克隆限制性基因和修饰性基因的制作方法

专利名称:克隆限制性基因和修饰性基因的制作方法
本发明是关于生产各种限制性酶类和/或修饰性酶类的无性系，即生产这些无性系的方法及从这些无性系中生产限制性和/或修饰性酶类的方法。本发明特别涉及到HaeⅡ限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶以及TagⅠ限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶的无性系，还涉及到生产这些无性系和酶类的方法。
限制性核酸内切酶是一种天然地有在于细菌中的酶类，当这些酶从其他污染的细菌成份中纯化出来时，可以用于实验室，把DNA分子切成各种精确的片断。这种特性能使DNA分子被准确无误地识别，并被切割成组成它们的各种基因。已证明限制性核酸内切酶是现代遗传学研究上不可缺少的工具。这种酶类是生物化学的“剪子”，用其来进行遗传工程和分析。
限制性核酸内切酶是沿着DNA分子在识别和把其连结到特殊的核苷酸序列(‘识别序列’)上时起作用的。一旦结合上，这种酶就在认别序列的内部或一侧把这种DNA分子切开。不同的限制性核酸内切酶有对不同识别序列的亲和性。在迄今为止调查研究过的成千上石种的细菌中，已鉴定了将近百种不同限制性核酸内切酶。
每一细菌种属最多只含有少数几种限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶原则上是根据获得它们的细菌种的名称来命名的。例如，埃及嗜血杆菌属(Haemophilus aegyptius)合成三种不同的限制性核酸内切酶，被命名为HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。这三种限制性核酸内切酶分别识别和切开(AT)GGCC(AT)，Pu GCGCPy和GGCC序列。另一方面，大肠杆菌Ry13(Escherichia Coli Ry13)仅合成一种酶E.CORⅠ，它是识别GAATTC序列的。
实际上，在细菌细胞的繁衍中，限制性核酸内切酶是起着一种保护性作用的。这种酶能使细菌抵抗各种外来DNA分子如能破坏或寄生于它们的病毒和质粒的侵染。这种限制性核酸内切酶通过每时每刻检查侵染的DNA分子的长度和把存在的识别序列切开来发挥这种抗性的。发生的这种切割使侵染的基因不能发生作用，而且这种DNA变得更容易受到非特异性的核酸外切酶的进一步降解。
细菌保护系统的第二种成份是修饰性甲基化酶类。这类酶是与限制性核酸内切酶相互补的，且提供一种细菌用其就能鉴识它们自己的DNA和区别出外来的侵染DNA的手段。修饰性甲基化酶象相应的限制性核酸内切酶一样，识别和连结到同一核苷酸识别序列上，但却不是切开这种DNA，而是在化学上通过附加上一个甲基基团来修饰此序列内的一种或他种核苷酸的。随着这种甲基化作用后，识别序列就不再与限制性核酸内切酶结合或被其切开了。经过甲基化酸类的修饰作用，细菌细胞中的DNA总是完全修饰，因此对其内源的限制性核酸内切酶的存在是完全不敏感的。只有未领到修饰的因而能被鉴别的外源DNA才对限制性核酸内切酶的识别和攻击是敏感的。
随着遗传工程技术的出现，现在已能够克隆基因及生产蛋白质和酶类，而且克隆的基因编码量比用常规提纯技术获得的基因更大。分离各种限制性核酸内切酶无性系的关键是要发展一种既简单又可靠的方法以便当这种无性系发生的频率像10-4到10-3那么低时在复杂“库”中鉴别这种无性系。所谓“库”，即用“鸟抢式”实验方法获得的那些无性系群体。这种方法最好是具有选择性，以便使不希望要的大部份无性系破坏掉，而稀少的所期望的无性系存活下来。
一些研究者已利用噬菌体的感染作用作为一种选择性分离限制性核酸内切酶无性系的手段(Walder等人，Proc.Nat.Acad.Sci，741503-1507页〔1981〕，Ma Nn等人，Gene 397-112页〔1981〕。既然细菌内的限制性一修饰性系统的存在能使细菌抵抗噬菌体的感染，那么携带有克隆的限制性-修饰性基因的细胞，在原则上就可以作为存活者从暴露于噬菌体的各种库中有选择地分离出来。然而，已经发现这种方法只有有限的价值。特别是已经发现克隆的限制性-修饰性的基因不总表现出对噬菌体有足够抗性而能选择地存活下来的。
因为纯化的限制性核酸内切酶和在较少范围内纯化的修饰性甲基化酶，都是供在实验室中使DNA标志化和使DNA进行重排的有用工具，所以在商业上就鼓励发展这种能大量合成这些酶类的细菌菌株。这样的细菌菌株将简化了提纯工作同时提供了在商业上有实用价值的生产手段，所以这种细菌菌株很有用。
根据本发明，就提供一种通过克隆编码这些酶类的基因和按排这种基因高水平地表达来生产各种限制性酶类和/或它们相应的修饰性酶类的新的途径。特别是提供克隆这些酶类，以此生产克隆的方法以及生产这些酶本身的方法，这种生产包括形成含有编码所期望的限制性酶的DNA库，分离含有相应的修饰性基因克隆并筛选同时存在限制性基因的修饰性基因的克隆。
详细地描述把这种方法分别应用到埃及嗜血杆菌属(Haemophilus aegyptius)和水生栖热菌属(Thermus aquatius)的HaeⅡ和TaqⅠ限制性和修饰性基因上的情况，还描述所产生的细菌菌株。这些菌株构成一种为纯化HaeⅡ和TaqⅠ限制性和修饰性酶类的新的实用的工艺流程基础。
图1克隆HaeⅡ限制性/修饰性基因的示意图。
图2表示几种HaeⅡ限制性/修饰性无性系和HaeⅡ修饰性无性系的HindⅡ消化物的凝胶照片的复制图。
图3按本发明所产生的无性系的HaeⅡ和HaeⅢ限制性基因和修饰性基因的组成结构图。
图4质粒pHaeⅡ的限制性/修饰性基因片段的结构图及pHaeⅡ的HindⅢ双酶解的凝胶照片的复制图。
图5HaeⅡ高效表达的第一种途径。
图6HaeⅡ高效表达的第二种途径。
图7HaeⅡ限制性和修饰性基因低产的和高产的质粒图示，及其酶产量的图表。
本发明提供了一种新的方法克隆限制性基因和/或修饰性基因并从此法产生的无性系中获得酶类。此法利用这样的事实，若含有修饰性基因的无性系内存在相应的限制性基因的识别序列，则在此序列内，该无性系将使它们本身的DNA甲基化。因此这样的无性系在体外将抵抗其相应限制性核酸内切酶的消化作用。随之而来的就是，这些无性系的限制性核酸内切酶的消化作用将导致编码甲基化酶的无性系有选择地存活下来。并且，假如编码甲基化酶的无性系亦含有这种相应的限制性基因时，这种无性系将亦提供表达和收获这种限制性酶本身的手段。
尽管不期望受理论约束，但人们还是相信，在细菌的染色体中，限制性核酸内切酶基因与它们相应的修饰性甲基化酶基因是紧靠在一起的，并且在克隆的实验过程中，这两种基因很可能是仍然连结在一起的。因此，人们相信，只要在克隆过程中无性系接受的DNA片断是相当大的话，那么获得甲基化酶基因的无性系就十分可能同时获得相应的核酸内切酶基因。
