一种靶向FAP酶的喜树碱类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及有机合成
技术领域：
，具体涉及一种靶向fap酶的喜树碱类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：喜树碱是一种天然的植物生物碱，该分子为五环结构，含有一个吡咯[3,4-b]喹啉环，一个共轭吡啶环和一个α-羟基六元内脂环(见下式)。喜树碱可以用于治疗多种恶性肿瘤，如骨癌、肝癌、膀胱癌和白血病等。1985年，hisang等发现喜树碱及其衍生物是以dna拓扑异构酶i作为标靶抑制生物体内dna的合成而发挥抗肿瘤作用。成纤维细胞激活蛋白酶(fibroblastactivationprotein，fap酶)是一种膜丝氨酸肽酶，是ii型丝氨酸蛋白酶家族成员之一，具有二肽肽酶及胶原酶活性，在肿瘤微环境中表达fap的肿瘤相关成纤维细胞是最早被鉴定的一种肿瘤间质细胞类型。fap酶由肿瘤间质中的成纤维细胞与癌细胞相互作用而活化，是肿瘤微环境中最主要的宿主细胞，具有促进瘤细胞生长、侵袭及免疫抑制的作用，而且基因组稳定不易耐药，因而可以成为肿瘤免疫治疗的新靶标。人体正常细胞中一般很少有fap酶，但其在人体肿瘤微环境中(tme,tumormicroenvironment)的存在比血浆中大10-100倍。通过将细胞毒性小分子药物与特殊的多肽交联使其形成暂时无活性的前体药物，然后将其输送至肿瘤组织，利用fap的肽键专一性肽链切酶活性，使前体药物得以释放，达到杀伤靶细胞(癌细胞)的作用。技术实现要素：本发明实施例的第一个方面提供一种靶向fap酶的喜树碱类化合物，其可作为使肿瘤fap酶能特异降解的前药。其在体外无活性，进入机体后，在肿瘤部位产生高浓度活性药物，发挥肿瘤抑制作用，减少用药量，降低毒性。本发明实施例的第二个方面提供一种上述靶向fap酶的喜树碱类化合物的制备方法，其步骤简单，操作方便，对设备的要求低，可高效地得到上述靶向fap酶的喜树碱类化合物。本发明实施例的第三个方面提供一种上述靶向fap酶的喜树碱类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。具体来说，本发明实施例的第一个方面提供一种靶向fap酶的喜树碱类化合物，所述化合物的结构式如式1所示，式1中，r1选自氢、c1～c6烷基或c1～c6取代烷基，r1的结合位点为苯环上未取代的三个位点中的任一个；r2选自氢、c1～c6烷基或c1～c6取代烷基；r3选自氢、氨基、c1～c6烷基或c1～c6取代烷基。本发明实施例所指的氨基是既包括氮原子与两个氢相连的-nh2，也包括-nh2中的一个或两个氢原子被烷基、烷氧基、酰基、烷氧羰基或芳氧羰基取代后的基团，例如-n(ch3)2，-n(ch2ch3)2，-n(ch2ch2ch3)2，-nhch2ch3，-nhoch2ch3，-nhcoch3，-nhcooch3，-nhcbz等。c1～c6烷基可以是直链烷基也可以是支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基等。c1～c6取代烷基是指c1～c6烷基中的至少一个氢原子被卤素、氨基、羟基、烷氧基、芳基或杂环取代后的基团。所述杂环包括但不限于呋喃、噻吩、哌啶、哌嗪及其衍生物。进一步的，所述靶向fap酶的喜树碱类化合物的结构式如式2所示，式2中，r1选自氢、c1～c4烷基或c1～c4取代烷基；r2选自氢、c1～c4烷基或c1～c4取代烷基；r3选自氢、氨基、c1～c4烷基或c1～c4取代烷基。c1～c4烷基可以是直链烷基也可以是支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基等。c1～c4取代烷基是指c1～c4烷基中的至少一个氢原子被卤素、氨基、羟基、烷氧基、芳基或杂环取代后的基团。所述杂环包括但不限于呋喃、噻吩、哌啶、哌嗪及其衍生物。进一步的，式2中，r1选自氢或r4、r5分别选自氢、c1～c6烷基、c1～c6取代烷基或芳基；r2选自氢、乙基或r3为-nhr6，r6选自氢、苄氧基羰基或乙酰基。