本发明涉及植物提取
技术领域：
，尤其涉及6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮及其提取方法和应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是一种严重危害人类健康和生命的疾病，也是世界医学界的重大难题。2008年，全球恶性肿瘤患者有1270万人，死亡人数高达760万。世界范围内因恶性肿瘤死亡的人数，比艾滋病、疟疾和结核病加起来还要多。如果不采取有效措施，预计到2030年，每年将出现2600万新增恶性肿瘤病例，死亡人数将达到1700万。我国每年恶性肿瘤的发病人数约为200万，死亡人数超过140万，并有逐年上升的趋势。攻克恶性肿瘤难关已成为医药工作者和化学工作者当务之急的任务。近年来，中药及其有效成分抗肿瘤研究工作取得了一系列的成果，从植物中得到的抗肿瘤成分主要包括生物碱类、萜类、黄酮类、植物多糖类、多酚类、有机酸类和木脂素类等化合物。当今国际上常用的抗肿瘤植物药和辅助化疗的中药主要包括紫杉醇、喜树碱、长春花碱、白藜芦醇、鬼臼毒素等。这些植物药基本上已用于所有种类的癌症的治疗或辅助治疗，如紫杉醇已用于喉癌、卵巢癌，黄芪等用于肝癌、五加多糖用于胃癌，魔芋用于腹水肿瘤，山豆根等用于治疗消化道癌等。目前，世界上对抗肿瘤药用植物的研究工作已经涉及300余科植物，从植物中筛选出的抗癌活性成分已达617万种。美国国立癌症研究所自1957年以来，每年筛选出1500～5000种植物提取物的抗癌活性成分。中国的中医药具有2500多年的历史，它们在治疗各种疑难杂症中显现出了神奇的疗效。但我国对植物有效成分的提取分离工作开展较晚，目前约对3000余种(占我国植物总数的10％左右)植物进行了有效成分的研究工作，发现不足300种植物有效成分具有抗癌活性，研究较多的有200余种。因此，我们必须加大对中医药的研究力度和深度，力争从植物中获得毒性低而抗肿瘤作用显著的新衍生物。单叶蔓荆(vitexrotundifolia)为牡荆属植物。目前，国内外尚未出现对单叶蔓荆的化学成分和抗肿瘤活性的研究。技术实现要素：本发明的目的在于提供6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮及其提取方法和应用，本发明从单叶蔓荆中提取出的6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮能够制备抗胃癌或抗肝癌药物。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮，具有式i所示结构，本发明提供了一种从单叶蔓荆中提取6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮的方法，包含如下步骤：(1)将单叶蔓荆粉碎，得到单叶蔓荆颗粒；(2)对所得单叶蔓荆颗粒进行醇提，得到流浸膏；(3)将所得流浸膏分散于水中，使用乙酸乙酯对其进行萃取，得到乙酸乙酯层；(4)将所得乙酸乙酯层进行浓缩处理，得到乙酸乙酯浓缩物；(5)以石油醚和丙酮的混合物为梯度洗脱剂，对所述乙酸乙酯浓缩物进行硅胶柱层析，以每梯度洗脱剂体积的1/2为一流份，收集前9个流份；使用所述梯度洗脱剂进行梯度洗脱时，石油醚和丙酮的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1和0∶1；每一梯度的梯度洗脱剂和乙酸乙酯浓缩物的用量比独立地为2000ml∶60～70g；(6)将收集的前9个流份进行浓缩，得到粗提产物；(7)以石油醚和乙酸乙酯的混合物为梯度洗脱剂，对所得粗提产物进行硅胶柱层析，以每梯度洗脱剂体积的5/8为一流份，收集第8～9流份；使用所述梯度洗脱剂进行梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1和1∶1；每一梯度的梯度洗脱剂和粗提产物的用量比独立地为800ml∶6～9g；(8)将收集的第8～9流份进行浓缩，得到6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮。优选的，所述步骤(1)中粉碎得到的单叶蔓荆颗粒的粒径≥80目。优选的，所述步骤(2)中醇提顺次包含第一醇提、第二醇提和第三醇提；所述第一醇提、第二醇提和第三醇提过程独立地采用回流法进行提取，使用的乙醇溶液的质量浓度独立地为80～90％。优选的，所述第一醇提过程乙醇溶液的用量为单叶蔓荆颗粒质量的8～15倍，提取时间为1～2小时；所述第二醇提过程乙醇溶液的用量为单叶蔓荆颗粒质量的7～11倍，提取时间为0.5～1.5小时；所述第三醇提过程乙醇溶液的用量为单叶蔓荆颗粒质量的5～9倍，提取时间为0.5～1.5小时。优选的，所述步骤(5)使用的硅胶柱的规格为1300g，100～200mesh，φ70mm×l1200mm。