根据本发明，已发现修饰性基因和它们相应的修饰性基因在许多细菌的DNA中天然就靠得很近。既然如此，在本发明实施过程中选择含有甲基化酶的细胞就可能被用作为有选择地同时分离甲基化酶无性系和核酸内切酶无性系的一种既简便又可靠的方法。简言之，从亦含有为相应的限制性基因编码的DNA片断的库中选择携带甲基化酶的无性系，常常会分离到相应于同一DNA序列却既带有甲基化酶基因又带有限制性核酸内切酶基因的一些无性系。因此甲基化酶的选择是挑选限制性核酸内切酶无性系的一种间接方法。
在此描述的、借其更好地克隆和表达修饰性基因的方法包括如下步骤1.提纯将要克隆的菌种DNA。
2.用合适的修饰性核酸内切酶部份地消化这种DNA。
3.把所得到的DNA片断连接到一种克隆载体如pBR322上，利用这种混合物来转化适当的寄主细胞如E.coli细胞(大肠杆菌细胞)。
4.把这种DNA/细胞混合体平铺培养在含有抗生素的，供选择的转化细胞培养基上。在温育之后，把已转化的细胞菌落收集到单一的培养物里，这就是初级细胞库。
5.从初级细胞库中全部纯化其重组质粒形成初级质粒库。
6.然后，在体外用限制性酶来完全消化这种质粒库寻找限制性酶的相应的甲基化酶基因。也可以在消化时加入核酸内切酶和/或磷酸酯酶以增强非甲基化酶无性系的破坏。
7.把消化的DNA转化在E.coli内，经平面培养在抗生素平皿上，再次获得转化的菌落。可以取出一些这种菌落一次级细胞个体，分析它们的DNA，证实存在修饰性和/或限制性基因。把剩余的菌落收集在一起，形成次级细胞库，接着可以从这种次级细胞库制备次级质粒库。
8.可以用限制性核酸内切酶(可用或不同核酸外切酶或磷酸酯酶)再次消化次级质粒库，重复所述选择过程，回收第三级细胞个体，第三级细胞库和第三级质粒库。
9.限制性核酸内切酶的每一次消化作用，都使非甲基化酶无性系发生有选择的破坏，使所期望的带有甲基化酶无性系的相对频率提高。
10.取出在次级和第三级群体中存活下来的菌落，分析甲基化酶基因的存在。假如发现有这种甲基化酶基因存在，那么还要进一步分析同时存在着设想与甲基化酶基因相连的限制性基因。
11.甲基化酶的筛选，可以通过4种简单实验来实现。
(a)纯化该无性系的重组质粒DNA分子，且在体外使这种质粒DNA分子受到选择的限制性核酸内切酶的作用，以便确定这种质粒DNA分子有抗消化作用。只要这种质粒载体携带有几个那种核酸内切酶的位点，那么，抗性就表示修饰作用，而不表示突变位点消失。
(b)可以以起初用于切割体细菌DNA的酶来消化重组质粒。在此无性系中存在这种片断应该是容易理解的，此片断对编码甲基化酶基因是足够大的(即，超过1千硷基对)，最重要的是，对独立形成的各种无性系该片断是共同的其相同的片断或片断体应存在于所有的无性系中。
(c)可以提纯这种无性系的总的染色体DNA，且使这种DNA受到有选择的限制性核酸内切酶的作用。假如这种无性系携带有甲基化酶基因，那么这种细菌的染色体就应是完全甲基化了，像质粒一样，应该有抗消化作用。
(d)可以以这种无性系中制备细胞抽提物，且在体外检测甲基化酶的活性(甲基化酶的保护作用和放射性标记)。应该发现有甲基化酶的活性。
12.限制性核酸内切酶的筛选可以用两种方法来进行(a)可以从这种无性系中制备其细胞提取物且在体外检测这种提取物消化敏感DNA的能力。应该发现有限制性核酸内切酶的活性。
(b)可以在体内测定这种细胞本身抗噬菌体感染的能力。抗噬菌体感染的能力表明有限制性一修饰性系统存在。
虽然上述的步骤代表实施本发明的最好模式，但对工艺熟练者很明显，根据工艺上已知技术，可以对上述方法有所改变。
含有限制性和修饰性基因的BanⅠ，HhaⅡ，HindⅢ，HinfⅠ和MspⅠ和的无性系，亦已按照本发明生产。含有上述基因的DNA的来源是解硫胺素芽孢杆菌〔Bacillus anlurinolyticus〕(BanⅠ)(应用微生物研究所，IAM 1077，Sugisaki，H.，Maekawa，Y.，Kanazawa.S.和Takanami.M.(1982)核酸研究，10，5747-5752)，溶血性嗜血杆菌(Haemophilus haemolyliticus)(HhaⅡ)(美国菌种种保存中心-ATCC，10014)，流感嗜血杆菌Rd株系(Haemophilus influenzae Rd)HindⅢ(ATCC33928)，流感嗜血杆菌Rf株系(Haemophilus iufluenzae Rf)(HinfⅠ)(ATCC17947)和莫拉克斯毛菌属(Moraxella species)(MspⅠ)(ATCC53041)。
应当注意，上述的这种一般方法可能偶然地完全不产生甲基化酶无性系。然而，已知此法一般确实能产生甲基化酶无性系，而且在这些无性系中大约有一半无性系亦携带有相应的限制性基因。目前，还未清楚偶然失败的原因是否由于技术上的困难或是由于基础生物学问题如不连接，不表达等引起的。
然而，已发现影响限制性基因和修饰性基因有效克隆的一个重要因素是用作为寄主的E.coli菌株。许多细菌，包括E.coli都有限制性-修饰性系统。在E.coli中，这种最普通的系统是那寄主的特异决定子或“Hsol”系统，但还存在着其他系统，值得注意的是pl，和EcoR一系(Roberts，R.J.，核酸研究.12SR167-204(1984)。因为这些系统在转化过程中破坏了进入的DNA而干扰了克隆，结果得到很少数目的转化体和没有代表性的库。因此一般来说，在实施本发明时，喜欢采用的E.coli是一种通过突变或丢失、其限制性系统已经失活的E.coli。限制性系统已经失活或不存在的、且又可用作一般克隆目的最好株系包括有HB101(hsd R-M-)ATCC33694，RR1(hsd R-M-)ATCC31343，K802(hsd R-M+)ATCC33526，K803(hsd R-M-)ATCC27065和MM294(hsd R-M+)ATCC33625。
尤其对把外源的限制性基因和/或修饰性基因克隆入E.coli中而言，根据本发明的另一种具体情况，还发现有一种干扰有效克隆的附加系统。这个系统还清楚，被称为“Rgl”系统(Revel，H.R.，噬菌体T(Bacteriophage T)PP.156-165，美国微生物协会〔1983〕和Revel等人，遗传学年评4177-192〔1970年〕)。更特别的是，这种E.coli的Rgl系统限制着具有甲基化的胞嘧啶残基的DNA分子，这样就破坏了将要分离的，自身甲基化的质粒无性系。因此，为一克隆这样的甲基化酶基因，最好是采用Hsd(一般的)系统和Rgl(特别的)系统的教有缺陷E.coli作寄主。然而，不是所有克隆的甲基化酶基因都是敏感的，尤其是，使腺嘌呤残基甲基化的基因与使脆嘧啶残基甲基化的基因相比，似乎完全不受Rgl系统的影响。
