤中埋入秸秆。优选的技术方案中，所述含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的溶液中菌含量至少为1×108cfu/ml。为了寻找具有解磷作用和降解土壤中纤维素能力的微生物，申请人进行了大量的筛选。发现所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1具显著的解磷和降解纤维素作用。申请人还发现枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1能耐一定的盐度，在2.5％的氯化钠溶液中也能存活。因此，该枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1菌剂可以在盐渍化土壤中使用。附图说明图1平板溶菌圈法检测枯草芽孢杆菌xf-1解磷效果的照片。具体实施方式实施例1枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1菌剂的制备本实施例介绍了枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1菌剂的制备。1、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1液体制剂的制备枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的活化：从枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的斜面中，用无菌接种针挑取部分菌苔至lb摇瓶中(250ml摇瓶中lb液体培养基装液量50ml)，在30℃、150r/min下培养24h后，lb培养基变浑浊。取菌液至lb固体培养基中划线培养24h-36h，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在lb固体培养基上生长良好，菌落白色或灰白色，边缘圆滑，表面不规则，不透明。种子液的制备：500ml种子摇瓶中lb液态培养基的装液量为150ml。挑取lb固体培养基上的单菌落接种于种子摇瓶中，将种子摇瓶在30℃、150r/min下培养24h，得到种子液。发酵培养基配方(g/l)为：花生饼粉15g/l，玉米淀粉20g/l，葡萄糖10g/l，caco32g/l，(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，泡敌0.1g/l，ph7.0-7.5。将发酵培养基置于发酵罐中，灭菌。将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的种子液，接入发酵罐中，培养条件为：通气比为1：1、搅拌转速为100-150r/min、罐压0.01mpa、培养温度30℃、培养时间为48h，得到活菌含量为10×108cfu/ml的发酵液、其中芽孢含量为95％。该发酵液可以直接作为液态菌剂。在发酵罐培养结束时，保证液态菌剂中活菌含量为5-1000×108cfu/ml且其中芽孢率不低于95％的前提下，可以对发酵培养基和发酵培养条件进行调整。2、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1固体制剂的制备在得到上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1液态菌剂的情况下，制备枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的固体制剂。向实施例1中制得的液态菌剂(活菌含量为10×108cfu/ml且其中芽孢率为95％)中加入1000目的硅藻土熟料粉，液态菌剂与硅藻土熟料粉的重量比为100:20。将该液固混合物搅拌30分钟后，利用输料泵将料液输入离心式喷雾塔中干燥后，得到水含量为5.6％(w/w)，活菌含量为48×108cfu/g的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1固态菌剂ⅰ。其中离心式喷雾塔中的干燥条件为：进风口温度为180-200℃，出风口温度为75-85℃。液态菌剂也可以先用陶瓷膜浓缩过滤，在得到的浓缩液中加入浓缩液重量3％的1000目的硅藻土熟料粉，混合均匀后，在80℃条件下进行真空干燥，得到水含量为6％(w/w)、活菌含量为115×108cfu/g的固体菌剂ⅱ。为了制备枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1含量为20×108cfu/g的固态菌剂，可以在固体菌剂ⅰ或ⅱ中，添加其质量5％(w/w)的十二烷基苯磺酸钠和适量1000目的硅藻土熟料粉，混合均匀后气流粉碎即可。实施例2枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的耐盐性基础培养基：葡萄糖20g/l，酵母浸提液5g/l，ph为7-7.5。通过在基础培养基中添加不同量的氯化钠，分别制备氯化钠终浓度为0g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l和30g/l的液体培养基。摇瓶培养条件：250ml摇瓶中液体培养基的装液量为50ml。接种量：1ml种子液/个摇瓶。在30℃、150r/min的摇床上培养72h，每12h取样测定活菌含量。表1枯草芽孢杆菌xf-1在不同盐度下培养的活菌含量(108cfu/ml)由表1可知，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1可在25g/l的盐浓度下正常生长，耐盐度较高。盐碱地在利用过程中，可以分为轻盐碱地、中度盐碱地和重盐碱地。轻盐碱地是盐碱地的出苗率在70％-80％，它含盐量在千分之三以下，ph值为：7.1-8.5；重盐碱地是指它的含盐量超过千分之六，出苗率低于50％，ph值为：9.5以上；中间就是中度盐碱地，ph值为：8.5-9.5。由此可见，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1可以用在轻盐碱地、中度盐碱地和重盐碱地上，用于将土壤中难溶磷酸盐转化为植物易吸收的可溶性磷、将埋于土壤中的秸秆降解，以增加土壤营养。