优选的，所述步骤(7)使用的硅胶柱的规格为200g，100～200mesh，φ40mm×l800mm。本发明还提供了所述6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮或者所述提取方法提取的6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮在制备抗胃癌或抗肝癌药物中的应用。本发明提供了从单叶蔓荆中提取出的6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮，具有式i所示结构。本发明从单叶蔓荆中提取6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮的方法，包含如下步骤：(1)将单叶蔓荆粉碎，得到单叶蔓荆颗粒；(2)对所得单叶蔓荆颗粒进行醇提，得到流浸膏；(3)将所得流浸膏分散于水中，使用乙酸乙酯对其进行萃取，得到乙酸乙酯层；(4)将所得乙酸乙酯层进行浓缩处理，得到乙酸乙酯浓缩物；(5)以石油醚和丙酮的混合物为梯度洗脱剂，对所述乙酸乙酯浓缩物进行硅胶柱层析，以每梯度洗脱剂体积的1/2为一流份，收集前9个流份；使用所述梯度洗脱剂进行梯度洗脱时，石油醚和丙酮的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1和0∶1；每一梯度的梯度洗脱剂和乙酸乙酯浓缩物的用量比独立地为2000ml∶60～70g；(6)将收集的前9个流份进行浓缩，得到粗提产物；(7)以石油醚和乙酸乙酯的混合物为梯度洗脱剂，对所得粗提产物进行硅胶柱层析，以每梯度洗脱剂体积的5/8为一流份，收集第8～9流份；使用所述梯度洗脱剂进行梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1和1∶1；每一梯度的梯度洗脱剂和粗提产物的用量比独立地为800ml∶6～9g；(8)将收集的第8～9流份进行浓缩，得到6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮。该提取方法操作简便，易于实施。本发明还提供了所述6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮在制备抗胃癌或抗肝癌药物中的应用。由实施例结果可知，所述6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮对人胃癌sgc27901细胞和人肝癌hepg2细胞生长抑制率分别可达到79％和86％。具体实施方式本发明提供了6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮，具有式i所示结构，本发明提供了一种从单叶蔓荆中提取6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮的方法，包含如下步骤：(1)将单叶蔓荆粉碎，得到单叶蔓荆颗粒；(2)对所得单叶蔓荆颗粒进行醇提，得到流浸膏；(3)将所得流浸膏分散于水中，使用乙酸乙酯对其进行萃取，得到乙酸乙酯层；(4)将所得乙酸乙酯层进行浓缩处理，得到乙酸乙酯浓缩物；(5)以石油醚和丙酮的混合物为梯度洗脱剂，对所述乙酸乙酯浓缩物进行硅胶柱层析，以每梯度洗脱剂体积的1/2为一流份，收集前9个流份；使用所述梯度洗脱剂进行梯度洗脱时，石油醚和丙酮的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1和0∶1；每一梯度的梯度洗脱剂和乙酸乙酯浓缩物的用量比独立地为2000ml∶60～70g；(6)将收集的前9个流份进行浓缩，得到粗提产物；(7)以石油醚和乙酸乙酯的混合物为梯度洗脱剂，对所得粗提产物进行硅胶柱层析，以每梯度洗脱剂体积的5/8为一流份，收集第8～9流份；使用所述梯度洗脱剂进行梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1和1∶1；每一梯度的梯度洗脱剂和粗提产物的用量比独立地为800ml∶6～9g；(8)将收集的第8～9流份进行浓缩，得到6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮。本发明将单叶蔓荆粉碎，得到单叶蔓荆颗粒。本发明优选将所述单叶蔓荆干燥后再进行粉碎。本发明对所述干燥的实施方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的干燥手段进行即可。本发明对所述粉碎的实施方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的粉碎手段进行即可。本发明所述粉碎得到的单叶蔓荆颗粒的粒径优选≥80目，更优选为80～200目，最优选为100～150目。