尽管不想受理论束缚，但人们还是相信，这种Rgl系统是由二种成份组成的。命名为“RglA”和“RglB”似乎是，RglB限制着许多脆嘧啶甲基化酶无性系，而现在已知RglA仅限制一个无性系(HpaⅡ)。
在选择克隆未标志化的限制性-修饰性系统的限制性和/或修饰性基因、或选择已知是一种对脆嘧啶进行甲基化的寄主时，最好的寄主是三重突变的E.coli株系，即是一种缺乏Hsd、RglA和RglB系统的E.coli株系。这样的E.coli株系包括K802。另一方面，假如已知这种修饰性系统是一种腺嘌呤甲基化酶类型系统时，那么这种寄主的Rgl的活性是可以忽略不计的。因有寄主的这种抉择是取决于将要被克隆的修饰性基因的的特性的。这样的寄主不仅对上述的、克隆限制性基因和/或修饰性基因的方法是有用的，而且对其他已知的方法也有用，这一点将会受到工艺熟练者的尝识。
因此，根据本发明的另一种具体情况，还能提供一种克隆脆嘧啶型的修饰性基因和/或它们相应限制性核酸内切酶基因的、包括在一种缺乏Rgl的E.coli株系上构建无性系和繁殖它的方法。表1总结出供克隆修饰性基因的几种E.coli株系的适用性。
表1修饰性甲基 限制性-修 大肠杆菌(E.coli)的适合株系酶的种类 饰性的系统 K802 RR1 MM294(hsd R-， (hsd R-， (hsd R-，rglA-B-)rglA+B-) rglA+B+)腺嘌呤-甲 EcoRⅠ基化酶(已 HhaⅡ知或假定) HindⅢHinfⅠPstⅠ 适宜 适宜 适宜SalⅠTaqⅠ脆嘧啶-甲 AluⅠ基化酶(已 BanⅠ知或假定) BanⅡ(rglB- BglⅠ敏感) FnuDⅡ 适宜 适宜 不适宜HaeⅡHaeⅢHgiAⅠHhaⅠMSPⅠNlaⅣ
脆嘧啶-甲基化酶(rglA- HPaⅡ 适宜 不适宜 不适宜敏感)下面现在最好再举出几个实例进一步说明本发明的具体步骤而作为现时最好操作。应该明白，这些范例，都是解说性的，而且本发明除在从属权利要求
中指出的外，不要把其看作是受限制的。
实例ⅠHaeⅡ限制性-修饰性基因的克隆按照上述的供克隆限制性基因的方法，图1为HaeⅡ甲基化酶的克隆图解。制备HaeⅡ无性系步骤如下1.DNA的提纯为了制备埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegy-ptyius)的DNA(ATCC11116)，把5克新鲜生长的细胞团重悬于20ml的25%蔗糖、50mM Ttis(PH＝8.0)溶液中。再加入10ml0.25MEDTA(PH＝8.0)和6.0ml浓度为10mg/ml的溶菌酶(溶于0.25M Ttis中，PH＝8.0)。悬浮液放于冰上二小时。然后，加进24ml溶胞作用混合液(1% Triton X-100、50mM Tris〔PH＝8.0〕、67mM EDTA)和5ml 10% SDS，混匀，使其细胞发生溶胞作用。然后加入70ml刚平衡好的(苯)酚，摇荡使溶液乳化。再加入70ml氯仿，摇荡使溶液再乳化。然后使这种混合液在10Krpm下离心30分钟，把上层含有DNA的粘溶液转移到新的容器里，用酚/氯仿重新抽提二次以上。把上层的DNA溶液转移到透析管中对1倍(1X)DNA缓冲液(10mM Tris、1mM EDTA、PH＝8.0)透析，换液四次，24小时以上。
把透析过的DNA溶液转移到烧杯中，加入1/100体积的浓度为10mg/ml的RNase(核糖核酸酶)使RNase的最终浓度达100μg/ml。把这种溶液在37℃下温育1小时以便消化RNA。然后加入5M Nacl，使其最终粘度为0.4M，再加入0.55体积的异丙醇且使其在溶液的顶部成层。
用玻璃棒把DNA缠绕出混合液，然后溶解在15ml的1XDNA缓冲液中，存放于4℃。
2.部份消化用HindⅢ滴定这种纯化过的DNA以便达到部份消化作用。步骤如下把溶在10mM Tris PH7.5、10mM Mgcl2、50mM Nacl、10mM巯基乙醇缓冲液中的2.0ml DNA(浓度为100μg/ml)分配成十管，每管200μl。在第一管中加入40个单位的HindⅢ，使达到每微克(μg)DNA有2个单位HindⅢ。在第二管中加入20个单位的HindⅢ(1单位/微克)，如此类推，即每后面的管只接受前管的一半量HindⅢ。把这些试管于37℃温育1小时，然后在72℃加热处理15分钟。从每管中取出10μl这种溶液作琼脂糖凝胶电泳分析。选择消化作用适中但不完全的这些管中的内容物，作为供克隆用的部份消化的片断来源。(这些管是0.13单位/μg和0.06单位/μg的管。把这两种溶液混合一起用法如下述)。
3.连接把DNA片断连接到pBR322上，步骤如下;把用4.0μg HindⅢ部份消化的埃及嗜血杆菌(H.aegyptius)的DNA(40μl)与用2.0μg HindⅢ切开和去磷酸化的pBR322(10μl)混合一起。加入10μl 10X连接作用混合液(500mM Tris〔PH7.5〕、100mM Mgcl2，100mM DTT，5mM ATP)和40μl无菌蒸馏水，使其达到最终体积100μl。再加入5μl的T4DNA连接酶，且把这种混合液于16℃温育4小时。然后，用10份10μl量来转化E.coli RRI株系，步骤如下在冰上，使每份10μl此溶液与100μl的SSC/Cacl(50mM Nacl、5mM Na3Citrate(柠檬酸钠盐)67mM Cacl2)混合起来，再加入200μl冰冷的有活力的E.coli RRI株系的细胞。在43℃下加热摇振2分钟后，再把这种细胞稀释入5ml的Luria-肉汁(L-broth)中，在37℃下生长至饱和态。
4.初到细胞库离心转化的细胞培养物，重新把其悬浮于250μl体积，平面培养在含有100μg/ml浓度氨苄青霉素的Luria-琼脂(L-agar)平皿上。在37℃下温育过夜后，用2.5ml的10mM Tris(PH7.5)、10mM Mgcl2溶液冲洗每块琼脂培养皿，把转化的菌落细胞收集一起，形成初级细胞库。