实施例3枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的解磷效果1、平板溶菌圈法测定枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的解磷效果解磷能力是表征微生物解磷作用的重要指标，一般可采用定性法和定量法两种方法。定性法一般指平板溶菌圈法。平板溶菌圈法：将溶磷菌株在含有难溶性磷酸盐的固体平板培养基上培养，测定菌落产生的透明圈大小。采用溶磷圈直径(d)和菌落生长直径(d)的比值(d/d)来表征解磷菌相对解磷能力的大小。平板溶菌圈法采用的培养基为蒙金娜无机培养基，组成如下：nacl0.3g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，mnso4·4h2o0.3g/l，kcl0.3g/l，(nh4)2so40.5g/l，feso4·7h2o0.03g/l，ca3(po4)25.0g/l，葡萄糖10g/l，酵母膏0.4g/l，琼脂粉15-20g/l，ph为7.0-7.5。上述固体平板培养基在121℃下灭菌30min，冷却至50℃左右时，在超净工作台上倒入灭菌过的培养皿中，冷却后备用。将活化后的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1接种在蒙金娜固体平板培养基中，30℃培养箱中培养48h左右后，观察透明圈大小，结果如图1。测量溶磷圈直径(d)和菌落生长直径(d)，计算比值(d/d)，结果如表2。表2定性法测定枯草芽孢杆菌xf-1的解磷效果菌落编号123456平均d(mm)13.514.612.515.514.615.314.33d(mm)4.55.26.65.24.24.55.03d/d3.002.811.892.983.483.402.85由表2中数据可知，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的解磷能力较强。2、土培法测定枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的解磷效果所谓土培法，也叫砂培法，就是通过接种解磷菌株到培养植物的土壤中，以不接种解磷菌为对照，通过测定土壤浸提液中有效磷的含量来评价解磷菌株的解磷能力。(1)枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在土壤培养中对解磷的效果选取连作板结、中等盐渍化的土壤，碾碎后过孔径为2mm的筛子，除去石块、根茎等杂物，混合均匀后，取200g装入三角烧瓶中，121℃下灭菌60min，再放入烘箱中烘干至恒重后冷却，备用。取30g上述无菌土壤于250ml无菌三角烧瓶中，再加入1×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1菌液70ml，3次重复。以不含菌的空白培养基添加至无菌土壤中作为对照，3次重复。将各三角烧瓶在30℃摇床上150rpm培养3天。从各三角烧瓶中取液体5ml于5000rpm下离心15min，取上清液用钼蓝比色法测定清液中的磷含量，再折算成土壤中有效磷含量。测定结果见表3。表3不同处理后土壤中有效磷的含量(mg/kg)重复123平均值加xf-1菌液215.13205.26224.98215.12对照46.2252.0258.3152.18由表3可知，加了枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的处理，测得的有效磷含量远高于对照，加了枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的处理中有效磷含量平均为215.12mg/kg，为对照的4.12倍。因此，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1具有很强的解磷能力。(2)枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在番茄盆栽中对解磷的效果番茄品种：新中蔬4号。番茄苗培育：番茄种子播种后，正常管理，待长到4～5片叶时用于以下实验。选取连作板结、中等盐渍化的土壤，碾碎后过孔径为2mm的筛子，除去石块、根茎等杂物，混合均匀，每500g土壤装一营养钵，共20钵。挑选高度、叶片数量以及长势差别不大的番茄苗，在清水中洗净根部土壤及杂物后移栽到营养钵中，每钵一株。取实施例1中制备的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1菌剂，用生理盐水稀释至1×108cfu/ml，均匀浇灌，每钵浇灌100ml，浇灌10钵。另外10钵用100ml清水浇灌作为对照。苗期日照、温度管理一样。移栽当天浇灌一次，隔6天再浇灌一次，第二次浇灌6天后，将番茄苗拔出，倒出每钵的土壤，混合均匀后烘干，取30g土壤于250ml三角烧瓶中，加入70ml无菌水及20颗无菌玻璃珠，在200rpm的摇床上震荡1h后，取液体5ml于5000rpm下离心15min，取上清液用钼蓝比色法测定清液中的磷含量，再折算成土壤中有效磷含量。测定结果见表4。表4不同处理后土壤中有效磷的含量(mg/kg)由表4可知，在培养番茄植株的营养钵中，加入枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1后，土壤中有效磷含量远高于对照(达到191mg/kg，为对照的4.63倍)，并且植株长势、茎秆粗细、叶片色泽明显优于对照。因此，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在实际植物种植中的解磷效果明显。实施例4枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1对纤维素的降解(1)枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1产纤维素酶和半纤维素酶的能力一般用菌株产纤维素酶和半纤维素酶的活力来表征菌株降解纤维素的能力。从枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的斜面中，用无菌接种针挑取部分菌苔至装有lb液体培养基的摇瓶中(250ml摇瓶中装液量为50ml)，在30℃、150r/min下培养24h后，lb培养基变浑浊。取上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1发酵液，按照接种量为10％分别接种至装有50ml产纤维素酶液体发酵培养基和产半纤维素酶液体发酵培养基的三角瓶(50ml/500ml摇瓶)中，30℃、150r/min下培养，每24h取样，进行活力测定。同时设置不接种的作为空白对照，每个实验3个重复。其中，纤维素酶活力测定方法按照gb20287-2006准则规定的3,5-二硝基水杨酸(dns)法。半纤维素酶活力测定方法按照ny/t1847-2010准则规定的3,5-二硝基水杨酸(dns)法。产纤维素酶液体发酵培养基含有：羧甲基纤维素钠2.0g/l、蛋白胨2.0g/l、酵母粉1.0g/l、nacl1.0g/l、kh2po40.1g/l和mgso40.02g/l。产半纤维素酶液体发酵培养基含有：麸皮5.0g/l、蛋白胨0.3g/l、(nh4)2so40.3g/l、kh2po40.2g/l、mgso40.02g/l和nacl0.5g/l。发酵培养至第三天，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1发酵液的纤维素酶活力达到最高值154.36u/ml，半纤维素酶活力达到最高值354.85u/ml。(2)枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在摇瓶中对秸秆的降解能力秸秆培养基(g/l)含有：秸秆10g/l(长度在5mm以下)，蛋白胨3g/l，caco32g/l，(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，kh2po41g/l，naoh1g/l，ph7.0-7.5。将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1种子液5ml接种到装有50ml秸秆培养基的摇瓶(摇瓶体积250ml)中，在30℃、150r/min下振荡培养，以未加菌处理为对照；每个处理10个重复，分别培养6天、9天、12天，取样(每次每个处理3个摇瓶)测定秸秆量。通过如下公式计算秸秆降解能力：秸秆降解能力(％)＝(原秸秆质量(g)—发酵后培养基中秸秆烘干后质量(g))/原秸秆质量(g)×100。结果如表5。表5枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在摇瓶中对秸秆的降解能力由表5可知，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1具有很强的秸秆降解能力。在培养12天后，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在摇瓶中对秸秆的降解能力达到87.40％，是对照8.78％的9.95倍。(3)枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在番茄盆栽实验中对秸秆的降解能力和解磷作用番茄品种：新中蔬4号。番茄苗培育：番茄种子播种后，正常管理，待长到4～5片叶时用于以下实验。取菜园土，平铺后在太阳下暴晒至干，除去石块、根茎等杂物碾碎后过孔径为2mm的筛子。取1000g土与剪成3-4cm长的玉米秸秆10g(烘干至恒重后)混合均匀，装入一个营养钵中。采用该方法，在20个营养钵中装入土壤和玉米秸秆。挑选高度、叶片数量以及长势差别不大的番茄苗，在清水中洗净根部土壤及杂物后移栽到营养钵中，每钵一株。取实施例1中制备的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1菌剂，稀释至1×108cfu/ml，均匀浇灌，每钵浇灌500ml，浇灌10钵。以清水为对照，浇灌10钵。在温室中正常管理，以保证植株正常生长。移栽当天为第1天。分别于第15天、30天、45天各取3个营养钵，倒出土壤和秸秆，仔细将植株根系全部移出后，剩余土壤烘干或暴晒至干，碾碎后过孔径为2mm的筛子，取未通过筛的秸秆烘干至恒重。根据如下公式计算玉米秸秆降解能力：玉米秸秆降解能力(％)＝(原秸秆质量(g)—烘干秸秆质量(g))/原秸秆质量(g)×100。结果如表6。表6枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在盆栽实验中对秸秆的降解能力由表6可知，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在盆栽实验中具有很强的秸秆降解能力。在盆栽第45天，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1对秸秆的降解能力达到74.50％，比对照46.50％提高了28％，是对照的1.6倍。并且施用了枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1的番茄植株，长势、植株茎秆、叶片、高度、挂果量、挂果时间等明显优于对照，具有明显的肥效和促生长作用。同时按照实施例3的方案，在实验第45天，检测了本盆栽实验中，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1对土壤中有效磷含量的影响。结果见下表7。表7枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1处理后土壤中有效磷的含量(mg/kg)由表7可知，加入枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1后，土壤中有效磷含量远高于对照(为对照的3.1倍)，并且植株长势、茎秆粗细、叶片色泽明显优于对照。由此可见，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)xf-1在降解纤维素的同时，对土壤的解磷效果也很显著。当前第1页12