染料木素桥连哌嗪类衍生物合成方法及其抗肿瘤方向应用与流程

本发明属于药物化学技术领域，尤其涉及一种染料木素衍生物、其制备方法及应用。

背景技术：

如今，癌症对人类的威胁越来越大，而治疗癌症的手段和药物并不能完全满足人们的需求，所以，人们加速了抗癌药物的研发进程。

染料木素，别名金雀异黄素，其化学结构与内源性雌激素雌二醇极为相似，而该化合物及其合成的衍化物具有广泛的生物学活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫、抗炎活性及心血管活性等，引起人们的广泛关注。

哌嗪是具有两个氮原子的六元杂环，是一个重要的医药中间体，主要用于生产驱肠虫药磷酸哌嗪、枸橼酸哌嗪，以及强痛定、利福平。

本发明利用烷基将哌嗪类化合物和染料木素桥连起来，合成一系列新型的化合物，不同的哌嗪类取代基将大大改变其生物活性，并采用mtt研究法对该类化合物进行抗肿瘤活性研究，实验结果显示，该类化合物对于多种癌细胞的生长都具有良好的抑制效果，说明本发明中合成的化合物能够作为一类新型的抗癌药物进行研究开发。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有抗肿瘤活性的染料木素衍生物、其制备方法及应用。

本发明提供了一种染料木素衍生物，如式(i)所示：

其化学通式如上所示，其中，r为吡啶基，醛基，羟乙基，叔丁氧羰基，异丙基，氨乙基，甲酸乙酯基。

优选的，如式(i-1)～式(i-4)所示：

本发明还提供了一种染料木素衍生物的制备方法，包括：

步骤一：将哌嗪衍生物与甲醇在酸性条件下反应，得到式(ii)所示的化合物中间体；

步骤二：将所述式(ii)所示的化合物与染料木素反应，得到式(i)所示的化合物；

本发明还提供了上述染料木素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供了一种染料木素衍生物，如式(i)所示，其中，r为吡啶基，醛基，羟乙基，叔丁氧羰基，。与现有技术相比，本发明提供的染料木素衍生物对多种肿瘤细胞具有良好的生长抑制作用，尤其r为吡啶取代基时，对于a549细胞、hela细胞、mcf-7细胞、sh-sy5y细胞与hepg2细胞五类肿瘤细胞具有较高的抑制生长活性。

附图说明

在说明书附图中：

图1为本发明合成化合物结构通式；

图2为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和染料木素在不同浓度下对hela细胞的生长抑制率评价图；

图3为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和染料木素在不同浓度下对hepg2细胞的生长抑制率评价图；

图4为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和染料木素在不同浓度下对a549细胞的生长抑制率评价图；

图5为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和染料木素在不同浓度下对sh-sy5y细胞的生长抑制率评价图；

图6为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和染料木素在不同浓度下对mcf-7细胞的生长抑制率评价图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

将染料木素与式(ii)所示化合物反应；所述染料木素与式(ii)所示的化合物的摩尔比优选为1：(1～3)，更优选为1：(1.1～2)，再优选为1：1.2；所述酸性条件优选加入酸性试剂提高；所述酸性试剂为本领域技术人员熟知的酸性试剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为浓盐酸；在本发明中该反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的质子化试剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为甲醇；所述甲醇与染料木素的比例优选为(20～100)ml：1g，更优选为(50～80)ml：1g，再优选为67ml：1g；所述反应的温度优选为25℃～80℃，更优选为25℃～50℃，再优选为35℃；所述反应的时间优选为2～24h，更优选为8～20h，再优选为18h。

反应结束后，将产物从反应体系中分离，所述分离的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，分离后，得到产物。