5.初级质粒库初级质粒库用如下步骤制备把2.5ml初级细胞库接种到500ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汁中。培养液在37℃下摇振过夜后，在4Krpm下离心5分钟。弃去上清液，在室温下把其细胞沉淀团重悬于10ml 25%蔗糖、50mM Tris(PH8.0)液中。加入5ml 0.25M EDTA(PH8.0)，接着加入3ml的、溶于0.25M Tris(PH8.0)的浓度为10mg%ml的溶菌酶。把这种溶液放在冰上1小时，然后用吸管移入12ml溶胞混合液(1% Triton X-100、50mM Tris〔PH8.0〕、67mM EDTA)中，且轻轻地混旋细胞悬浮液达到溶胞作用。溶胞后，把其混合液转移到50ml的塑料离心管中，在4℃下17Krpm离心45分钟。用吸管吸出上清液。称20.0克固体Cscl(氯化铯(放入一个50ml的有螺幅的塑料管中，用吸管移入22.0ml上清液于此管中，混合。再加入1.0ml浓度为5mg/ml的溴乙啶溶液(溶在10mM Tris〔PH8.0〕、1mM EDTA、100mM Nacl液中)。于混合物把此溶液转移到3/8英寸×3英寸的异质同晶聚合物(polallomer)离心管中，封闭好。然后在Ti70转子上在17℃下50Krpm离心42小时。为了收集这种质粒，用外科解剖刀把此管的顶部刺破且在紫外光下用注射器收集两条中较低的呈荧光的DNA带。把两个管中的较低的DNA带合拼一起移入有螺帽的玻璃管中，用等体积的冰冷N-正丁醇抽提4次除去溴乙啶。
把抽提过的溶液移入做成的透析管中，对1X DNA缓冲液透析换液4次，24小时。然后把透析过的DNA溶液转移到一个预先称重的、50ml的无菌离心管中，且测量此溶液的体积。加入5M Nacl液、使其最终浓度达0.4M。然后加入2倍体积的异丙醇，混合。把此溶液存放于-20℃下过夜，沉淀DNA。沉淀后，溶液在0℃下15Krpm离心15分钟，弃掉上清液。把离心管放置于工作台上空气干燥15分钟，然后加入750μl消毒蒸馏水。沉淀块溶解后，再加入8μl 100X的DNA缓冲液，然后把这种溶液移到一种Eppendorf管中，储放于-20℃。以这种方法制备的质粒DNA浓度大约100-200μg/ml。
6.质粒库的消化消化初级质粒库以便破坏那种非HaeⅡ甲基化酶无性系，步骤如下让质粒DNA在10mM Tris PH7.5、10mM Mgcl2、10mM巯基乙醇、50mM Nacl缓冲液中稀释成浓度为50μg/ml。制备总量为500μl且把其分配到5支试管中，每支试管100μl。在第一试管中加入75单位的HaeⅡ使达到15个单位/微克DNA，第二管加入38单位HaeⅡ，如此类推，即每后管含有前一管的一半量HaeⅡ。把这些试管37℃温育1小时。
7.转化用前面叙述的方法，从每管中取出10μl样品作为转化克RRI用。把这种细胞/DNA混合物加热后不经过中间稀释和生长立即培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平皿上，在37℃下温育过夜后，检测此平皿。发现经HaeⅡ消化的质粒库中的转化子的数量(即是完整无损质粒的数量)约减少了102倍。从后面的实验得知，加入2.5个单位核酸外切酶、Ⅲ(新英格兰生物实验室股份有限公司，也可从巴特威克研究所(BRL)和IBI处得到)或入一核酸外切酶到前叙(第6节)的各支消化管中时，会增强非甲基化酶无性系的这种破坏作用，使转化子的数量减少了103-104倍左右。从经受过最大消化作用(加入15个单位HaeⅡ/μg和7.5单位HaeⅡ/μg，加或不加核酸外切酶)的平板培养物上存活下来的菌落中，大约能挑选出30单菌落。把每个菌落都接种到含有氨苄青霉素的10ml L-肉汁中以便制备微量培养物，并在含有氨苄青霉素的L-琼脂平皿上划线培养，以便准备主料(a masfer sfook)。
8.次级群体把剩余的菌落收集一起形成次级细胞库。用上述制备初级质粒库的那种方法来制备次级质粒库。
9.次级质粒库的分析在这种特别实验中，没有再进一步利用这种次级HaeⅡ库。然而，按常例，用消化作用和凝胶电泳方法是有助于分析次级质粒库的。这样的分析可能有助于确定占明显比例的这种群体是否携带有共同片断，并显示出对限制性核酸内切酶消化作用的抗性。
10.次级个体的分析在这种次级细胞个体中，大约有30个存活下来的菌落生长成10ml的培养物(参看第7节)。由Birnboin和Doly的方法(Nucleie Aeid Res。(核酸研究)71513〔1979〕)改进的下述微量物纯化的程序来制备这种细胞所携带的质粒。
微量物制备程序用如下步骤处理每种培养物生长过夜的10ml培养物在8Krmp下离心5分钟沉淀下来。弃掉上清液，把细胞沉淀块重新悬浮于1.0ml含有1mg/ml浓度溶菌酶的混合液中(25mM Tris、10mM EDTA、50mM葡萄糖、PH＝8.0)。室温放置10分钟后，加入2.0ml 0.2M NaoH1% SDS溶液，振摇使细胞发生溶胞作用，然后放置于冰上。一旦待此溶液变清，就加入1.5ml 3M乙酸钠溶液(PH4.8)且振摇。出现的沉淀在4℃下15Krpm离心10分钟。把其上清液倒入一个含有3ml异丙醇的离心管中，混匀。室温下10分钟后，15Krpm离心10分钟使核酸沉淀。倒掉上清液，室温下让空气干燥此沉淀物30分钟。一旦干燥，就把此沉淀块重悬溶于850μl10mM Tris、1mM EDTA液中(PH8.0)。再加入75μl5MNacl，接着，把这种溶液转移到一个盛有575μl异丙醇的Eppen-dorf管中，在室温下再沉淀10分钟。然后在微型离心机上离心45秒种，弃掉上清液，空气干燥此沉淀块。然后，把沉淀块溶解在50μl的含有100μg/ml浓度的RNase中(溶于10mM Tris、1mM EDTA液中(PH8.0)，在37℃下温育1小时以便消化其RNA。加入50μl5M Nacl，随后加入350μl异丙醇来再次沉淀其DNA。室温10分钟后，离心45秒钟，使DNA沉淀下，弃掉上清液，使沉淀块重溶于150μl 10mM Tris、1mM EDTA(PH8.0)的终溶液中。接着通过HindⅢ和HaeⅡ的消化作用分析这种质粒微量制备物。
11.甲基化酶基因无性系发现许多被分析过的这种质粒都随机地携带有Haemophilus(嗜血杆菌)的DNA的HindⅢ片断，而且对HaeⅡ的消化作用很敏感。这些质粒都是不能进一步利用的假的存留者。(发现，这些假的质粒，在以后采用核酸外切酶消化的实验中，用HaeⅡ进行选择消化阶段就明显地减少了)。然而，发现那种残留下来的质粒既对抗HaeⅡ又至少携带长度大约为3.1千碱基对和2.9千碱基对的两个HindⅢ片断。后来，这类质粒表明它们既携带有HaeⅡ修饰性甲基化酶基因，又带有限制性核酸内切酶基因。
