基于Pickering乳液聚合的分子印迹聚合物用于分离提纯皂角刺中槲皮素的方法与流程

本发明涉及一种分子印迹聚合物的制备方法及应用，特别涉及一种基于疏水修饰的羟基磷灰石粒子稳定的pickering乳液聚合制备分子印迹聚合物的方法及其在特异性吸附中药材粗提物中槲皮素的应用，具体涉及一种以疏水修饰的羟基磷灰石为稳定粒子，以4-乙烯基吡啶为功能单体，以槲皮素为模板分子，通过4-乙烯基吡啶在pickering乳液中的加热聚合制备分子印迹聚合物的方法；属于功能高分子制备和中药材活性成分分离提取领域。

背景技术：

皂角刺是豆科植物皂荚(gleditssinesis)的干燥棘刺，是皂角生物活性成分的主要来源。根据《中华人民共和国药典》(2015年版，第一部)，皂角刺具有消肿脱毒、排脓和杀虫的功效，可用于痈疽初起、脓成不溃的治疗，外治疥癣麻风。近年来又被证实具有抗癌、抗病毒、抗过敏、抗诱变、保护心脏等功效。目前从皂角刺中已分离出的有效活性成分主要包括三萜烯、甾醇、黄酮类、酚类和生物碱。皂角刺中的黄酮类化合物是天然的抗氧化剂，具有清除自由基的能力，具备抗癌作用。其中的槲皮素(quercetin)已被证实具有良好的祛痰、止咳和平喘作用，还可以降低血压、增强毛细管抵抗力、降低毛细管脆性、降血脂、扩张冠状动脉并增加其流量。可用于治疗慢性支气管炎，对冠心病及高血压患者有辅助治疗的作用。

目前，我国多地大力推进皂角的种植，但深加工行业相对比较落后，一般经简单炮制后作为饮片直接服用。对皂角刺活性成分的分离纯化，主要依靠石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等有机溶剂进行分类提取后，再通过柱层析的方法进行分离纯化。现有的方法工艺复杂，有机溶剂使用量大，成本较高。更重要的是，柱层析的方法虽然在实验室可得到纯净的目标产物，但是收率低且难以实现工业化的生产。

分子印迹技术用于制备对某一特定的物质具有特定选择性的聚合物材料的一种方法。其用于分离的基本原理是：将一定结构的亟待分离的目标分子作为模板分子，与功能单体相互作用后在一定条件下交联聚合，再除去模板分子后得到刚性聚合物。该聚合物具有与模板分子在功能基团、大小、形状、电荷分布等性质相互匹配的空穴，因此对模板分子具有特异的选择性和较高的吸附容量。

技术实现要素：

针对现有的皂角刺中活性成分槲皮素分离纯化工序复杂，需要大量有机溶剂且难以实现工业规模生产的难题，本发明的一个目的是在于提供了一种对槲皮素具有特异性识别结合的分子印迹微球的制备方法，所制备的分子印迹聚合物形貌均一，对槲皮素有明显的优于其他活性成分的吸附效果。

本发明的另一个目的是在于简化了传统分离方法的步骤，节省了大量有机溶剂的使用，该方法易于操作，步骤简单，成本较低，有利于实现皂角刺中活性成分槲皮素的提取分离的工业化大规模生产。

本发明的另一个目的是在于提供了一种所述的分子印迹聚合物在中药材活性成分分离提取方面的应用，以亟待分离的化合物为模板分子制备的分子印迹聚合物对中药材粗提液中的该组分具有很好的特异性吸附，可广泛应用在生药学、中药现代化领域里对中药材活性成分的选择性吸附提取。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于pickering乳液聚合的分子印迹聚合物用于分离提纯皂角刺中槲皮素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将羟基磷灰石粒子表面用硅烷偶联剂进行疏水修饰后，分散到水中，得到水相；

(2)将模板分子、聚合功能单体和交联剂溶于有机溶剂中，得到油相；

(3)将所述油相和所述水相混合，超声并震荡，得到pickering乳液；

(4)向所述pickering乳液中加入引发剂并加热使之发生聚合反应，得到聚合物微球；

(5)所述聚合物微球通过洗脱模板分子，即得分子印迹聚合物。

优选的，所述的羟基磷灰石粒子表面采用硅烷偶联剂kh-570进行疏水修饰。

进一步的，所述对羟基磷灰石粒子表面进行疏水修饰的具体过程为：将kh-570滴加到羟基磷灰石的甲苯溶液中，于110～130℃在氮气的保护下反应12～36h。

优选的，所述的水相中疏水羟基磷灰石的浓度为0.1～10mg/ml。

优选的，所述的模板分子根据分子印迹聚合物的应用目的而选择合适的化合物，优选槲皮素。

优选的，所述的聚合功能单体为4-乙烯基吡啶、2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸、丙烯酰胺中的一种或多种。