此步骤的反应式如下：

本发明还提供了一种上述式(i)所示的染料木素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明目标化合物的抗肿瘤活性，可以采用mtt研究法，通过目标化合物与各种肿瘤细胞的相互作用，研究其在不同浓度条件下，抑制肿瘤生长的效果作为评价手段之一，用肿瘤细胞的抑制率予以表现。在活细胞的线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，它能使外源性mtt还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死亡后细胞无此功能。mtt与细胞作用后，用二甲基亚砜溶解细胞中的甲瓒，利用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映肿瘤细胞生长的抑制情况。在一定细胞数范围内，mtt结晶甲瓒形成的量与活细胞数成正比。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的染料木素衍生物、其制备方法及应用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

步骤一：式(i-1)所示化合物的制备

将680.1(2.5mmol)染料木素、45ml甲醇，200μl(2.5mmol)37％甲醛，加入100ml圆底烧瓶，30℃下搅拌回流30min，再加入405.51mg(3mmol)1-乙酰哌嗪于圆底烧瓶中，30℃下搅拌回流8h，常温反应5h。然后停止反应，减压抽滤，固液分离。收集固体，固体中包含有少量1-乙酰哌嗪哌嗪，甲醛和少量染料木素和产物；液体中包含有染料木素、溶于甲醇的1-乙酰哌嗪。用甲醇对固体进行洗涤5次，每次7ml甲醇，即可得到660.6mg的白色固体，产率64.43％。

对中间产物进行测定：

利用核磁共振对得到的白色固体进行检测，得到¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.35(s,1h),7.35(d,j＝7.34hz,2h),6.80(d,j＝6.78hz,2h),6.24(s,1h),3.71(s,4h),3.40(q,j＝3.4hz,5h),2.41(s,2h),1.39(s,3h).

利用质谱仪对得到的白色固体进行检测，得到esi-msm/z[m+h]⁺＝411.1456。

利用熔点仪对得到的白色固体进行检测，得到熔点268℃～272℃。

将上述合成的本发明的式(i-3)所示的化合物，实验采用mtt研究方法，评价目标化合物抑制不同肿瘤细胞生长的抑制率以及ic50值。

实验采用的细胞培养均在37℃、5％co2的无菌培养箱的环境下进行，培养基采用含10％fbs的dmem培养基。

目标化合物浓度设置：将本发明目标化合物配制成浓度梯度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l、80μmol/l的试验用样品。培养基作为空白对照，即化合物浓度为0。

mtt法实验流程：以a549细胞系为例，细胞从液氨中复苏，经过3次传代后细胞处于正常贴壁生长状态。在96孔板最外一圈的孔中加入100μlpbs，将细胞以6000个/孔的浓度种在96孔板剩余的孔中，最右一列作为空白组不种细胞。种板后24h待细胞处于贴壁状态后，再加入不同浓度梯度的样品，每种浓度设置为一列6个复孔。作用48h后，将孔内液体析出吸出，随后每孔加入20μl用pbs稀释的浓度为5mg/ml的mtt溶液，该溶液已经透过滤膜除菌，同时每孔加入100μldmem。作用4h后，将含有mtt的液体吸出，加入dmso，轻微摇晃5min使紫色结晶溶解至dmso中。利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光度a490，计算出样品对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率采用如下公式计算：细胞的生长抑制率＝(对照组a490-样品组a490)/(对照组a490–空白组a490)×100％，以及目标化合物对不同肿瘤细胞的ic50值，采用spss统计学软件计算得出。

得到结果见表1与图1。

表1式(i-1)所示化合物对不同的细胞的ic50值

实施例2

步骤一：式(i-2)所示化合物的制备

将190.3(0.7mmol)染料木素、15ml甲醇，56μl(0.7mmol)37％甲醛，加入50ml圆底烧瓶，30℃下搅拌回流30min，再加入192mg(0.8mmol)1-boc哌嗪于圆底烧瓶中，50℃下搅拌回流6h。然后停止反应，减压抽滤，固液分离。收集固体，固体中包含有少量1-boc哌嗪，甲醛和少量染料木素和产物；液体中包含有染料木素、溶于甲醇的1-boc哌嗪。用甲醇对固体进行洗涤5次，每次7ml甲醇，即可得到167.32mg的白色固体，产率51.05％。

对中间产物进行测定：

利用核磁共振对得到的白色固体进行检测，得到¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.01(s,1h),8.35(s,1h),7.34(d,j＝7.33hz,2h),6.78(d,j＝6.77hz,2h),6.22(s,1h),3.69(s,2h),3.28(s,4h),2.41(t,j＝2.40hz,4h),1.35(s,9h).

利用质谱仪对得到的白色固体进行检测，得到esi-msm/z[m+h]⁺＝453.1362。

利用熔点仪对得到的白色固体进行检测，得到熔点320℃～322℃。

将上述合成的本发明的式(i-3)所示的化合物，实验采用mtt研究方法，评价目标化合物抑制不同肿瘤细胞生长的抑制率以及ic50值。

实验采用的细胞培养均在37℃、5％co2的无菌培养箱的环境下进行，培养基采用含10％fbs的dmem培养基。

目标化合物浓度设置：将本发明目标化合物配制成浓度梯度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l、80μmol/l的试验用样品。培养基作为空白对照，即化合物浓度为0。

mtt法实验流程：以a549细胞系为例，细胞从液氨中复苏，经过3次传代后细胞处于正常贴壁生长状态。在96孔板最外一圈的孔中加入100μlpbs，将细胞以6000个/孔的浓度种在96孔板剩余的孔中，最右一列作为空白组不种细胞。种板后24h待细胞处于贴壁状态后，再加入不同浓度梯度的样品，每种浓度设置为一列6个复孔。作用48h后，将孔内液体析出吸出，随后每孔加入20μl用pbs稀释的浓度为5mg/ml的mtt溶液，该溶液已经透过滤膜除菌，同时每孔加入100μldmem。作用4h后，将含有mtt的液体吸出，加入dmso，轻微摇晃5min使紫色结晶溶解至dmso中。利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光度a490，计算出样品对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率采用如下公式计算：细胞的生长抑制率＝(对照组a490-样品组a490)/(对照组a490–空白组a490)×100％，以及目标化合物对不同肿瘤细胞的ic50值，采用spss统计学软件计算得出。

得到结果见表2与图2。

表2式(i-2)所示化合物对不同的细胞的ic50值

实施例3

步骤一：式(i-3)所示化合物的制备

将809.9(3mmol)染料木素、60ml甲醇，240μl(3mmol)37％甲醛，加入100ml圆底烧瓶，30℃下搅拌回流30min，再加入500μl(3.6mmol)n-(2-羟乙基)哌嗪于圆底烧瓶中，35℃下搅拌回流5h，常温反应8h。然后停止反应，减压抽滤，固液分离。收集固体，固体中包含有少量n-(2-羟乙基)哌嗪，甲醛和少量染料木素和产物；液体中包含有染料木素、溶于甲醇的n-(2-羟乙基)哌嗪。用甲醇对固体进行洗涤10次，每次7ml甲醇，即可得到829.7mg的白色固体，产率67.13％。

对中间产物进行测定：

利用核磁共振对得到的白色固体进行检测，得到¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.35(s,1h),7.37(d,j＝7.37hz,2h),6.82(d,j＝6.81hz,2h),6.19(s,1h),3.82(s,2h),6.42(t,j＝6.16hz,2h),2.56(s,4h),2.49(s,2h),2.40(t,j＝2.36hz,4h).

利用质谱仪对得到的白色固体进行检测，得到esi-msm/z[m+h]⁺＝413.1751。

利用熔点仪对得到的白色固体进行检测，得到熔点94℃～96℃。

将上述合成的本发明的式(i-3)所示的化合物，实验采用mtt研究方法，评价目标化合物抑制不同肿瘤细胞生长的抑制率以及ic50值。

实验采用的细胞培养均在37℃、5％co2的无菌培养箱的环境下进行，培养基采用含10％fbs的dmem培养基。

目标化合物浓度设置：将本发明目标化合物配制成浓度梯度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l、80μmol/l的试验用样品。培养基作为空白对照，即化合物浓度为0。