在一系列平行的实验中，也选择和分离出携带有HaeⅡ甲基化酶基因的无性系(图1)。发现这些无性系带有大约4.8千碱基对的HindⅢ片断。已分离出几个既带有HaeⅢ甲基化酶基因，又带有HaeⅡ甲基化酶基因的无性系，而且得知这些无性系既带有4.8千碱基对片断又带有二个3.1千碱基对的和2.9千碱基对的片断。后面的这些无性系的分离表明，在埃及嗜血杆菌(H.aegyptius)中，这种HaeⅡ限制性基因和HaeⅡ修饰性基因至少是与HaeⅢ甲基化酶基因连接着的。没有分离到携带在HaeⅢ限制性基因的无性系。图2是是HaeⅡ限制性/修饰性无性系和HaeⅢ修饰性无性系的HindⅢ一消化物凝胶照片的复制图。图3概述了从此凝胶照片和一些相似的分析中推断出这类无性系的组成。
至少携带有3.1千碱基对和2.9碱基对的HindⅢ片断的这类无性系(HaeⅡ4m-1，4-8，4-9，4-10，4-5，4-11，4-3等)，根据(a)对HaeⅡ限制性核酸内切酶的消化作用不敏感和(b)在体外对HaeⅡ限制性甲基化酶活性的测定结果，被判断都携带有HaeⅡ甲基化酶基因。甲基化酶的测定按以下步骤操作甲基化酶的测定为了测定甲基化作用，需要制备以下三种溶液10×甲基化作用缓冲液0.5M Tris PH7.5、100mM EDTA、50mM巯基乙醇。
甲基化作用反应混合液新鲜配制，供分析一种无性系用100μlλDNA(浓度500μg/ml)，100μl10X甲基化作用缓冲液，1μl 100mMS-腺苷甲硫氨酸，800μl蒸馏水。
2X HaeⅡ转化缓冲液50mM Nacl、40mM Mgcl2、15mM巯基乙醇。
用以下步骤制备细胞抽提物把100ml供检测的无性系培养物加入含有100μg/ml浓度氨苄青霉素L-肉汁中37℃生长过夜，并在4Krpm下离心5分钟，使其细胞沉淀。弃掉上清液，把沉淀块重新悬浮于5ml的起声缓冲液中(10mM Tris〔PH7.5〕、10mM巯基乙醯、1mM EDTA)。悬浮后，加入0.5ml含有10μg/ml浓度溶菌酶的超声缓冲液。此悬浮液被混旋且放置冰上1小时。取1ml样品转移到Eppendorf管中，温和超声处理二次、每次10秒钟，使细胞破裂。在微型离心机上离心30秒钟，此上清液用作细胞抽提物。
为了测定该抽提物，把甲基化反应混合液分配到5支试管中。第一管150μl，其余的4管每管102.5μl。在第一管中加入7.5μl细胞抽提液，混匀，然后取出47.5μl加入到第二管中，混匀，以此类推。因此，在第一管中每微克DNA接受了1μl细胞抽提液，而第二管中的每微克DNA接受了0.3μl细胞抽提物，第三管为0.1μl抽提物/μg DNA，等等，现在每支试管都有100μl溶液。把它们温育于37℃下1小时，然后加热到72℃10分钟以便停止反应。在每一管中加入100μl2X转化缓冲液和25单位HaeⅡ限制性酶。再把这些溶液温育于37℃下1小时，然后用凝胶电泳法分析每管中的20μl样品。发现，这类无性系的每克湿重细胞胶状物能合成大约5000单位的HaeⅡ甲基化酶。
12.限制性基因无性系还发现上面(第11节)鉴别过的、携带有HaeⅡ修饰性甲基化酶基因的这类无性系也带有HaeⅡ限制性核酸内切酶基因。这是在体外通过核酸内切酶的测定得知的。操作如下核酸内切酶的测定为了测定核酸内切酶的活性，需要制备以下两种溶液10X HaeⅡ限制性核酸内切酶缓冲液100mM Tris(PH7.5)、100mM Mgcl2、100mM巯基乙醇、500mM Nacl。
消化反应混合液新鲜制备供分析1种无性系用100μlλ-DNA(500μg/ml)、100μl 10XHaeⅡ限制性核酸内切酶缓冲液、800μl蒸馏水。
以上面(第11节)叙述的方法制备供甲基化作用测定用的细胞抽提物。为了测定此抽提物，把消化反应混合液分配到6支试管中，第一管150μl，其余5管每管102.5μl。在第一管中加入7.5μl抽提物，混合，从中取出47.5μl加入下一管，混匀，以此类推。因此第一管中的每微克DNA接受1μl细胞抽提物，第二管中每微克DNA接受0.3μl抽提物，第三管为0.1μl抽提物/μgDNA，等等。现在，每管都含有100μl内容物。把这些管温育于37℃下1小时，然后用凝胶电泳法分析各管中的20μl样品。发现这类无性系的每克湿重细胞胶状物能合成大约3000单位HaeⅡ限制性核酸内切酶。
在用噬菌体作试验时，发现这类无性系只轻度地抵抗噬菌体的感染得知λ噬菌体的平面培养效率是在0.1-0.5之间。(无性系4m-1〔图2和3〕例外。在无性系4m-1上其λ噬菌体的平面培养的效率低于10-4)。
实例ⅡHaeⅡ限制性基因和修饰性基因的高效表达1.在实例1中获得一个无性系叫做pHaeⅡ4-11(图3和4)，用作进一步分析和高效表达，因为这种无性系具有最简单的结构。图4表明在这个无性系中插入的两个HindⅢ片断的简化的限制性图谱。这个图谱是通过常规的双酶解程序来确定的。
2.为了实现高产(图5和6)而设计两个不同步骤。这两个步骤涉及到把HindⅢ连接到一种含有强有力的启动子调节成份上，以至于当这种启动子被解阻遏时，这种限制性基因和修饰性基因就以异常高的速率转录。这种高效表达系统以前曾描述过。
3.第一步，在一个片断上用HaeⅢ切除与一用段末端为pBR322DNA连接在一起的HindⅢ片断来切开这种4-11质粒。用BamHⅠ消化其载活pGW7(美国菌种保存中心〔ATCC〕，40166，也可从新英格兰生物实验室获得)且用DNA聚合酶充填其BamHⅠ粘性末端。对于HaeⅡ质粒而言，让12.5μg质粒DNA与80单位HaeⅢ限制性核酸内切酶在10mM Tris(PH7.5)、10mM Mgcl2、10mM巯基乙醇、50mM Nacl液中混合，并使其最终体积达500μl。对于pGW7质粒而言，让12.5μg质粒DNA与80单位BamHⅠ限制性核酸内切酶在相同的缓冲液中混合，但其最终体积为250μl。把这两种消化物37℃温育1小时，然后在72℃下加热10分钟以终止其消化，随后用聚合酶充填这种BamHⅠ消化物。作法如下在100μl BamHⅠ消化液中加入30μl 5XdNTP贮存液(25mMdCTP、25mMdGTP、25mMdTTP)，5μl 10X聚合酶缓冲液(100mM Tris〔PH7.5〕、100mM Mgcl2、10mM DTT，500mM Nacl)、7.5μl蒸馏水和7.5μl大片断DNA聚合酶。把这种反应溶液于20℃温育反应15分钟，然后，取出4.5μl此液与45μl4-11质粒消化液、10μl 10X连接作用混合液(在实例Ⅰ第三节叙述过)和5μl T4DNA连接酶一起混合。把这种连接反应溶液于20℃温育3小时。然后，取出10μl这种连接作用液转化E.Coli RR1且平面培养在含有氨苄青霉素L-琼脂平皿上。