在本发明中，所述单叶蔓荆为其全草。得到单叶蔓荆颗粒后，本发明对所得单叶蔓荆颗粒进行醇提，得到流浸膏。在本发明中，所述醇提优选的顺次包含第一醇提、第二醇提和第三醇提；所述第一醇提、第二醇提和第三醇提过程优选独立地采用回流法进行提取，使用的乙醇溶液的质量浓度优选独立地为80～90％，更优选为85％。本发明对所述回流法的实施方式没有特殊要求，按照本领域技术人员所熟知的醇提回流方法进行即可。在本发明中，所述第一醇提过程乙醇溶液的用量优选为单叶蔓荆颗粒质量的8～15倍，更优选为11～12倍；提取时间优选为1～2小时，更优选为1.5～1.8小时；所述第二醇提过程乙醇溶液的用量优选为单叶蔓荆颗粒质量的7～11倍，更优选为9～10倍；提取时间优选为0.5～1.5小时，更优选为1～1.2小时；所述第三醇提过程乙醇溶液的用量优选为单叶蔓荆颗粒质量的5～9倍，更优选为7～8倍；提取时间优选为0.5～1.5小时，更优选为1～1.2小时。本发明优选在所述第一醇提完成后，将提取剩余物再次加入乙醇，进行第二醇提，依次类推，最终将三次得到的提取液合并。所述醇提结束后，本发明优选将提取液中的乙醇回收至无醇味，得到流浸膏。本发明对所述回收乙醇的方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法进行即可。得到流浸膏后，本发明将所得流浸膏分散于水中，使用乙酸乙酯对其进行萃取，得到乙酸乙酯层。在本发明中，所述流浸膏和水的用量比优选为200g∶(0.5～1.5)l，更优选为200g∶1l。本发明对所述流浸膏的分散方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的分散方法进行即可。本发明优选使用乙酸乙酯萃取3次，以最大限度的从水中萃取有效组分，提高最后的收率。在本发明中，所述流浸膏和每次萃取所用乙酸乙酯的用量比独立地优选为200g∶(0.5～1.5)l，更优选为200g∶1l。得到乙酸乙酯层后，本发明将所得乙酸乙酯层进行浓缩处理，得到乙酸乙酯浓缩物。本发明对所述浓缩处理的实施方法没有特殊要求，按照本领域的常规技术知识进行即可。本发明优选采用旋转蒸发的方式将乙酸乙酯除去。得到乙酸乙酯浓缩物后，本发明以石油醚和丙酮的混合物为梯度洗脱剂，对所述乙酸乙酯浓缩物进行硅胶柱层析，以每梯度洗脱剂体积的1/2为一流份，收集前9个流份。本发明使用所述梯度洗脱剂进行梯度洗脱时，石油醚和丙酮的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1和0∶1。本发明每一梯度的梯度洗脱剂和乙酸乙酯浓缩物的用量比独立地为2000ml∶60～70g，优选为2000ml∶65g。本发明使用的硅胶柱的规格为1300g，100～200mesh，φ70mm×l1200mm。本发明将收集的前9个流份进行浓缩，得到粗提产物。本发明对所述浓缩的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的浓缩手段进行即可。得到粗提产物后，本发明以石油醚和乙酸乙酯的混合物为梯度洗脱剂，对所得粗提产物进行硅胶柱层析，以每梯度洗脱剂体积的5/8为一流份，收集第8～9流份。本发明使用所述梯度洗脱剂进行梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1和1∶1。本发明每一梯度的梯度洗脱剂和粗提产物的用量比独立地为800ml∶6～9g，优选为800ml∶7.56～8g。本发明使用的硅胶柱的规格为200g，100～200mesh，φ40mm×l800mm。本发明将收集的第8～9流份进行浓缩，得到6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮。本发明对所述浓缩的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的浓缩手段进行即可。本发明还提供了所述6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮或者所述提取方法提取的6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮在制备抗胃癌或抗肝癌药物中的应用。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1将单叶蔓荆全草干燥粉碎后过80目筛，取筛下部分在常温下用85wt％的乙醇采用回流法提取三次。第一次用11倍于原材料质量的乙醇提取1.5小时，第二次用9倍于原材料质量的乙醇提取1小时，第三次用7倍于原材料质量的乙醇提取1小时，之后回收乙醇至无醇味，得流浸膏。将提取所得流浸膏200g分散于1l水中，分别用1l乙酸乙酯萃取三次，得水层物及乙酸乙酯层物。