本发明实施例的第二个方面提供一种靶向fap酶的喜树碱类化合物的制备方法，所述制备方法包括：采用10-二氟甲基喜树碱类化合物与boc-甘氨酸反应得到甘氨酸酯类中间体，将甘氨酸酯类中间体与盐酸反应得到取代的10-二氟甲基喜树碱类中间体；将脯氨酸类衍生物与氨基乙酸酯反应得到脯氨酸类中间体，将脯氨酸类中间体与无机碱类试剂反应得到取代的脯氨酸类化合物；以及将上述取代的10-二氟甲基喜树碱类中间体与取代的脯氨酸类化合物反应得到所述靶向fap酶的喜树碱类化合物；其中，所述靶向fap酶的喜树碱类化合物的结构式如式1所示，所述10-二氟甲基喜树碱类化合物的结构式如式3所示；所述甘氨酸酯类中间体的结构式如式4所示；所述取代的10-二氟甲基喜树碱类中间体的结构式如式5所示，所述脯氨酸类衍生物的结构式如式6所示；所述脯氨酸类中间体的结构式如式7所示；所述取代的脯氨酸类化合物的结构式如式8所示，其中，r1选自氢、c1～c6烷基或c1～c6取代烷基，r1的结合位点为苯环上未取代的三个位点中的任一个；r2选自氢、c1～c6烷基或c1～c6取代烷基；r3选自氢、氨基、c1～c6烷基或c1～c6取代烷基。本发明实施例所指的氨基是既包括氮原子与两个氢相连的-nh2，也包括-nh2中的一个或两个氢原子被烷基、烷氧基、酰基、烷氧羰基或芳氧羰基取代后的基团，例如-n(ch3)2，-n(ch2ch3)2，-n(ch2ch2ch3)2，-nhch2ch3，-nhoch2ch3，-nhcoch3，-nhcooch3，-nhcbz等。c1～c6烷基可以是直链烷基也可以是支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基等。c1～c6取代烷基是指c1～c6烷基中的至少一个氢原子被卤素、氨基、羟基、烷氧基、芳基或杂环取代后的基团。所述杂环包括但不限于呋喃、噻吩、哌啶、哌嗪及其衍生物。进一步的，所述靶向fap酶的喜树碱类化合物的结构式如式2所示，式2中，r1选自氢、c1～c4烷基或c1～c4取代烷基；r2选自氢、c1～c4烷基或c1～c4取代烷基；r3选自氢、氨基、c1～c4烷基或c1～c4取代烷基。c1～c4烷基可以是直链烷基也可以是支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基等。c1～c4取代烷基是指c1～c4烷基中的至少一个氢原子被卤素、氨基、羟基、烷氧基、芳基或杂环取代后的基团。所述杂环包括但不限于呋喃、噻吩、哌啶、哌嗪及其衍生物。进一步的，式2中，r1选自氢或r4、r5分别选自氢、c1～c6烷基、c1～c6取代烷基或芳基；r2选自氢、乙基或r3为-nhr6，r6选自氢、苄氧基羰基或乙酰基。进一步的，所述采用10-二氟甲基喜树碱类化合物与boc-甘氨酸反应得到甘氨酸酯类中间体的步骤中，还加入dcm(二氯甲烷)、edci(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和dmap(4-二甲氨基吡啶)，室温下反应进行15-20小时。进一步的，所述将甘氨酸酯类中间体与盐酸反应得到取代的10-二氟甲基喜树碱类中间体的步骤中，还加入乙酸乙酯溶液，室温下反应进行2-3小时。进一步的，所述将脯氨酸类衍生物与氨基乙酸酯反应得到脯氨酸类中间体的步骤中，还加入diea(n,n-二异丙基乙胺)和hatu(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯)，室温下反应8-12min；然后加入gly-ome.hcl(甘氨酸甲酯盐酸盐)，室温下反应3.5-4.5小时。进一步的，所述将脯氨酸类中间体与无机碱类试剂反应得到取代的脯氨酸类化合物的步骤中，还加入thf(四氢呋喃)和水，室温下反应2.5-3.5小时。进一步的，所述将取代的10-二氟甲基喜树碱类中间体与取代的脯氨酸类化合物反应得到所述靶向fap酶的喜树碱类化合物的步骤中，还加入dcm、dmap和diea，体系冷却至0℃；然后将edci分4批加入体系，室温下反应16-18小时。在一些实施方案中，本发明所述靶向fap酶的喜树碱类化合物的结构式为：中的任一种。本发明实施例的第三个方面提供上述任一种靶向fap酶的喜树碱类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明实施例的有益效果是：本发明实施例提供了一种靶向fap酶的喜树碱类化合物及其制备方法和应用，该靶向fap酶的喜树碱类化合物由10-二氟甲基喜树碱类化合物和脯氨酸类衍生物作为起始物，分别经取代和修饰，再将两者所得物进行反应，最终得到该靶向fap酶的喜树碱类化合物。该制备方法步骤简单，操作方便，对设备的要求低，可高效地得到上述喜树碱类化合物。