该培养平皿在30℃下温育过夜把整个连接作用液做成8个培养平皿S每个平皿约有250个菌落把整个连接作用液做成8个培养平皿，每个平皿约有250个菌落，即是说，总共约有2000个重组体。把这些培养物收集一起，用前述制备初级质粒库那样的方法(参看实例1的第4节第5节)制备质粒库。用HaeⅡ限制性核酸内切酶消化这种质粒库，以便有选择地破坏不携带HaeⅡ修饰性基因的重组质粒。(在每一种消化作用物中加入2.5单位核酸外切酶Ⅲ以降低假存活体的本底)。接着转化E.Coli RRⅠ，将其平面培养于含有氨苄青霉素的L-琼脂平皿上。在30℃下温育，挑选出存活的菌落，并用微量制备方法(参后实例Ⅰ第10节)纯化这些菌落所携带的质粒，然后用消化和凝胶电泳法分析这些质粒。图5概述了整个实验设计且表示一些存活体消化物的凝胶电泳图谱。
用这种方法分离的一个叫做pHaeⅡ7-11的无性系，发现按方向B携带这卅HaeⅡ基因，这与PL启动子有关系。其他几个无性系，典型的是pHaeⅡ7-6X无性系，按另一方向A携带这种基因。已样测了7-11和7-6X两种无性系，以确定当其外部启动子PL受温度诱导而被抑制时究竟是哪一种无性系和或两者都高产核酸内切酶和甲基化酶。其诱导实验如下法进行10ml的这类无性系培养物在含有100μg/ml浓度氨苄青霉素的L-肉汁中30℃下生长过夜。第二天早晨把各个无性系培养物加入500ml新鲜L-肉汁中稀释50倍，在30℃温育箱中振摇培养。温育约6小时后，从每一培养物中取出200ml，在590nm(oD590)下测定其光密度，且在10Krpm下离心15分钟收集取出的细胞。把每个培养物的剩余部分转到43℃下，PL启动子解阻遏。在这一温度下激烈3小时后，再在590nm(oD590)下，测定每种培养物的光密度，且再用离心法收集200ml这种培养物。把所有这些细胞沉淀块储放于-20℃下，直至对其进行常规测定。
为了测定甲基化酶和核酸内切酶的活性，沉淀块融化并重悬于含有1mg/ml浓度溶菌酶的足量超声缓冲液中，使其约达50OD590。把这种细胞悬浮液放置冰上1小时，然后用上述方法(参看实例1第11和12节)超声处理和测定。
把培养物移至高温下，发现无性系pHaeⅡ7-11能高产这种HaeⅡ限制性核酸内切酶和HaeⅡ修饰性甲基化酶。这种7-11无性系的每克湿细胞胶状积生产高达106单位核酸内切酶和3×104单位修饰性甲基化酶。相反，当其PL启动子解阻抑时，pHaeⅡ7-6X无性系的这两种酶的都低产。低产是和这种质粒中这两种基因都与PL启动子反向相一致。
pHaeⅡ7-11无性系是一种新的、很有用的无性系，从中可以大量提纯HaeⅡ限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶。
4.把HaeⅡ基因连接到高效表达的启动子PL上的第二种实施方案已设计出和执行了。这种方法比在最后章节谈到的方法简单而更可靠，但这种方法内在一个方向上产生无性系，已证明它所获得的方向B是人们所希望的。图6概述了这种方法。这种方法是用pGW10作表达载体(ATCC40167，也可从新英格兰生物实验室获得)，而且通过在含有四环素的L-琼脂平皿上直接选择来分离出这种所希望的无性系。这种方法已产生出几个高产质粒，其中一个是pHaeⅡ10-3。在用温度诱变后，无性系10-3的行为好似无性系7-11，而且像无性系7-11相似的水平高产甲基化酶和核酸内切酶。
图7总结了上述高产和低产质粒的结构，还列出其酶产量的图表。
实例ⅢTaqⅠ限制性基因-修饰性基因的克隆1.DNA的提纯为了制备Thermus Aguaticus YT 1(ATCC25104)的DNA，把5克新鲜生长细胞的块重悬于20ml25%蔗糖、50mM Tris(PH8.0)溶液中，再加入10ml 0.25M EDTA(PH8.0)，和6ml含有10mg/ml浓度的溶菌酶(溶于0.25M Tris〔PH8.0〕)。此悬浮液放置冰上2小时，然后再加入24ml溶胞作用混合液(1% Triton X-100、50mM Tris〔PH8.0〕、67mM EDTA缓冲液)和5ml10% SDS，混匀，使细胞发生溶胞作用。加入70ml刚平衡过的(苯)酚，摇荡使其溶液乳化。再加入70ml氯仿。然后在10Krpm下离心此混合液30分钟，把上层含有DNA的粘性液转移到新容器中，用(苯)酚/氯仿液重复抽提二次以上。把上层DNA溶液转移入做成的透析管，对1×DNA缓冲液(10mM Tris、1mM EDTA、pH.8.0)换液透析四次，超过24小时。
把透析的DNA溶液转移入烧杯中，加入1/100体积的、浓度为10μg/ml的RNase，使其最终浓度达100μg/ml。把这种混合溶液温育在37℃下1小时，消化其RNA。加入5M Nacl溶液，使其最终浓度为0.4M。加入0.55体积的异丙醇到这种混合液的顶部，成层。用玻璃棒从这种混合液中缠绕出DNA，然后把其溶解在15ml的1×DNA缓冲液中，储放于4℃下。
2.部份消化这种已纯化的DNA用BamHⅠ滴定至部份消化，操作如下把2.0ml浓度为100μg/ml的DNA(溶于10mM Tris〔PH7.5〕、10mM Mgcl2、10mM巯基乙醇、50mM Nacl缓冲液中)分配到10支管中，每管200μl。在第一管中加入200单位BamHⅠ，使达到10单位/微克DNA;在第二管中加入100单位BamHⅠ，(5单位/微克)，如此类推，即是每下一管中的BamHⅠ的量只是上一管中的一半。把这些试管温育在37℃下1小时，然后加热至72℃15分钟以终止其反应。从每管中取出10μl消化物，进行琼脂糖凝胶电泳分析。当这种部份消化的片断是供克隆用时，就要挑选那些消化适中但又不完全的试管内含物。(这些试管是含有1.25单位BamHⅠ/微克DNA、0.63单位/μg，0.3单位/μg和0.15单位/μg的。把这四种溶液混合一起，像下面所述使用)。
3.连接把片断状的DNA连接到pBR322上，操作如下把6.7μg经BamHⅠ部份消化的T.aquaticus的DNA(67μl)与2.5μg经BamHⅠ切开的和去磷酸酯酶的pBR322(25μl)混合起来。加入25μl10×连接作用混合液(500mM Tris〔pH7.5〕、100mM Mgcl2、100mM DTT、5mM ATP)和133μl的无菌蒸馏水，使其总体积达250μl。按每一毫升本液，加入5μl浓度为4×10单位的T4DNA连接酶，17℃下温育4小时。然后，加入20μl氯仿短时间地摇荡和离心后终止其反应，把此溶液消毒。取出100μl这种溶液与1.0ml SSC/Cacl250mM Nacl、5mM Na(itr-ate(柠檬酸钠盐)、67mM(Cacl2)在冰上混合。然后加入2.0ml冰冷的有活力的E.Coli RR1细胞。把这种混合液放在43℃下加热5分钟后，再加入10mlL-肉汁稀释且在37℃下温育4小时。