对乙酸乙酯层浓缩得样品65g，以石油醚和丙酮的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1为洗脱剂梯度洗脱，每一梯度洗脱剂的用量为2000ml进行硅胶柱层析(1300g，100～200mesh，φ70mm×l1200mm)，以1000ml为一流份，收集前9个流份。将前9个流份浓缩后共得到7.56g粗提产物。将所得粗提产物经硅胶柱层析(200g，100～200mesh，φ40mm×l800mm)，以石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1为洗脱剂梯度洗脱，每一梯度用洗脱剂的用量为800ml，以500ml为一流份，收集第8和第9流份，浓缩后得到最终产品。对得到的最终产品进行核磁氢谱检测、核磁碳谱检测、红外检测和紫外检测，检测结果表明得到的最终产品为6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮。实施例2将单叶蔓荆全草干燥粉碎后过80目筛，取筛下部分在常温下用90wt％的乙醇采用回流法提取三次。第一次用11倍于原材料质量的乙醇提取2小时，第二次用9倍于原材料质量的乙醇提取1.5小时，第三次用7倍于原材料质量的乙醇提取1.5小时，之后回收乙醇至无醇味，得流浸膏。将提取所得流浸膏220g分散于1l水中，分别用1l乙酸乙酯萃取三次，得水层物及乙酸乙酯层物。对乙酸乙酯层浓缩得样品70g，以石油醚和丙酮的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1为洗脱剂梯度洗脱，每一梯度洗脱剂的用量为2000ml进行硅胶柱层析(1300g，100～200mesh，φ70mm×l1200mm)，以1000ml为一流份，收集前9个流份。将前9个流份浓缩后共得到8.03g粗提产物。将所得粗提产物经硅胶柱层析(200g，100～200mesh，φ40mm×l800mm)，以石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1为洗脱剂梯度洗脱，每一梯度用洗脱剂的用量为800ml，以500ml为一流份，收集第8和第9流份，浓缩后得到最终产品。对得到的最终产品进行核磁氢谱检测、核磁碳谱检测、红外检测和紫外检测，检测结果表明得到的最终产品为6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮。实施例3体外抑制实验(mtt法)肿瘤细胞：肝癌细胞株hepg2，购于美国atcc公司。测试药物的配制：称取一定量的实施例1所得6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮分别配制成0.05、0.1、0.15、0.2、0.25μg/ml的化合物溶液。两个阳性对照组：5-氟尿嘧啶、顺铂，分别设5个浓度，0.05、0.1、0.15、0.2、0.25μg/ml。选对数生长期的细胞，先用pbs磷酸盐缓冲液冲洗两遍，再用适量含edta的0.25％胰蛋白酶消化1min，使贴壁细胞变为单个细胞悬浮液，细胞计数板进行计数。调整细胞的浓度为5×104个/ml接种到96孔板中，每孔加入的体积为100μl。放入含5％co2的37℃恒温培养箱中培养24h后，每个孔内加入100μl不同浓度梯度的测试药物。每个测试样品的浓度梯度设4个复孔平行试验，每个测试药物重复3次实验。加完药后放入培养箱中培养48h，取出加入mtt测试液(pbs配制为5mg/ml)，每孔20μl，继续孵育4h后，将其上清小心去掉并向每个孔内加入dmso150μl，振荡96孔板让结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上选取570nm波长测定每孔的od值。细胞抑制率计算公式如下：表1肝癌细胞抑制率结果浓度(μg/ml)测试药物抑制率0.0570％0.179％0.1586％0.286％0.2585％表1结果表明，本申请提供的6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮对肝癌hepg2细胞具有抑制作用，其抑制率可达86％。按照上述方法验本申请提供的6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮对胃癌sgc27901细胞的抑制效果，所选用的胃癌sgc27901细胞购于美国atcc公司。表2胃癌细胞抑制率结果浓度(μg/ml)测试药物抑制率0.0559％0.168％0.1579％0.278％0.2579％表2结果表明，本申请提供的6，8，4’-三羟基-5，2’，3’-三甲氧基黄酮对胃癌sgc27901细胞具有抑制作用，其抑制率可达79％。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12