优选的，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、吡啶、乙腈、氯仿、丙酮、甲苯、四氢呋喃中的一种或多种。

优选的，所述的交联剂为二乙烯基苯。

优选的，所述的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈中的一种或多种。

较优选的方案，模板分子与功能单体、交联剂的摩尔比为1:(4～25)：(20～40)。

较优选的方案，所述的聚合反应的聚合温度为40～90℃，聚合时间为4～24h。

优选的，所述油相中4-乙烯基吡啶的浓度为0.1～1.0mg/ml；优选为0.2～0.6mg/ml；更优选为0.2～0.4mg/ml。

优选的，洗脱模板分子时采用的洗脱机为甲醇和冰醋酸按体积比9:1～5:5组成。

本发明采用的羟基磷灰石纳米粒子为常规的市售产品。

本发明还提供了一种分子印迹微球的应用，将其应用于皂角刺粗提物溶液中对某一特定活性成分的特异性吸附分离。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

1)本发明的技术方案选用羟基磷灰石作为制备pickering乳液稳定粒子的前体，羟基磷灰石表面含有大量羟基，过于亲水，难以用于稳定pickering乳液。但是羟基易于进行修饰，可用末端疏水的硅烷偶联剂简单地进行疏水修饰，以提高羟基磷灰石的疏水性。疏水修饰后的羟基磷灰石可在无需表面活性剂的条件下，用来制备稳定性良好的pickering乳液。

2)本发明的技术方案选用疏水的羟基磷灰石作为pickering乳液的稳定粒子，所制备的pickering乳液稳定性良好，因此所制备的表面分子印迹聚合物微球的形貌均匀，尺寸均一，为标准的微米级球形颗粒。

3)本发明的技术方案选用的羟基磷灰石是生物体骨骼的重要组成成分之一，生物相容性好，将其应用到中药材活性成分的分离当中，有利于保持活性成分的稳定性，有利于实现分子印迹技术在生药学、中药制药等领域的广泛应用。

4)本发明的技术方案可以根据不同的目标分子来设计合成含有特定印迹位点的分子印迹聚合物，因此所制备的分子印迹微球对该特定的目标分子具有特异性的吸附功能，从而实现对混合物中对该目标分子的分离和纯化，可在生物学、中药材活性成分提取等领域得到广泛的应用。

附图说明

图1是实施例1制备的槲皮素分子印迹聚合物微球mip的扫描电镜图。

图2是实施例1制备的槲皮素分子印迹聚合物微球mip的动力学吸附图。

图3是实施例1制备的槲皮素分子印迹聚合物微球mip的等温线吸附图。

图4是实施例1制备的槲皮素分子印迹聚合物微球mip的选择性吸附图。

图5是槲皮素印迹聚合物微球mip的循环使用性能测试图。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

称取0.5g羟基磷灰石，加入到含有15ml无水甲苯的三颈瓶中，超声波辅助分散30分钟。向该体系慢慢滴加0.3ml的kh-570，然后在氮气保护下110℃反应20h。冷却至室温后用甲苯通过离心洗去未反应的kh-570并将所得样品于60℃真空干燥24h，即得疏水羟基磷灰石粒子。

称取40mg疏水羟基磷灰石粒子，加入到10ml水中，超声分散30分钟，得到水相。称取20mg槲皮素，加入到4ml乙腈中，振荡使其充分溶解，再加入4-乙烯基吡啶(0.8ml)和二乙烯基苯(2.8ml)，振荡使充分溶解，此为油相。将水相和油相混合，大力振荡形成稳定的pickering乳液。向该乳液中加入20mg偶氮二异丁腈作为自由基引发剂。静置在70℃下聚合20h后，将产物用乙腈和去离子水洗涤干净，然后用洗脱剂(甲醇：冰醋酸＝1:1，v/v)除去模板分子槲皮素，得到有特异性识别位点的分子印迹聚合物mip。非印迹的聚合物nip在制备时不加入槲皮素，其他步骤完全相同。

(1)吸附动力学试验

称取10mg的mip于10ml的螺口瓶中，加入5ml浓度为5mmol/l的槲皮素溶液，在25℃下恒温振荡不同的时间，分别定为(5,10,20,30,40,50,60,70,80min)，吸附平衡后未被吸附的槲皮素浓度用hplc法测定，并计算平衡吸附量q(μmol/g)，得到动态吸附曲线。