该靶向fap酶的喜树碱类化合物具有较佳的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物中具有广阔的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例提供的各组肿瘤实物的照片图。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1化合物1-4的制备(1)以10-二氟甲基喜树碱类化合物1b为起始原料。50ml的三口瓶中加入化合物1b(200mg,0.47mmol)，boc-甘氨酸(165mg,0.94mmol)，dcm(5ml)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci)(448mg,2.34mmol)，体系浑浊，室温下分2次加入dmap(57mg,0.47mmol)，体系逐渐澄清，呈黄色液体，室温下搅拌15-20小时，tlc检测原料反应完全，停止反应，加入20mldcm稀释，用20ml氯化钠水洗2次，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到粗品，柱层析纯化(hexane:ea＝1:1-2)洗脱收集产品，浓缩后得0.21克白色固体，收率：78％。(2)向三口瓶中加入1-2(0.25g)和饱和的hcl/ea溶液10ml，体系呈黄绿色，室温反应2～3小时，tlc检测原料反应完全，反应液浓缩，所得浅黄色油状物加入6ml异丙醇，加热使其完全溶解，随后搅拌下自然降温，约30分钟后有黄色固体析出，继续搅拌2-3小时，过滤，滤饼用2ml异丙醇淋洗，抽干后40-50℃干燥得到0.21克黄色固体，收率：95％。esi-ms：484.46[m+h]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.56(s,1h),8.45(b,3h),8.15(d,j＝12hz,1h),8.01(d,j＝12hz,1h),7.33(s,1h),7.34(t,j＝56hz,1h),5.62(s,2h),5.51(m,2h),4.35(d,j＝20hz,1h),3.35(d,j＝20hz,1h),3.25(m,2h),2.18(m,2h),1.30(m,3h),0.90(m,3h).(3)100ml单口瓶中加入化合物2-1(cbz-gly-pro-oh)(3g,9.8mmol)，dmf(50ml)，diea(3.8g,29.4mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)(4.85g,12.7mmol)，室温搅拌10min，加入gly-ome.hcl(1.48g,11.75mmol)，室温搅拌4h，将体系倒入300ml水中，dcm(200mlx3)萃取，合并有机相，有机相用hcl水溶液(0.1m,200ml)洗涤，nahco3水溶液(0.1m,200ml)洗涤，水(200mlx3)洗涤，饱和nacl(100ml)洗涤，na2so4干燥，旋干，用200-300目硅胶柱层析(hex/ea＝1:1-0:1),收集产品浓缩得2.9g白色固体，收率78％。(4)100ml单口瓶中加入化合物2-2(2.9g,7.7mmol)，thf(25ml)，lioh.h2o(1.45g,34.6mmol)，水(25ml)和meoh(5ml)。室温搅拌3h，减压浓缩除去有机溶剂，剩余水相用hcl(2m)调ph至3左右，将水相用氯仿：异丙醇(1:3，100mlx3)萃取，合并有机相，用饱和nacl水溶液(50ml)洗涤，na2so4干燥；减压浓缩得2.5g白色固体，收率90％。(5)50ml的单口瓶中加入化合物2-3(380mg,1.05mmol)，1-3(300mg,0.7mmol),dcm(10ml),dmap(9mg,0.07mmol)和diea(180mg,1.41mmol)，体系冷却至0℃，将edci(540mg,2.81mmol)分4批加入体系；室温搅拌17小时，tlc检测反应基本完全，停止搅拌，加入100mldcm稀释，水(60mlx2)洗涤，饱和nacl(60mlx2)洗涤，无水na2so4干燥，旋干，用200-300目硅胶柱层析(hex/ea＝2:1-0:1),收集产品浓缩,用hex/ea(10/1,20ml)搅拌20min，过滤，干燥得310mg浅黄色固体，收率57％。