mtt法实验流程：以a549细胞系为例，细胞从液氨中复苏，经过3次传代后细胞处于正常贴壁生长状态。在96孔板最外一圈的孔中加入100μlpbs，将细胞以6000个/孔的浓度种在96孔板剩余的孔中，最右一列作为空白组不种细胞。种板后24h待细胞处于贴壁状态后，再加入不同浓度梯度的样品，每种浓度设置为一列6个复孔。作用48h后，将孔内液体析出吸出，随后每孔加入20μl用pbs稀释的浓度为5mg/ml的mtt溶液，该溶液已经透过滤膜除菌，同时每孔加入100μldmem。作用4h后，将含有mtt的液体吸出，加入dmso，轻微摇晃5min使紫色结晶溶解至dmso中。利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光度a490，计算出样品对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率采用如下公式计算：细胞的生长抑制率＝(对照组a490-样品组a490)/(对照组a490–空白组a490)×100％，以及目标化合物对不同肿瘤细胞的ic50值，采用spss统计学软件计算得出。

得到结果见表3与图3。

表3式(i-3)所示化合物对不同的细胞的ic50值

实施例4

步骤一：式(i-4)所示化合物的制备

将809.9g(3mmol)染料木素、60ml甲醇，240μl(3mmol)37％甲醛，加入100ml圆底烧瓶，30℃下搅拌回流30min，再加入583.4mg(3.6mmol)1-(4-吡啶基)哌嗪于圆底烧瓶中，35℃下搅拌回流8h，常温反应8h。然后停止反应，减压抽滤，固液分离。收集固体，固体中包含有少量1-(4-吡啶基)哌嗪，甲醛和少量染料木素和产物；液体中包含有染料木素、溶于甲醇的1-(4-吡啶基)哌嗪。用甲醇对固体进行洗涤6次，每次10ml甲醇，即可得到1022.8mg的白色固体，产率76.61％。

对中间产物进行测定：

利用核磁共振对得到的白色固体进行检测，得到¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.39(s,1h),8.16(d,j＝8.15hz,2h),7.39(d,j＝7.38hz,2h),6.83(m,4h),6.28(s,1h),3.79(s,2h),3.30(s,4h),2.61(s,4h).

利用质谱仪对得到的白色固体进行检测，得到esi-msm/z[m+h]⁺＝446.1751。

利用熔点仪对得到的白色固体进行检测，得到熔点362℃～365℃。

将上述合成的本发明的式(i-4)所示的化合物，实验采用mtt研究方法，评价目标化合物抑制不同肿瘤细胞生长的抑制率以及ic50值。

实验采用的细胞培养均在37℃、5％co2的无菌培养箱的环境下进行，培养基采用含10％fbs的dmem培养基。

目标化合物浓度设置：将本发明目标化合物配制成浓度梯度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l、80μmol/l的试验用样品。培养基作为空白对照，即化合物浓度为0。

mtt法实验流程：以a549细胞系为例，细胞从液氨中复苏，经过3次传代后细胞处于正常贴壁生长状态。在96孔板最外一圈的孔中加入100μlpbs，将细胞以6000个/孔的浓度种在96孔板剩余的孔中，最右一列作为空白组不种细胞。种板后24h待细胞处于贴壁状态后，再加入不同浓度梯度的样品，每种浓度设置为一列6个复孔。作用48h后，将孔内液体析出吸出，随后每孔加入20μl用pbs稀释的浓度为5mg/ml的mtt溶液，该溶液已经透过滤膜除菌，同时每孔加入100μldmem。作用4h后，将含有mtt的液体吸出，加入dmso，轻微摇晃5min使紫色结晶溶解至dmso中。利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光度a490，计算出样品对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率采用如下公式计算：细胞的生长抑制率＝(对照组a490-样品组a490)/(对照组a490–空白组a490)×100％，以及目标化合物对不同肿瘤细胞的ic50值，采用spss统计学软件计算得出。

得到结果见表4与图4。

表4式(i-4)所示化合物对不同的细胞的ic50值

表5：目标化合物和原料对5种肿瘤细胞的ic50值：