(2)静态吸附试验

称取10mg的mip于10ml的螺口瓶中，分别加入5ml一系列浓度的槲皮素溶液，在25℃下恒温震荡60min，浓度控制在0.5-6μmol/g。达到吸附平衡后溶液中未被吸附的槲皮素浓度用hplc法测定，并计算平衡吸附量q(μmol/g)，得到静态吸附曲线。

(3)特异性吸附试验

称取10mg的mip于10ml的螺口瓶中，分别加入浓度为5μmol/g的槲皮素溶液、芦丁溶液、儿茶素溶液和香橙素溶液，在25℃下恒温震荡60min。达到吸附平衡后溶液中未被吸附的部分，其浓度用hplc法测定，并计算平衡吸附量q(μmol/g)，得到特异性吸附曲线。

(4)重复使用性能试验

称取10mg的mip于10ml的螺口瓶中，分别加入浓度为5μmol/g的槲皮素溶液，在25℃下恒温震荡60min。达到吸附平衡后溶液中未被吸附的部分，其浓度用hplc法测定，并计算平衡吸附量q(μmol/g)。将吸附后的材料用甲醇-乙酸的混合液进行洗脱，直至洗脱液中无槲皮素检出为止。将洗脱后的材料重复以上的吸附试验，并计算出每次的平衡吸附量。

图1表明了制得的槲皮素分子印迹聚合物mip的微观形貌为规则的球形，粒径分布均一，其平均直径约为22μm左右。

图2表明制得的槲皮素分子印迹聚合物微球可在40min内实现对溶液中槲皮素的快速吸附，40min后对槲皮素的吸附速率大幅度下降，并在60min后达到最终的吸附平衡。与传统的吸附材料相比，吸附效率大为提高。

图3是槲皮素印迹聚合物微球mip的静态吸附曲线。在槲皮素溶液浓度为5mmol/l时，mip的吸附容量达到最大值，为52.7μmol/g。

图4是槲皮素印迹聚合物微球的选择性吸附曲线，当选择结构与其相近的黄酮类活性成分芦丁、儿茶素和香橙素作为对照时，mip对槲皮素的平衡吸附容量要明显大于其他参比物质，表明该聚合物微球具有显著的特异性。

图5是槲皮素印迹聚合物微球mip的循环使用性能测试。首次使用时，其平衡吸附容量为52.7μmol/g。吸附后将其吸附的槲皮素洗脱掉，将洗脱后的材料继续应用到下一个循环的吸附测试中。在第五次使用时，其平衡吸附容量为50.3μmol/g，仅有5％的损耗。这表明所制备的印迹聚合物具备良好的重复使用的性能，可以循环使用。

实施例2

称取40mg疏水羟基磷灰石粒子，加入到10ml水中，超声分散30分钟，得到水相。称取20mg槲皮素，加入到4ml丙酮中，振荡使其充分溶解，再加入2-乙烯基吡啶(1.0ml)和二乙烯基苯(2.8ml)，振荡使充分溶解，此为油相。将水相和油相混合，大力振荡形成稳定的pickering乳液。向该乳液中加入25mg偶氮二异丁腈作为自由基引发剂。静置在70℃下聚合20h后，将产物用乙腈和去离子水洗涤干净，然后用洗脱剂(甲醇：冰醋酸＝1:1，v/v)除去模板分子槲皮素，得到有特异性识别位点的分子印迹聚合物mip。非印迹的聚合物nip在制备时不加入槲皮素，其他步骤完全相同。吸附试验同实施例1，吸附结果表明该分子印迹聚合物对目标分子槲皮素具有显著的特异性吸附，且吸附效率高。

实施例3

称取30mg疏水羟基磷灰石粒子，加入到10ml水中，超声分散30分钟，得到水相。称取25mg槲皮素，加入到4ml氯仿中，振荡使其充分溶解，再加入4-乙烯基吡啶(1.2ml)和二乙烯基苯(3.0ml)，振荡使充分溶解，此为油相。将水相和油相混合，大力振荡形成稳定的pickering乳液。向该乳液中加入20mg偶氮二异庚腈作为自由基引发剂。静置在80℃下聚合18h后，将产物用乙腈和去离子水洗涤干净，然后用洗脱剂(甲醇：冰醋酸＝2:1，v/v)除去模板分子槲皮素，得到有特异性识别位点的分子印迹聚合物mip。非印迹的聚合物nip在制备时不加入槲皮素，其他步骤完全相同。吸附试验同实施例1，吸附结果表明该分子印迹聚合物对目标分子槲皮素具有显著的特异性吸附。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方案，但本发明保护范围并不局限于此，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同交换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。