esi-ms：772.27[m+h]实施例2除上述方法外，还可以利用化合物1-4来获得化合物1-5。化合物1-5的制备向单口瓶中加入化合物1-4(0.3g)和hbr(35％inacoh,4ml)，室温反应2小时，将体系旋干，加100mlhcl(0.1m)水溶液溶解,水相用甲基叔丁基醚(50ml×3)洗涤，水相用nahco3调ph至8左右，用dcm(60ml×4)萃取，合并dcm，用饱和nacl(50ml)洗涤，无水na2so4干燥，有机相减压浓缩至约30ml时，加入0.3mlhcl(4minea),有固体产生，静置20分钟，吸去上清液，再加入30mldcm，搅拌后静置20min，再吸去上清液，固体油泵负压干燥，得70mg黄色固体，上清液旋干得160mg黄色固体，收率88％。esi-ms：638.23[m+h]实施例3除上述方法外，还可以利用化合物1-5来获得化合物1-6。化合物1-6的制备向单口瓶中加入化合物1-5(160mg,025mmol)，chcl3(10ml),diea(162mg,1.25mmol)和ac2o(77mg,0.75mmol)，室温反应1小时，将体系旋干，加30mldcm,有机相用柠檬酸(10％，30ml)洗涤，nahco3(1％,30ml)洗涤，饱和nacl(30ml)洗涤，na2so4干燥，旋干，用200-300目硅胶柱层析(dcm/meoh＝50:1-15:1),收集产品浓缩得150mg浅黄色固体，收率93％。实施例4化合物4-1的制备(1)向三口瓶中加入10-羟基喜树碱(2g,5.49mmol)，甲醇60ml和水50ml，然后加入feso4.7h2o(1.52g,5.49mmol)，体系浑浊，降温到0℃，滴加浓h2so4(26ml)，于0℃下滴加双氧水4.8ml，0℃搅拌10分钟后撤去冰浴，升温到30℃反应16小时，降温到0℃，滴加水150ml，约10分钟加完，滴加过程中有固体析出，加毕，0℃搅拌1小时，过滤，滤饼用20ml0℃水洗，干燥得到1.38克浅黄色固体产品，收率：69％。(2)向三口瓶中加入3-1(3.8g)，氢溴酸(48％水溶液)70ml和浓硫酸1.2ml，100℃油浴搅拌反应过夜，lcms检测原料反应完全，硅胶柱层析(dcm：meoh＝30-10:1)洗脱，收集产品浓缩得3g红色固体，收率68％。(3)向单口瓶中加入3-2(3g，6.6mmol)、dmf(120ml)和n-甲基哌嗪(2.2ml，3eq.)，室温搅拌过夜，tlc显示原料反应完毕，向反应液中加入tea(3.6ml)和phn(so2cf3)2(4.7g，2eq)，60℃反应4h，tlc显示原料反应完毕。将体系降温至室温，倒入600ml水中，ea(300mlx3)萃取，合并ea相，ea相用水(300mlx2)洗涤；将ea相用hcl(1m,200mlx3)反萃取，合并水相，用nahco3调ph到8左右，用ea(200mlx3)萃取，合并ea相，ea相用饱和nacl(200ml)洗涤，na2so4干燥。旋干溶剂，粗品用50mlea/hex(1/3)搅拌20分钟，过滤，滤饼用10mlea/hex(1/3)洗涤，干燥得2.1g浅黄色固体3-4，收率53％。(4)向耐压瓶中加入3-4(1g),pd(pph3)4(0.19g,0.33mmol),膦配体dppf(0.18g,0.66mmol),kbr(0.39g,0.66mmol)，甲苯(5ml)和无水二氧六环(10ml),n2保护，加入[(sipr)ag(cf2h)](1.26g,4.6mmol)，70℃油浴中搅拌反应16小时，将体系降温至室温，倒入到100ml水中，ea(100mlx3)萃取，合并ea相，将ea相用hcl(1m,100mlx3)反萃取，合并水相，用nahco3调ph到8左右；用ea(100mlx3)萃取，合并ea相，ea相用饱和nacl(100ml)水溶液洗涤，无水na2so4干燥；浓缩得0.5g红色固体，将所得固体用dcm溶解，200-300目的硅胶柱层析(dcm:meoh＝20-10:1)，收集产品浓缩得深黄色固体，浓缩物用10ml(dcm/mecn＝1/10)搅拌0.5小时，过滤干燥得0.49克浅黄色固体，收率59％。