RNAi干扰片段、干扰载体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种rnai干扰片段、rnai干扰载体、及rnai干扰载体的制备方法及其应用。

背景技术：

在自然条件下，几乎所有哺乳动物的性别比例都接近1:1，从而实现了无间断地进行稳定地繁衍后代，在自然的条件下达到生态平衡。对于畜牧生产实际而言，理想的性别比例具有十分重要的意义。对性状要求较高的畜牧生产比如泌乳性状(奶牛)、产蛋性状(母鸡)等畜牧企业希望得到更多的雌性个体，而产肉、产毛性状的在雄性个体上表现得优势性更加明显。一直以来，人类对控制动物后代的性别就有着极大的兴趣。目前，哺乳动物的性别控制主要从受精前和受精后两个方面进行，前者是将精子分离后再进行人工授精使得在受精时就决定了后代的性别；后者采用早期胚胎性别鉴定，进行胚胎的性别筛选的方法来控制后代的性别。

哺乳动物性别决定理论认为，性染色体为“xx”的受精卵就能够发育成雌性个体，而性染色体为“xy”的就会发育成雄性。那么从根本上讲，控制家畜性别最理想的方法是先分离x、y精子，然后再进行受精，就能人为地控制后代的性别，理论上这是在性别控制中最简单、最经济的途径。自20世纪50年代后，关于精子分离的研究很多，这些研究都试图利用x精子和y精子不同的物理特性(体积、密度、电荷、运动性))，采用离心法、电泳法、离子交换法、细胞表面抗原法等不同的方法来实现精子的分离，但是都有一个共同的问题即可重复性差。而且这些差异随着环境条件的不同而发生变化，因此，许多研究结果常常不一致，甚至出现相反的结论，致使两类精子某些差异性研究存在争议。到目前为止，除了x、y精子dna含量具有差异可以肯定之外，其他方面的差异表现很小，甚至难以确定。但是随着分子生物学技术的不断发展，以及研究工作的深入，新的研究成果将会不断涌现。

目前，根据哺乳动物x、y精子dna含量存在差异的原理，利用流式细胞仪进行分离x、y精子效果最好，纯度可达90％以上，但是由于设备昂贵，分离速度慢，用于受精的精子数量少等原因，远远不能满足生产上对性控精液的大量需求。相比之下，如果能够找到两种精子发育或受精过程中，甚至胚胎发育时关键性的x、y染色体特异mrna，结合当代新兴的分子生物学技术利用rna干扰(rnainterference，rnai)的方法则有望以较低的成本，简便、快速地实现对动物的性别控制。

rnai是一种转录后的基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，ptgs)现象，通过体外人工合成或体内产生的双链rna(dubble-strandedrna.dsrna)在细胞内特异性地降解其同源的mrna，使得相应的基因干扰，实现阻止目标基因的表达。rnai方法能够快速、简便、有效、特异地下调细胞中的基因表达，它不但是研究基因功能的一种有力工具，而且也为特异性基因治疗提供了新的技术手段，其应用前景十分广阔。

在基因组、mrna和蛋白水平的研究都证明，x、y精子基因表达的确存在差异。基因表达检测研究表明，在精子形成的减数分裂粗线期，为防止一些酶类与性染色体发生作用，两条性染色体高度浓缩形成性体。性体的形成保护了性染色体，性染色体上特殊基因的表达被关闭。因此，哺乳动物成熟精子中虽然含有mrna，但是却没有mrna的转录，这种差异来自精子发生过程中的转录，然而翻译远落后于转录。这些mrna是精子成熟后指导合成一些必须的蛋白，或者是受精后对卵母细胞mrna库的补充，或作为rnai对生育和胎儿生长发育起着关键的作用。

hendriksen等对小鼠的研究发现，减数分裂过程中，除xist基因表达外，几乎所有的性染色体基因都没有表达，然而减数分裂后期，一些性染色体特异基因开始表达。减数分裂后，检测到y染色体上ubely和sry基因具有较高的mrna水平；在x精子中也检测到ubelx基因mrna高水平表达，同时发现x染色体特异基因mhr6a的表达产物。另外还有人发现x、y染色体其他特异基因的表达，如x染色体特异基因akap82(精子尾部的骨架蛋白)及nap-x(编码一种核相关蛋白)，y染色体特异基因zfy-1、zfy-2及y353/b。

其中，zfx/zfy基因是染色体上编码锌指蛋白的一对等位基因，从减数分裂期开始表达，在圆形精子细胞中的含量最高。zfx基因是zfy(zincfinger-y)基因家族中的一员，zfy基因家族包括zfx，zfy和zfa基因，他们在分子结构上非常相似。一般哺乳动物有zfx和zfy基因,zfx基因位于x性染色体上,是雌、雄性哺乳动物x染色体必含的基因,zfy基因位于y性染色体上，两个基因位于性染色体的末端，但并不位于同源区域。zfx基因包括一个酸性的转录激动区域，一个核定位序列和一个dna连接区，具有13个c2h2[cys(2)his(2)]型锌指结构。在哺乳动物细胞中，c2h2锌指结构是最常见的蛋白质结构之一。目前已发现800多种具有这种锌指结构的蛋白质，具有重要的生理功能。zfx/zfy编码的蛋白作为转录因子，在精子形成过程中具有重要功能并与精子的发生有关。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供一种rnai干扰片段、干扰载体及其制备方法和应用。主要目的是通过rnai干扰载体对动物y染色体上的zfy基因进行干扰，使得zfy基因表达量下降，以此达到人为控制动物性别的目的。

为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

一种rnai干扰片段，用于干扰动物y染色体上的zfy基因，所述rnai干扰片段包括以下序列：

agttcaaactctagtgatt；

所述的zfy基因负责编码的蛋白作为转录因子，与精子的发生有关。

进一步的，所述的rnai干扰片段用于干扰公牛y染色体上的zfy基因。

进一步的，根据权利要求1或2所述的一种rnai干扰片段，所述的rnai干扰片段用于制备控制动物性别的药物或试剂盒。

另一方面，一种rnai干扰载体，所述的rnai干扰载体具有上述的rnai干扰片段；

所述的rnai干扰载体用于干扰动物y染色体上的zfy基因。

进一步的，所述的rnai干扰载体用于干扰公牛y染色体上的zfy基因。

上述的一种rnai干扰载体，其特征在于：

所述的rnai干扰载体包括plentilox3.7载体，所述的plentilox3.7载体与所述rnai干扰片段连接。

另一方面，一种rnai干扰载体的应用，

所述的rnai干扰载体在动物受精前用于性别控制，所述的rnai干扰载体为上述的rnai干扰载体。

进一步的，所述rnai干扰载体以睾丸直接注射的方式注射至动物体内，用于干扰动物y染色体上的zfy基因。

进一步的，所述rnai干扰载体以睾丸直接注射的方式注射至公牛体内，用于干扰动物y染色体上的zfy基因。

一种rnai干扰载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)酶切plentilox3.7载体；

(2)将所述rnai干扰片段与酶切后的所述plentilox3.7载体连接，得到连接产物；

其中，所述rnai干扰片段序列如权利要求1所述；

(3)将所述连接产物转化至感受态细胞中，并筛选出阳性克隆菌液；

对阳性克隆菌液进行测序鉴定，并将测序结果与所述rnai干扰片段序列完全一致的菌液进行扩增；

(4)从所述扩增的菌液中提取rnai干扰载体。

与现有技术相比，本发明至少具有下列优点：

本发明提供的的rnai干扰片段，通过对公牛的生殖细胞中y精子的zfy基因进行沉默，阻碍、损伤或者破坏y精子的正常发育。在与母牛交配时给予了x精子更多的受精机会，从而使f1代的母犊比率大大提高。本方法对所需精子细胞不会造成明显的损伤或者降低其活力，而且成本低廉。

附图说明

图1为本发明rnai干扰片段、干扰载体及其制备方法和应用中zfymrna在细胞中的表达水平；

图2为本发明rnai干扰片段、干扰载体及其制备方法和应用中的载体构建示意图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明rnai干扰片段、干扰载体及其制备方法和应用，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种加强型葡萄酒及其制备方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

下面将结合具体实施例对本发明一种加强型葡萄酒及其制备方法做进一步的详细介绍：

实施例1.

设计并合成用于干扰动物睾丸生精细胞中的zfy基因的rnai干扰片段。下面本实施例以公牛睾丸生精细胞中的zfy基因的rnai干扰片段为例，对本发明提供的技术方案进行说明。具体如下：

根据牛zfy基因的mrna序列设计3个sirna片段模板并筛选出1个sirna片段，其中表1为用于sirna的zfycdna模板；

表1用于sirna的zfycdna模板

然后按照所述plentilox3.7载体及所带启动子的要求，合成1对shrnai的寡聚核苷酸序列。该shrnai干扰片段为shrnaa，如表2所示。

其中，所使用的zfy基因序列来自于ncbi基因库，根据rnai设计原则和在ncbi上的比对分析结果筛选出3个sirna片段，如表1所示，用于sirna的zfycdna模板。分别在每个sirna片段的5’和3’添加xholⅰ和hpaⅰ酶切位点，然后合成sirna片段并筛选出1对shrnai干扰片段，如表2所示。

表2pll3.7-a干扰载体的shrna序列

实施例2.

实施例1中所述的shrnai干扰片段的筛选方法具体如下：

所使用的zfy基因序列来自于ncbi基因库(登录号：nm_177491.1)，根据rnai设计原则和在ncbi上的比对分析结果筛选出3个sirna片段，如表1所示，用于sirna的zfycdna模板。分别在每个sirna片段的5'和3'添加xholⅰ和hpaⅰ酶切位点，如表3所示，然后送生物公司合成shrna片段。正、反义链通过退火合为双链连接到plentilox3.7(addgene,美国)慢病毒包装系统载体上，然后转化到e.colidh5α感受态细胞中(tiangen,中国)进行扩增，提取质粒-20℃保存。

表3.具有hpai和xhoi双酶切位点的奶牛zfy基因shrna序列

2、zfy基因的体外干扰试验：

体外干扰试验设置空白对照组(不作任何处理)、空载体组(转染空载体)和试验组(分别转染pll3.7/a、pll3.7/b、pll3.7/c)。

采集18月龄以上的健康成年公牛睾丸1只，75％酒精打湿消毒，双抗pbs浸泡冲洗，细胞培养室内，采用两步酶消化法分离出睾丸支持细胞和生精细胞。将这些分离出的细胞放入含10％胎牛血清的hamf12/dmem培养液中，内添加hepes(15mol/l)、100ku/l青霉素以及0.1g/l链霉素、1ug/ml表皮生长因子、100ulits(胰岛素,转铁蛋白,硒酸钠){胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(10μg/ml)}、3.3×10^-7mol/l视黄酸、维生素a(3.3×10^-7mo/l)、10μg/ml维生素e、10^-4mol/l维生素c、10^-3mol/l丙酮酸、10^-7mol/l睾酮、25u/lrfsh。约按1×10⁶cell/cm²的密度接种于放有盖玻片的六孔板中，在37℃、5％co2、湿度为95％的条件下培养24小时，用脂质体2000作为转染试剂将构建好的载体转染到生精细胞中，每组重复三次。转染48小时后提取生精细胞的总rna，用rt-pcr检测zfy基因的mrna表达水平。如表4所示为目的基因引物序列及pcr条件。

表4zfy基因引物序列及pcr条件

3、zfy基因的动物体内干扰试验：

挑选出干扰效果最好的pll3.7/a进行动物体内干扰实验。

将提取的pll3.7/a质粒用加入双抗的pbs溶液进行稀释，然后按2.5mg/管的量对质粒进行分装。试验牛按照每侧睾丸2.5mg的剂量沿睾丸纵轴接近附睾三分之一处使用14号穿刺针注射。注射时，边注射边缓慢回抽穿刺针，注射完毕后，慢慢将穿刺针拔出，并对注射孔严格消毒措施。间隔7d注射一次，共注射3次。第三次注射后第5d开始采集公牛精液，制作细管冻精，液氮保存。将制作的冻精采用人工授精的方式配种，登记配种母牛耳号、配种日期，对后代的性别比例数量进行统计分析。

结果如下：

1、rt-pcr检测生精细胞中zfy基因mrna的表达水平：

如图1所示，结果显示：试验组pll3.7/a,pll3.7/b,pll3.7/c中zfy基因mrna的表达水平均低于空白对照组和空载体组。其中pll3.7/b、pll3.7/c与对照组和空载体组比较差异显著(p＜0.05)；pll3.7/a与对照组和空载体组比较差异极显著(p＜0.01)。所以选取pll3.7/a进行动物体内干扰试验。

2、参试公牛后代的性别比例：

如表5所示，注射pll3.7/a的公牛f1代犊牛的母犊率为74.8％，注射前f1代犊牛的母犊率为49.2％，差异显著(p＜0.05)。

表5f1代犊牛雌雄性别比例统计表

注：与对照组比较，上标为a的表示差异不显著；上标为b的表示差异显著(p<0.05)。

实施例3.

一种rnai干扰载体，包括序列为seqidno.1所示的rnai干扰片段，即sirnaa：agttcaaactctagtgatt，其制备方法，包括如下步骤：

(1)酶切plentilox3.7载体；

(2)将所述rnai干扰片段与酶切后的所述plentilox3.7载体连接，得到连接产物；

其中，所述rnai干扰片段序列为seqidno.1，即sirnaa：agttcaaactctagtgatt；

(3)将所述连接产物转化至感受态细胞中，以含有plentilox3.7载体、酶切位点和发夹结构来筛选并将得到的菌液进行测序鉴定，并将测序结果与所述rnai干扰片段序列完全一致的菌液进行扩增；

所述酶切位点为hpai和xholi；所述发夹结构序列为seqidno.2；

(4)从所述扩增的菌液中提取rnai干扰载体。

其中载体构建示意图如图2所示。

以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。

sequencelisting

<110>石河子大学

<120>rnai干扰片段、干扰载体及其制备方法和应用

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<213>人工序列

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