4.初级细胞库把这种被转化的培养物短时间离心一下，弃掉上清液。软化把其细胞沉淀块重悬于2.0ml L-肉汁中，以每份200μl平面培养于10个含有100μg/ml浓度氨苄青霉素的Luria-琼脂平皿上。在37℃下温育过夜后，每个平皿用2.5ml的10mM Tris〔pH7.5〕、10mM MgCl2液冲洗，把转化的菌落收集一起形成初级细胞库。
5.初级质粒库用如下步骤制备初级质粒库把2.5ml的初级细胞库接种到含有100μg/ml浓度氨苄青霉素的500ml L-肉汁中。在37℃下摇荡过夜后，在4Krpm下离心5分钟。弃掉上清液，在室温下把其细胞沉淀块重新悬浮于10ml25%蔗糖、50mM Tris pH.8.0液中。加入5ml0.25M EDTA pH8.0，接着加入3ml溶于0.25M Tris，pH8.0，浓度为10μg/ml的溶菌酶。把此溶液放置于冰上1小时，然后用吸管加入12ml溶胞作用混合液(1% Triton X-100、50mM Tris，pH8.0、67mM EDTA)且轻轻混旋细胞悬浮液达溶胞程度。把这种溶胞的混合物转移到一个50ml的塑料离心管中，在4℃下17Krpm离心45分钟。用吸管取出22.0ml上清液移入到一个50ml的带帽塑料管中。加入20.0克固体Cscl(氯化铯)和1.0ml溶于10mM Tris，pH8.0、1mM EDTA、100mM Nacl缓冲液中的、浓度为5mg/ml的溴乙啶。轻轻地摇荡试管直至所有CsCl溶解为止，然后把此溶液转移到两个5/8英寸×3英寸聚异分体超速离心管中。封闭好此管后在Ti 70转子的离心机上在17℃下50Krpm离心42小时。为了收集这种质粒，用外科手术刀刺破此离心管的顶部，在紫外光下用注射器收集两条中较低一条荧光DNA带。把两管中的这种较低层带合并，并用等体积的冰冷正丁醇抽提4次，除掉其溴乙锭。
把这种抽提液转移到透析管内，对1X DNA缓冲液透析4次达24小时(参看第1节)。然后把这种透析过的DNA溶液转移到一个预先称重过的、50ml的离心管内且测量其体积。加入5M NaCl并使其最终浓度达0.4M，然后加入2倍体积的异丙醇，混匀。把这种溶液存放于-20℃下过夜使其DNA沉淀下来。沉淀后，此溶液在0℃下15Krpm离心15分钟，弃掉上清液。让这种离心管内容物空气干燥15分钟，然后加入750μl无菌蒸馏水。在沉淀块溶解后，加入8μl 100×DNA缓冲液且把此溶液转移入Eppendorf管内，储放于-20℃下。发现这种质粒DNA的浓度为150μg/ml。
6.质粒库的消化消化这种初级质粒库以便破坏掉非TaqⅠ甲基化酶无性系，操作如下加进45μl 10×TaqⅠ缓冲液(100mM Tris pH8.4、60mM Mgcl2、60mM巯基乙醇、1M Macl)和255μl蒸馏水，把150μl的质粒DNA溶液稀释至450μl体积。把溶液分配到5个试管中前4支管中每管100μl，最后一支管50μl。在第一管中加入40单位的TaqⅠ，使每微克(μg)DNA接受8个单位的酶。第二管中加入20单位TaqⅠ(4单位/μg)，如此类推，每后面的一支管只有前面一支管的一半量。最后的一支管用作为实验对照，不加入TaqⅠ酶。每管加入50μl石腊油于这种溶液的上层防止其蒸发，然后把这五支管温育于65℃下1小时。
7.转化作用从每管取出10μl样品，照前面叙述的方法转化E.Coli RRL。操作如下从每管中取出10μl溶液与100μlSSC/Cacl2液(50mM Nacl、5mM柠檬酸钠盐(Na Citr-ate)67mM Cacl2)在冰上混合，再加入200μl冰冷的有活力的E.Coli RRL细胞。在43℃下加热摇晃3分钟后，把这种细胞/DNA混合物立即平面培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂皿上。让这些琼脂皿在37℃下温育过夜，然后进行测定。发现用TaqⅠ消化质粒库使转化体的数量(即是完整无损质粒的数量)减少了103-104倍。从这些培养皿上所存活的菌落中挑选出28个单个菌落，然后把每个菌落孵育于含有氨苄青霉素的10ml L-肉汁中，和划条培养于含有氨苄青霉素的L-琼脂皿上。
8.次级群体把剩余菌落收集一起形成次级细胞库，利用这种细胞库按制备初级质粒库所述方法制备质粒库。
9.次级质粒库的分析用BamHⅠ消化次级质粒库，且用凝胶电泳法分析它。发现在这种群体中存在的单一的、明显的5.5千碱基对的片断。
10.次级(细胞)个体的分析在这种次级细胞个体中，把28个存活的细胞集落生长成10ml的培养物(后第7节)，并用在实例1第10节中叙述的微量制备提纯程序制备它们所携带的质粒。通过TaqⅠ和BamHⅠ的消化作用分析这些质粒微量制备物。
11.甲基化酶基因无性系;发现一些被分析过的质粒随机地带有T.aquaticusDNA的BamHⅠ片断且对TaqⅠ的消化作用敏感。这些质粒是假的存活者，没有更多的兴趣。然而，发现剩余的质粒抗TaqⅠ的消化且至少带一条大约5.5千碱基长度的共同的BamHⅠ片断。其次，所有这些质粒都既带有TaqⅠ修饰性甲基化酶基因又带有限制性核酸内切酶基因。这些质粒中有一种叫pTaqⅠ18的质粒是一个最简单类型无性系的例子发现它仅携带一条5.5千碱基的BamHⅠ片断。发现带有pRaqⅠ18的细胞既大量地合成TaqⅠ限制性核酸内切酶，又大量地合成修饰性甲基化酶。
体外测定TaqⅠ修饰性甲基化酶活性的操作步骤如下甲基化酶的检测为了测定甲基化作用，要制备三种溶液10×甲基化作用缓冲液0.5M Tris，pH8.0，100mM EDTA、50mM巯基乙醇。
甲基化反混合液;100μl浓度为500μg/ml的入DNA液、100μl 10×甲基化作用缓冲液、1μl 100mM S-腺苷甲硫氨酸、800μl蒸馏水。
10X转化缓冲液0.5M Nacl、0.3MMgcl2、50mM巯基乙醇。
细胞抽提物100ml含有100μg/ml浓度氨苄青霉素L-肉汁中的培养物于37℃下生长过夜。第二天早晨在4Krpm下离心5分钟收集该细胞。弃掉上清液，把沉淀块重悬于3.6ml的超声缓冲液中(10M Tris，pH7.5，10mM巯基乙醇、1mM EDTA)。加入0.4ml含有10mg/ml溶菌酶的超声缓冲液，混旋悬浮液，并放置于冰上1小时。然后取出1ml样品转移到Eppendorf管中，轻微地超声处理二次、每次10秒钟，以便破裂其细胞。管子在微型离心机上离心30秒钟，沉淀其细胞碎屑。把其上清液转移到另一干净的Eppendorf管中且加热到65℃20分钟，再低速离心30秒钟除去其沉淀物。留下的上清液即用作为其细胞抽提物。