esi-ms：511.21[m+h](5)向单口瓶中加入化合物2-3(142mg,0.392mmol)，3-5(100mg,0.196mmol),dcm(3ml),dmap(9mg,0.07mmol)和diea(51mg,0.392mmol)，体系冷却至0℃，将edci(540mg,2.81mmol)分3批加入体系(间隔3min)；室温搅拌18小时，tlc检测剩余少量原料，停止反应，加入100mldcm稀释，水(100mlx2)洗涤，饱和nacl(100mlx2)洗涤，na2so4干燥，旋干，用200-300目硅胶柱层析(hex/ea＝2:1-0:1),收集产品浓缩得60mg浅黄色固体2-1，收率：36％。esi-ms：856.34[m+h]活性测试采用冷光检测法，收获处于对数生长期的细胞并采用血小板计数器进行细胞计数，用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。选用的细胞株、培养基及细胞接种数如表1所示。表1.试验所用细胞株、培养基及细胞接种数序号细胞系细胞类型细胞数量/孔培养基1a2780卵巢癌6000rpmi1640+10％fbs分别添加90μl细胞悬液至96孔板中，将96孔板中的细胞置于37℃、5％co2、95％湿度条件下培养过夜。配制10倍药物溶液，最高浓度为10μm，9个浓度，3.16倍稀释，在接种有细胞的96孔板中每孔加入10μl药物溶液，每个药物浓度设置三个复孔。将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％co2、95％湿度条件下继续培养72h，之后加入测定发光细胞活力的ctg试剂(promega,cat#g7572)进行分析。融化ctg试剂并平衡细胞板至室温30min，每孔加入等体积的ctg溶液，在定轨摇床上振动5min使细胞裂解，将细胞板放置于室温20min以稳定冷光信号，用spectramax(md，2104-0010a)多标记微孔板检测仪读取冷光值。使用graphpadprism5.0软件分析数据，利用非线性s曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算ic50值，计算结果如表2所示。表2.抗肿瘤活性试验结果序号药物名称/代号ic50(μm)11b0.0005221-4＞103紫杉醇0.00554顺铂1.8150在体活性研究实验方法雄性balb/c裸鼠30只，接种5×106/100ulpbs浓度的sw620结直肠癌细胞后8天，随机分为5组，每组6只。尾静脉给药，每3天给药1次，连续给药5次，观测瘤体积及体重变化，最后1次给药后3日，处死小鼠，剥瘤称重，拍照留证。整理所测数据，进行统计分析。结果见表3、表4和表5，并参见图1。表3各组不同时间的平均肿瘤体积(单位：mm3)与空白对照比，*p<0.05,#p<0.001表4各组瘤重比较药物名称/代号浓度瘤重(g)抑制率(％)空白1.458±0.078/1-42mg/kg0.840±0.114*421-410mg/kg0.336±0.037#771-450mg/kg0.027±0.009#@98iritean80mg/kg0.329±0.043#77与空白对照比，*p<0.05,#p<0.001与iritean比，@p<0.001参见图1，其中图1显示了各组肿瘤实物的照片，其中可见肿瘤尺寸和重量的对比。表5各组不同时间的平均体重(单位：g)与空白对照比，*p<0.05化合物1-42mg/kg、10mg/kg、50mg/kg三个剂量及伊立替康80mg/kg在荷瘤小鼠均表现出了抗肿瘤活性。化合物1-4抗肿瘤的活性与剂量呈正相关，随剂量的增加而增强。给药结束后，三个剂量均表现出显著地抗肿瘤作用，统计学上有显著差异(p<0.05或0.001)，50mg/kg剂量肿瘤抑制率高达93％。伊立替康80mg/kg肿瘤抑制率为63％，介于化合物1-410mg/kg和50mg/kg的肿瘤抑制率之间。瘤重抑制率类似。化合物1-42mg/kg、10mg/kg对荷瘤小鼠的体重影响不大。与空白对照相比，化合物1-450mg/kg使荷瘤小鼠的体重增加率降低，统计学上有显著差异(p<0.05)，与伊立替康80mg/kg相比，体重变化无明显差异。以上数据表明，化合物1-450mg/kg作用效果优于伊立替康80mg/kg，体重变化与其相当。化合物1-410mg/kg作用效果与伊立替康80mg/kg相当，但体重增加远大于伊立替康。因此，化合物1-4在降低毒性提高作用效果上具有明显优势，具备开发成新药的潜质。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12