腺苷A3受体拮抗剂及其应用的制作方法

本发明属于小分子药物领域，尤其是涉及7种腺苷a3受体拮抗剂及其应用。

背景技术：

腺苷是多种生理活动中普遍存在的调节剂，特别是在心血管和神经系统中，通过与特异性细胞表面受体的相互作用，调节多种生理功能。已知的腺苷受体有四种亚型，分别为a1、a2a、a2b、a3，属于g蛋白偶联受体家族。腺苷a1和a3受体通过与抑制腺苷酸环化酶的g蛋白偶联来下调细胞camp水平，而腺苷a2a和a2b受体通过与活化腺苷酸环化酶的g蛋白偶联上调细胞内的camp水平。通过这些受体，腺苷调控广泛的生理功能。

人们一直在致力于寻找高效、高选择性的人类a3腺苷受体拮抗剂，因为腺苷a3受体广泛分布于人体的中枢神经、肾、心脏、呼吸道、眼的不同区域，其拮抗剂在镇痛、治疗缺血性肾衰竭、防止动脉粥样硬化、治疗肺炎和青光眼方面起着重要作用。报告显示，腺苷a3受体在痛觉传导通路中的脊髓、脑干、丘脑、大脑皮层均有分布，在中枢神经系统痛觉传导通路及浅筋膜均有丰富表达，参与针刺镇痛生理过程，而腺苷a3受体拮抗剂可以减弱疼痛，参与镇痛。腺苷a3受体的拮抗剂在缺血诱发性肾衰竭治疗中起作用。此外，有研究显示，在心血管系统中，腺苷通过活化a3ars而刺激vegf分泌，刺激泡沫细胞形成，并且a3ar拮抗剂大幅减少此效果。因此，在心血管系统中分布的腺苷a3受体被拮抗后，泡沫细胞形成大幅减少，可阻碍动脉粥样硬化斑块发展。呼吸道中的腺苷a3受体在调控呼吸系统中起作用，a3ars已被牵涉在炎性过程中，在促(或抗)炎性响应中均发挥重要作用。a3ar在肥大细胞活化中的功能作用的最有力证据来自于基因敲除小鼠的利用，其中在不存在或存在过敏原的情况下，肥大细胞脱粒呈现为依赖于腺苷受体活化。a3ar缺陷型小鼠的气道高应答性削减，因此以选择性a3ar拮抗剂治疗的小鼠显示肺炎症显著减弱、气道中的嗜酸细胞浸润减少和气道粘液产生减少。这些数据表明腺苷a3受体拮抗剂在炎症作为重要特征的肺疾病相关状况中的潜在应用。最后，调节腺苷a3受体作为治疗各种眼疾病如干眼综合征、青光眼或葡萄膜炎的潜在治疗靶标已被报道，早期研究证明，在小鼠中删除腺苷a3受体显示眼内压降低，腺苷a3受体拮抗剂可作为治疗青光眼的一种新疗法。

因此腺苷a3受体拮抗剂的发现对于因腺苷a3受体高表达或活性过高所导致的相关疾病的治疗具有重大意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出7种腺苷a3受体拮抗剂及其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供结构式(i-vii)表示的化合物及其药学上可接受的盐。

结构式(i)表示的化合物及其药学上可接受的盐：

常用名为白杨素，英文名为chrysin，cas号为480-40-0，其分子式为c15h10o4，分子量为254.238。

结构式(ii)表示的化合物及其药学上可接受的盐：

常用名为桔皮素，英文名为tangeretin，cas号为481-53-8，其分子式为c20h20o7，分子量为372.369。

结构式(iii)表示的化合物及其药学上可接受的盐：

常用名为异泽兰黄素，英文名为eupatilin，cas号为22368-21-4，其分子式为c18h16o7，分子量为344.315。

结构式(iv)表示的化合物及其药学上可接受的盐：

常用名为川陈皮素，英文名为nobiletin，cas号为478-01-3，其分子式为c21h22o8，分子量为402.395。

结构式(v)表示的化合物及其药学上可接受的盐：

常用名为艾黄素，英文名为5-hydroxy-3，3′，4′，6，7-pentamethoxyflavone，cas号为479-90-3，其分子式为c20h20o8，分子量为388.368。

结构式(vi)表示的化合物及其药学上可接受的盐：

常用名为黄芩素，英文名为baicalein，cas号为491-67-8，其分子式为c15h10o5，分子量为270.237。

结构式(vii)表示的化合物及其药学上可接受的盐：

常用名为柚皮素，英文名为naringenin，cas号为480-41-1，其分子式为c15h12o5，分子量为272.253。

上述化合物及其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防a3腺苷受体高表达或活性过高导致的相关疾病或病症的药物的用途。

上述化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗镇痛药物的用途。

上述化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗缺血性肾衰竭疾病药物中的用途。

上述化合物及其药学上可接受的盐在制备防止动脉粥样硬化药物中的用途。

上述化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗肺炎疾病药物中的用途。

上述化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗青光眼疾病药物中的用途。

一种药物组合物，包括上述化合物及其药学上可接受的盐及其药学上可接受的赋形剂。

所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。具体如糖浆、阿拉伯胶和淀粉等。该药物组合物可以通过静脉、口服、舌下、经肌肉或皮下、皮肤黏膜途径给药。

所述药物组合物的制剂形式为液体制剂或固体制剂。具体如片剂、胶囊剂和注射剂等。各剂型均可以以药学常规方法制备而成。

一种复方药物，包含上述化合物及其药学上可接受的盐以及能够与其联用的药物。

相对于现有技术，本发明所述的7种腺苷a3受体拮抗剂及其应用具有以下优势：

本发明所述的7种化合物中有两个化合物的腺苷a3受体功能实验(a3antagonistcampassay)的ic50在纳摩尔级别，化合物22368-21-4的ic50为0.39μm，化合物481-53-8的ic50为0.48μm；4种化合物的ic50低于10μm，化合物480-40-0的ic50为1.19μm，化合物478-01-3的ic50为4.49μm，化合物479-90-3的ic50为6.17μm，化合物491-67-8的ic50为5.54μm；化合物480-41-1的ic50为10.04μm。

附图说明

图1为功能实验中本发明化合物480-40-0对腺苷a3受体的抑制率曲线；

图2为功能实验中本发明化合物481-53-8对腺苷a3受体的抑制率曲线；

图3为功能实验中本发明化合物22368-21-4对腺苷a3受体的抑制率曲线；

图4为功能实验中本发明化合物478-01-3对腺苷a3受体的抑制率曲线；

图5为功能实验中本发明化合物479-90-3对腺苷a3受体的抑制率曲线；

图6为功能实验中本发明化合物491-67-8对腺苷a3受体的抑制率曲线；

图7为功能实验中本发明化合物480-41-1对腺苷a3受体的抑制率曲线；

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明涉及化合物480-40-0、481-53-8、22368-21-4、478-01-3、479-90-3、491-67-8以及480-41-1均购自成都德斯特生物技术有限公司。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例

实验步骤

1、camp实验缓冲液的配制：

2、化合物储液的配置：

a.使用100％(v/v)dmso将forskolin溶解成100mm储备液，并进行3倍梯度稀释成12个浓度点。

b.使用100％(v/v)dmso将neca(激动剂)溶解成1mm储备液，并进行3倍梯度稀释成12个浓度点。

c.使用100％(v/v)dmso将mrs1220(抑制剂)溶解成0.1mm储备液，并进行3倍梯度稀释成10个浓度点。

d.使用100％(v/v)dmso将待测化合物溶解成30mm储备液，并进行3倍梯度稀释成10个浓度点。

3、细胞铺板

a.实验前，收集稳定表达adora3受体的细胞，计数并检测活性，活性大于＞85％的细胞被用于后续试验。

b.用camp实验缓冲液稀释细胞至2×105个/ml。

c.在384孔细胞板中加入2000个细胞/10μl/孔。

4、使用echo每孔转移10nl系列稀释的forskolin至细胞板中。

5、1000rpm离心1分钟后，室温600rpm震荡2分钟。放入25℃恒温箱中孵育30分钟。

6、制备eu-camp示踪工作液和ulight-anti-camp工作液：

7、每孔加入5μl的eu-camp示踪工作液和5μl的ulight-anti-camp工作液。1000rpm离心1分钟后，室温600rpm震荡2分钟。放入25℃恒温箱中孵育15分钟。

8、使用envision酶标仪读板。设置激发波长为320nm，发射波长为665nm和615nm。计算665nm/615nm的比值；依据拟合曲线计算ec50，并计算ec90用于后续实验。

9、使用echo向细胞板每孔转移适量体积forskolin以达到其ec90，并转移10nl系列稀释激动剂至细胞板中。

10、1000rpm离心1分钟后，室温600rpm震荡2分钟。放入25℃恒温箱中孵育30分钟。

11、按照步骤6和7所示制备并加入eu-camp示踪工作液和ulight-anti-camp工作液。

12、使用envision酶标仪读板。设置激发波长为320nm，发射波长为665nm和615nm。计算665nm/615nm的比值；依据拟合曲线计算ec50，并计算ec90用于后续实验。

13、使用echo每孔转移67.5nl系列稀释的待测化合物至细胞板中；参比抑制剂每孔转移10nl化合物和57.5nl100％(v/v)dmso以保证每孔dmso含量一致。

14、1000rpm离心1分钟后，室温600rpm震荡2分钟。放入37℃恒温箱中孵育10分钟。

15、使用echo每孔转移适量体积forskolin和参比激动剂(neca)以达到其ec90。1000rpm离心1分钟后，室温600rpm震荡2分钟。

16、25℃恒温箱中孵育30分钟。

17、按照步骤6和7所示制备并加入eu-camp示踪工作液和ulight-anti-camp工作液。

18、使用envision酶标仪读板。设置激发波长为320nm，发射波长为665nm和615nm。计算665nm/615nm的比值；依据拟合曲线计算ic50。

数据分析

1、fret信号比值(λem(665nm)/λem(615nm))用于forskolin和激动剂量效曲线拟合，并计算其ec50和ec90。

2、在抑制剂模式下使用如下公式计算％inhibition并用于拮抗剂量效曲线拟合：n＝100-100×(u-c2)/(c1-c2)。其中u是待测化合物组tr-fret信号的比值，c1代表highcontrol组tr-fret信号的比值，c2代表lowcontrol组tr-fret信号的比值。量效曲线通过xlfit软件进行拟合并计算化合物ic50。

通过本实施例，发现了7种腺苷a3受体拮抗剂，化合物22368-21-4的体外抑制活性为0.39μm，化合物481-53-8的体外抑制活性为0.48μm；化合物480-40-0的体外抑制活性为1.19μm，化合物478-01-3的体外抑制活性为4.49μm，化合物479-90-3的体外抑制活性为6.17μm，化合物491-67-8的体外抑制活性为5.54μm；化合物480-41-1的体外抑制活性为10.04μm。