测定为了测定这种抽提物，要制备新鲜的甲基化反应混合液，并把其分到5支管中，第一管150μl，其余的4管各102.5μl。在第一管中加入7.5μl这种细胞抽提物，混匀，取出47.5μl加进第二管中，混匀，以此类推。因此，第一管中的每微克(μg)DNA接受1μl的细胞抽提物，第二管为0.3μl/μg，第三管为0.1μl/μg等等，每一管最终均有100μl溶液。在每管的溶液上面加上50μl石腊油形成层以防止溶液蒸发，把这些管温育于65℃下1小时。然后在每管中加入11μl 10X转化缓冲液和25单位TaqⅠ限制性酶。再把这种溶液温育于65℃下1小时，然后每管取出20μl样品作凝胶电泳分析。发现这种无性系的每克湿重细胞胶状物合成大约1×105单位TaqⅠ甲基化酶。
12.限制性基因无性系发现携带有5.5千碱基的BamHⅠ片断的无性系能合成TaqⅠ限制性框酸内切酶也能合成修饰性甲基化酶。
在体外用以下步骤测定TaqⅠ限制性核酸内切酶的活性核酸内切酶的测定为了测定核酸内切酶的活性，要制备二种溶液10X TaqⅠ核酸内切酶缓冲液100mM Tris，pH8.4、60mM Mgcl2、60mM巯基乙醇、1.0M Nacl。
核酸内切酶反应混合液100μl浓度为500μg/ml的入DNA、100μl 10X TagⅠ核酸内切酶缓冲液、800μl蒸馏水。
细胞抽提物以上述为测定甲基化酶的那种方法(参看第11节)制备细胞抽提物。
测定为了测定这种细胞抽提物，要制备新鲜的核酸内切酶反应混合液，且把其分配到5支管中。第一管150μl，其余4管各102.5μl。在第一管中加入7.5μl细胞抽提物，混匀，取出47.5μl加进下一管中，如此类推。第一管中的每微克DNA接受1μl细胞抽提物，第二管为0.3μl/μg，第三管，0.1μl/μg，如此类推，每管最终约有100μl溶液。在每管溶液上面加上50μl石腊油以防止溶液蒸发。把这些管温育于65℃下1小时。每管取出20μl样品进行凝胶电泳分析。发现这种无性系的每克湿重细胞胶状物合成2×105单位TaqⅠ限制性内切酶。在用噬菌作试验时，没发现这种无性系能抵抗噬菌体感染达到任何测定的程度发现入噬菌体的平面培养效率在0.5-1之间。
权利要求
1.克隆限制性基因的方法，包括构成一个含有这种限制性基因编码的DNA的库，分离含有这种修饰性基因无性系和筛选含有修饰性基因又同时存在限制性基因的克隆。
2.根据权利要求
1的方法，其中形成库所用步骤(a)从含有这种限制性基因的来源中提纯DNA，(b)部份地消化已纯化的DNA形成DNA片断，(c)把这种片断连接到克隆载体上，(d)用步骤(c)中的克隆载体转化寄主细胞形成初级细胞库，和(e)纯化来自初级细胞库的重组载体形成初级载体库。
3.根据权利要求
2的方法，其中DNA的来源是含有限制性基因的细菌。
4.根据权利要求
2的方法，其中克隆载体是一种质粒或病毒DNA分子。
5.根据权利要求
4的方法，其中质粒是pBR322。
6.根据权利要求
4的方法，其中寄主细胞是E.coli的hsdR-株系。
7.根据权利要求
1的方法，其中含有修饰性基因的克隆是通过用与修饰性基因相应的限制性酶完全消化库以形成消化池，把该池再次转化寄主细胞并选择含修饰性基因的克隆来分离的。
8.根据权利要求
2的方法，其中含有修饰性基因的克隆是通过用与修饰性基因相应的限制性酶完全消化载体库以形成消化池，把该池再次转化寄主细胞并选择含修饰性基因的克隆来分离的。
9.根据权利要求
8的方法，其中消化作用通过加入核酸外切酶或磷酸酯酶来补充。
10.根据权利要求
8的方法，包括附加步骤(a)从这种消化池进一步形成一个载体库，(b)用限制性酶再次消化步骤(a)中的载体库，以便形成一个消化池，和(c)选择含有从步骤(b)消化池中制备的那种修饰性基因的无性系。
11.根据权利要求
10的方法，其中根据步骤(c)重复(a)和(b)步骤，以便促进选择。
12.根据权利要求
1的方法生产的无性系。
13.根据权利要求
12的那种无性系，其中这种限制性基因为TaqⅠ编码。
14.根据权利要求
12的那种无性系，其中这种限制性基因为HaeⅡ编码。
15.供生产限制性酶和/或其相应的修饰性酶的方法，包括步骤(a)从含有这种限制性基因的来源中提纯DNA，(b)部份消化这种已纯化的DNA，以便形成DNA片断，(c)把这种片断连接到克隆载体上，(d)用步骤(c)中的克隆载体转化寄主细胞，以便形成一个库。(e)通过用限制性酶进行完全消化的方法从库中筛选含有相应于这种限制性基因的修筛性基因无性系。(f)进一步筛选步骤(e)中同时存在限制性基因的无性系。(g)培养步骤(f)中的无性系，和(h)从这种培养物中回收这种限制性酶类和/或修饰性酶类。
16.根据权利要求
15的方法，其中这种DNA的来源是含有这种限制性基因的细菌。
17.根据权利要求
15的方法，其中这种克隆载体是质粒。
18.根据权利要求
17的方法，其中这种质粒是pBR322。
19.根据权利要求
15的方法，其中这种寄主细胞是E.coli的hsd R-株系。
20.根据权利要求
19的方法产生限制性酶。
21.根据权利要求
15的方法，其中所产生的这种限制性酶是HaeⅡ，而且其DNA的来源是埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegypt-uis)。
22.根据权利要求
21的方法所产生的HaeⅡ。
23.根据权利要求
21的方法所产生的M.HaeⅡ。
24.根据权利要求
15的方法，其中所产生的这种限制性酶是TaqⅠ，而且DNA的来源是水生栖热杆菌(Thermus aquaticus)。
25.根据权利要求
24的方法所产生的TaqⅠ。
26.根据权利要求
24的方法所产生的M.TaqⅠ。
27.克隆胞嘧啶型的修饰性甲基化酶基因的方法包括在一种缺乏Rgl的E.coli的株系中构建和繁殖这种无性系。
28.根据权利要求
27的方法，其中这种E.coli株系是Rgl A缺陷株系。
29.根据权利要求
27的方法，其中这种E.coli株系是Rgl B缺陷株系。
30.根据权利要求
27的方法，其中这种E.coli株系是Rgl A缺陷株和Rgl B缺陷株。
31.根据权利要求
27的方法，其中这种无性系也为相应于胞嘧啶型的修饰性甲基化酶的限制性核酸内切酸编码。
专利摘要
在体外通过选择有抗限制性酶消化作用的无性系和筛选、鉴定含有这种限制性基因的那些无性系来无性繁殖限制性酶类和它们相应的修饰性酶类的方法。
文档编号C12R1/01GK86102277SQ86102277
公开日1986年10月1日 申请日期1986年3月1日
发明者杰弗里·格雷厄姆·威尔逊 申请人:新英格兰生物实验室公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan