细胞分离器及其制作方法

专利名称:细胞分离器及其制作方法
本发明涉及一种能由其它类型细胞中分离特定细胞的细胞分离器及其制作方法。
为了临床试验、免疫诊断及免疫治疗，常常要从含有各种类型之细胞混合物中分离某种特定类型的细胞。
然而，要从淋巴细胞中分离T细胞、B细胞、k细胞或Nk细胞时，至今尚未找到不改变细胞群体而分离出所要之细胞的方法。
日本专利公开204454(82)和140886(81)号公开了一种使用有机高分子化合物来分离和回收T细胞的方法，更具体地说，其中T细胞是使用一种颗粒状的、有酸性功能团如磺酸基、羧酸基、膦酸基及酚基团的乙烯、丙烯、氯乙烯、醋酸乙烯、苯乙烯、二乙烯苯、丙烯腈、甲基异丁烯酸的聚合物或共聚物分离的。然而，使用这种方法时，剩余的单体可对细胞产生细胞毒性作用。此外，由于颗粒的平均直径小，柱子便易于堵塞。
将交联的葡聚糖，即Sephadex 10(为Pharmacia公司之产品的商品名)用作细胞分离器的方法是已知的。在该方法中，大的和粘附的细胞如巨噬细胞和辅助细胞可被粘附到交联葡聚糖上而得以被分离，T细胞和B细胞则通过葡聚糖柱被洗脱。然而，这种方法中却是使T细胞粘附，而非粘附的辅助细胞则通过交联葡聚糖。因此，便不能得到完整的T细胞群体。
使用尼龙棉作细胞分离器的方法也是公知的富集T细胞的细胞分离方法。然而，用这种方法虽然可以得到比较高纯度的T细胞，但却改变了T细胞的细胞群体。此外，其分离能力和分离范型(图形)将随着尼龙棉的特定种类、散开尼龙棉的方式、装填尼龙棉的方法以及洗脱尼龙棉的方法的不同而改变。
因此，有必要提供一种能高选择性地、但不改变细胞群体的分离细胞的细胞分离器。
本发明的目的在于提供一种具有高选择性和重现性的、又不改变细胞群体的分离特定细胞的细胞分离器。
本发明的另一个目的是提供一种制作细胞分离器的方法。
本发明的再一个目的是提供一种分离细胞的装置，用这种装置可使细胞更易于分离，並且有高选择性和重现性。
本发明提供了一种包括含羟基磷灰石之纤维的纤维状细胞分离器。
可按本发明的方法制作纤维状细胞分离器，其包括将含羟基磷灰石和粘合剂的水成悬液纺成纤维，並在一移动的表面上收集纤维以制得纤维状羟基磷灰石。
本发明还提供了一种分离细胞的装置，其包括一个柱子以及其中所装有的本发明之纤维状细胞分离器。
本发明的细胞分离器对于回收T细胞和去除免疫抑制细胞，例如抑制性T细胞是特别有效的。使用本发明之细胞分离器可高选择性地回收T细胞而不改变细胞群体。此外，由于本发明的细胞分离器可有效地粘附抑制性免疫细胞如抑制性T细胞，故该细胞分离器亦可用于免疫治疗。
图1图解说明了制备本发明之细胞分离器的方法。
图2显示用于本发明之细胞分离器的具体装置剖面示意图。
如上所述，本发明的细胞分离器包括含羟基磷灰石之纤维的纤维状材料。在纤维中羟基磷灰石的含量较好是占25%(重量)，最好是占50%(重量)。由分离的选择性来看，构成纤维状材料的纤维最好主要由羟基磷灰石构成。然而应指出的是，如果纤维主要由羟基磷灰石组成，则其强度就会降低。为此，可在纤维内加入某种加固材料，如磷酸钙基化合物和水玻璃，以增加纤维的强度。所用加固材料中，优选的是磷酸钙基化合物，纤维中所用加固材料的量一般不超过25%(重量)。细胞分离器亦可含有水份。细胞分离器内之含水量一般为少于50%。优选的羟基磷灰石是Ca5(PO4)3(OH)。其中Ca/P之摩尔比为1.4至1.8。
构成本发明之细胞分离器的纤维之直径不受限制，但一般为1～100微米。本发明之纤维状细胞分离器的重量也不限，但一般是5克/米2～500克/米2。
本发明的纤维状细胞分离器可用一种特殊粘合剂经溶液纺丝之方法制成。所用粘合剂最好是水溶性的。为满足要求最好选用有机大分子材料。用作粘合剂最好选用含-OH、-COOH和-CONH2等功能团的水溶性线形大分子化合物。
优选的用作粘合剂的水溶性大分子化合物有聚乙烯醇、聚羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、胶原、支链淀粉(pullulan)和几丁质、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚衣康酸、聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚甲基醚、黄嘌呤胶(Xanthine gum)和瓜耳胶(guar gum)。其中最好的是支链淀粉。所用大分子化合物的分子量一般可在20000～2000000，最好是50000～1000000。这些大分子化合物可单独使用或结合使用。
用作本制作工艺之原料的羟基磷灰石最好是呈超细颗粒形式的。超细颗粒可以是棒状的，直径最好为5毫微米至1微米。这种羟基磷灰石可用已知的惯用方法制成，例如在含有钙离子的碱性溶液(PH7～11)中加入磷酸水溶液而制得。
在生产本发明之纤维状细胞分离器的方法中，是将一种含上述粘合剂和羟基磷灰石的水成悬浮液用作原料。水成悬浮液可含10～90%(重量)、较好是50～70%(重量)、最好是60～65%(重量)的水;含5～70%(重量)、更好是15～30%(重量)、最好是15～20%(重量)的羟基磷灰石;以及含5～40%(重量)、更好是15～30%(重量)、最好是20～25%(重量)的粘合剂。如果羟基磷灰石含量少于5%(重量)则所生产的纤维状材料的强度就小，反之如果羟基磷灰石的含量大于70%(重量)则水成悬浮液的粘度就会变得过高。
为增加悬浮液的流动性以改善羟基磷灰石的分散性，可根据需要在悬浮液内加入碳酸基表面活性剂、增塑剂和/或软化剂，如甘油、山梨醇、甘露糖醇、1，2-亚乙基二醇和聚丙二醇的多羟基化合物。也可以加入一种消泡剂，该试剂的加入量一般为0.01～5%(重量)。当使用上述加固材料时，可将加固材料分散于悬浮液中。但必须注意的是，如果加固材料是Ca3(PO4)2，则其可用下述的步骤制成。
水成悬浮液可于大约20～70℃的温度下制备。
使用上述水成悬浮液作原料制备本发明之纤维状细胞分离器的方法实例，将参照如下。
水成悬浮液通过供料口1进入储罐2。之后悬浮液再进入纺丝喷嘴5並用以发动机3带动的齿轮泵4从喷嘴将其喷出。由鼓风机6将空气送到空气喷嘴7並从空气喷嘴7喷出，该空气喷嘴绕于纺丝喷嘴5的外周。空气流速可在大约5～1000米/秒之间，空气温度可为大约20～60℃。可以装配许多纺丝和空气喷嘴，而空气喷嘴则可排列成行或成环状。在同时喷射水成悬浮液及空气时，水成悬浮液便纺成细纤维束8。可以借助调节空气流速将纤维直径控制在大约1～30微米内，最好是大约1～10微米内。使用较高的空气流速，则纤维的直径便会更小。当空气流速为1000米/秒时，所得纤维的直径即约为1微米。当空气流速为300米/秒和30米/秒时，则所得到的纤维直径分别为大约3～5微米和20微米。
之后将如此制得的细纤维束8用加热器9加热干燥。加热器可以是红外加热器、远红外加热器或微波加热器。用加热器9将纤维干燥並固化后，应使其中含水量达到大约10%(重量)或更少些，最好是7%(重量)或更少些。如果干燥程度不够，便不能制得由细纤维构成的纤维状材料。加热温度的改变决定于纺丝喷嘴5喷出之材料量、空气射流的温度以及空气射流的量。一般说来，加热器9的温度可在大约200～500℃之范围内(纤维温度为大约80～150℃)。如果加热温度太高，则可导致粘合剂分解。
之后再以相互交叉的方式将如此干燥后的纤维滴落在移动的收集装置11上，从而得到纤维状材料。收集装置11可以是一种金属丝筒或金属丝网带。最好使用以相反方向旋转的两个金属网筒。如果纤维滴落在两个筒的相接部分，则可制得一种呈盘绕状的纤维材料，其中交叉的纤维是三维排列的，即一种呈棉花或脱脂棉形式的纤维材料。如果纤维是落在园筒接触部分以外的其它部位，则得到一种平面纤维材料，其中交叉纤维是按二维排列的，即一种无纺织物形成的纤维材料。一种粗纱形式的纤维材料可用排成环形的许多纺丝喷嘴制得。控制收集装置的移动速度可以得到5克/米2～500克/米2的纤维材料。
这样制得的纤维材料可以绕在卷线轴13上。
最好将这样制得的、其纤维是以粘合剂相互粘合的纤维材料经烧结以除去粘合剂。烧结温度可在350～1350℃之间，较好是大约400～1200℃，最好是大约650～1100℃进行。如果烧结是在高于1350℃的温度下进行的，则羟基磷灰石分子上的羟基基团将会分解而降低细胞分离器的选择性。如果烧结是在1100～1300℃进行，则生成Ca3(PO4)2，这样就可以改善纤维的强度。
对本发明的纤维状细胞分离器的改变可包括将其与透明质酸、硫酸软骨素、几丁质衍生物、纤粘连蛋白(fibronectin)，骨粘连蛋白(osteonectin)或粘多糖(mucopotysaccharide)或其衍生物相附着以改变羟基磷灰石表面的物理化学性质和免疫学性质。这样即可以有效地改变细胞分离器的分离性质，得到一个尖锐的洗脱图形，或控制分离谱。此外，可以选择性地收集到细胞的某一特殊亚群。
一种使用本发明之细胞分离器分离细胞的装置的优选方案，可参照图2说明如下。该装置包括柱21及装于其中的纤维状羟基磷灰石22。使用这种简单结构的装置能够满意地进行细胞分离。然而，如果羟基磷灰石颗粒与纤维状羟基磷灰石一起使用，则细胞分离效果会大大改善。为此，在图2所示的优选方案中，装于柱21内之羟基磷灰石颗粒是装在纤维状羟基磷灰石下面的。羟基磷灰石颗粒的平均直径一般为1微米～2000微米，最好是50～2000微米。烧结羟基磷灰石颗粒最好在600～1350℃的温度下进行。同时优选其中Ca/P摩尔比为1.4～1.8的羟基磷灰石。为防止颗粒23漏出柱21，须在羟基磷灰石颗粒23下面的柱底部放一滤层24。滤层24可以是一般常用的塑料、玻璃或陶瓷的纤维状材料的多孔体。羟基磷灰石颗粒也可以置于纤维状磷灰石22的上面。
将含有各种类型细胞的血液样品或细胞悬浮液从柱顶加入以进行细胞分离。
使用上述本发明的装置，细胞可被分离而对其没有免疫学刺激作用，且可有高的灵敏度。分离方法非常简单，並可减少分离细胞所需的时间。一般只有用常规方法的十分之一时间。可以使用本发明的装置收集T细胞而基本上没有巨噬细胞污染。此外还可使单核细胞污染降到很小的程度。
再者，本发明的装置还可用于去除免疫抑制细胞，如抑制性T细胞，这样便可使用本装置进行免疫治疗。由体内除去免疫抑制细胞，可使病人的免疫能力得以恢复。正如下面的实施例中所描述的，可通过一个可弯曲的管子使装置直接与血管接触，用以除去免疫抑制细胞。
下面给出本发明之优选的实施例，所有实施例均旨在阐明本发明，而不应理解为对本发明的限定。
实施例1将含有9%(重量)平均分子量为200000的支链淀粉粉末、42%(重量)的羟基磷灰石颗粒(颗粒直径为5～80毫微米)、1%(重量)的分散剂(碳酸基表面活性剂)和48%(重量)的水的悬浮液于室温下剧烈搅拌，以使支链淀粉均匀地分散于水系中。之后消除掉水悬液的泡沫。使用这种悬浮液作原料，並用图1所示的设备制备平均直径为10～15微米的纤维状羟基磷灰石(Ca/p比为1.66)。然后将纤维状羟基磷灰石于1100℃烧结。
在内体积为10毫升的柱中装入0.02克玻璃棉，使所装玻璃棉体积为0.8毫升。在玻璃棉滤层上再装入依上述方法制得的0.7克纤维状羟基磷灰石(体积为1.5毫升)，由此即制成用于细胞分离的装置。
首先用生理盐水、之后用37℃的培养基RPMI-1640，最后用含有10%(重量)胎牛血清的RPMI-1640洗柱。
预先用常规的Ficoll-Isopaque比重离心方法(Ficoll-Isopaque specific gravity centrifugation method)由人的外周血中分离淋巴细胞。之后将细胞悬浮于含10%(重量)胎牛血清的RPMI-1640培养基中，细胞群体密度为1×108细胞/毫升。取其中0.4毫升加于柱顶，使之渗透到纤维状羟基磷灰石中，之后将柱于37℃保温1小时。保温后用RPMI-1640培养基洗脱细胞。
用血球计数器计数通过柱前、后的细胞群体，其回收率为58%。
实施例2在内体积为5毫升的柱中装入0.02克玻璃棉，使所装玻璃棉的体积为0.8毫升。在玻璃棉滤层上再装入0.2克例1中制得的平均直径为5～10微米的纤维状羟基磷灰石(Ca/P比为1.66)，所装体积为0.7毫升，以制成细胞分离装置。
进行实施例1所述的同样操作，所得细胞之回收率为82%。
实施例3在内体积为5毫升的柱中装入0.02克玻璃棉，所装体积为0.8毫升。在玻璃棉滤层上装入0.15克如例1方法制得的平均直径为5～10微米的纤维状羟基磷灰石(Ca/P比为1.66)，其体积为0.5毫升，以制成细胞分离装置。
进行如实施例1所述的同样操作，所得细胞的回收率为74%。
实施例4在内体积为5毫升的柱中装入0.02克玻璃棉，所装体积为0.8毫升。在玻璃棉滤层上装入0.35克于700℃烧结的、平均直径为400～500微米的羟基磷灰石颗粒(Ca/P比为1.67)，所装体积为0.4毫升。在羟基磷灰石颗粒上再装入0.15克于1000℃烧结的、平均直径为5～10微米的纤维状羟基磷灰石(Ca/P比为1.66)至所装体积为0.4毫升，制成如图2所示的细胞分离装置。
进行实施例1所述的同样操作，所得细胞的回收率为80%。
实施例5在内体积为5毫升的柱中装入0.02克玻璃棉，装至体积为0.8毫升。在玻璃棉滤层上装入0.35克于700℃烧结的、平均直径为400～500微米的羟基磷灰石颗粒(Ca/P比为1.67)，所装之体积为0.4毫升。再在羟基磷灰石颗粒上装入0.1克于1000℃烧结的、平均直径为5～10微米的纤维状羟基磷灰石(Ca/P比为1.66)，其所装体积为0.4毫升，即可制成如图2所示的细胞分离装置。
进行实施例1所述同样操作，所得细胞的回收率为84%。
比较例1在内体积为5毫升的柱中装入0.02克玻璃棉，所装体积为0.8毫升。之后装入0.8克于700℃烧结的、平均直径为400～500微米的羟基磷灰石颗粒(Ca/P比为1.67)，所装体积为0.8毫升，由此制成细胞分离装置。
比较例2制作如比较例1所述之同样的装置，不同的是用尼龙棉代替羟基磷灰石颗粒。
试验使用实施例1～5及比较例1和2的细胞分离装置，在洗脱液通过柱之后计数洗出的T细胞、B细胞和单核细胞。计数是用常规方法，使用萤光标记的抗体Leu1、Leu2或LeuM3(由日本大阪的Fujisawa医药公司购得)标记细胞，並用萤光活化的细胞分析器完成的。结果示于表1，其中列出了细胞群体中各种细胞的百分率。
表1实施例 回收率 T细胞 B细胞 单核细胞% (Leu1) (Leu12) (Leu M3)1 75 97 1.3 0.82 82 95 1.0 0.53 74 96 1.1 1.14 80 97 0.8 0.85 84 95 2.7 0.8比较例1 85 94 3.5 2.3比较例2 37 90 5.0 4.8如表1所示，本发明各实施例中被污染之B细胞和单核细胞的百分率均小于比较例的污染率。可见，本发明的细胞分离器显然比通常的细胞分离器具有更高的选择性。
实施例6～8在内体积为1毫升的结核菌素注射器内装入0.02克玻璃棉，所装体积为0.02毫升。在玻璃棉滤层上依前述次序分别装入0.4克/0.4毫升直径为400～600微米的羟基磷灰石颗粒和0.1克/0.4毫升的纤维状羟基磷灰石(直径为5～20微米)，制成如图2所示的细胞分离装置。
从正常人的外周血中用Ficoll-Isopaque比重离心方法分离淋巴细胞，取2×107个细胞悬浮于0.2毫升含10%(重量)胎牛血清的RPMI-1640培养基中。
将细胞悬液加于柱顶端，並使之渗入柱内之填料中。之后加5毫升RPMI-1640培养基通过注射器以洗脱细胞。使用萤光标记的抗体Leu2和Leu15(购自日本大阪Fujisawa医药公司)对洗脱之细胞群体进行双色染色，並用萤光活化的细胞分析器进行计数。
实施例9重复例6～8的同样实验程序，不同的是所用样品为自听神经瘤患者之外周血分离的淋巴细胞。
实施例10重复实施例6～8的同样实验程序，不同的是自上领肿瘤患者的外周血中制备样品淋巴细胞。
实施例11重复实施例6～8的实验程序，不同的是自结肠癌患者的外周血中制备样品淋巴细胞。
实施例12用生理盐水将采自正常人的外周血(内含肝素)稀释两倍，取其5毫升细胞悬液通过实施例6～7所述的注射器。之后用在Tris缓冲液内制成的氯化铵溶液溶解红细胞以分离淋巴细胞，並按实施例6～8所述的方法检测淋巴细胞的细胞群体。
试验结果表2中显示细胞群体通过柱前、后其中免疫抑制细胞的百分率。
表2实施例 过柱前 过柱后6 1.33 0.777 5.12 1.268 1.41 0.549 15.05 0.1810 1.91 0.8111 7.97 2.7312 7.49 0.26由表2可明显看出，当淋巴细胞通过本发明的细胞分离装置之后，其中的很大一部分免疫抑制细胞被除去。
实施例13用WalKer 256细胞(一种大鼠肿瘤细胞)接种10只8周令的大鼠。接种后3天由大鼠的右股部静脉采血，在其通过如实施例6～8所述的注射器后重新注入大鼠的左股部静脉内。持续循环1小时。操作中加肝素用以防止血液凝固。循环4天后，使用羊红细胞作迟发性足趾反应(delayed footpad reaction)试验。另外还记录大鼠的存活期。结果示于表3中。
表3免疫功能 存活期(天数)实验组 正常 22天对照组 减弱 15天由表3所示的结果可明显看出血细胞经通过本发明的细胞分离装置后再进入循环，则动物的免疫功能保持正常且存活期延长1.5倍。可见，本发明的细胞分离装置对于除去免疫抑制细胞也是有效的。
权利要求
1.一种由含羟基磷灰石的纤维构成的纤维状细胞分离器。
2.根据权利要求
1的细胞分离器，其中所有的羟基磷灰石基本上都是Ca5(PO4)3OH。
3.根据权利要求
2的细胞分离器，其中纤维的平均直径是1微米至100微米。
4.根据权利要求
2的细胞分离器，其中Ca/P比是1.4至1.8。
5.制作权利要求
1之细胞分离器的方法，其包括以下步骤将含有羟基磷灰石和粘合剂的水成悬浮液纺成纤维，並在移动的表面上收集纤维以制得纤维状细胞器。
6.根据权利要求
5的方法、其还包括于收集纤维之前经加热干燥纤维的步骤。
7.根据权利要求
6的方法，其还包括烧结所得纤维的步骤。
8.根据权利要求
5的方法，其中水成悬浮液含有10～90%(重量)的水、5～70%(重量)的羟基磷灰石和5～40%(重量)的粘合剂。
9.根据权利要求
8的方法，其中水成悬浮液含有50～70%(重量)的水、15～30%(重量)的羟基磷灰石和15～30%(重量)的粘合剂。
10.根据权利要求
9的方法，其中水成悬浮液含有60～65%(重量)的水、15～20%(重量)的羟基磷灰石和20～25%(重量)的粘合剂。
11.根据权利要求
5的方法，其中粘合剂选自于聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、胶原、支链淀粉和几丁质、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚衣康酸、聚环氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚甲基醚、黄嘌呤胶及瓜耳胶。
12.根据权利要求
11的方法，其中粘合剂是几丁质。
13.根据权利要求
11的方法，其中粘合剂的分子量为20000至2000000。
14.根据权利要求
13的方法，其中粘合剂的分子量为50000至1000000。
15.根据权利要求
7的方法，其中烧结是在350至1350℃的温度下进行的。
16.根据权利要求
15的方法，其中烧结是在400至1200℃的温度下进行的。
17.一种包括一个柱和权利要求
1之纤维性细胞分离器的用于分离细胞的装置。
18.根据权利要求
18的装置，其还包括置于柱之底部的滤层，含羟基磷灰石的纤维置于滤层之上。
19.根据权利要求
18的装置，其还包括装于柱内之羟基磷灰石颗粒。
20.根据权利要求
19的装置，羟基磷灰石颗粒是装在滤层之上並在纤维状羟基磷灰石的下面。
21.根据权利要求
19的装置，其中羟基磷灰石颗粒的直径为1至2000微米。
22.根据权利要求
21的装置，其中羟基磷灰石颗粒的直径为50至2000微米。
23.根据权利要求
20的装置，其中羟基磷灰石颗粒是于500至1400℃的温度下烧结的。
24.一种除去免疫抑制性淋巴细胞和/或产生免疫抑制因子之细胞的方法，其包括使含有免疫抑制性淋巴细胞和/或产生免疫抑制因子之细胞的细胞悬液通过权利要求
17至23之一的装置，从而使免疫抑制性淋巴细胞和/或产生免疫抑制因子之细胞吸附于装在柱内的纤维状细胞分离器上。
专利摘要
一种可分离细胞，特别是分离淋巴细胞的细胞分离器，其具有高度选择性和高分离效率，而又不会改变细胞的细胞群体比率。该细胞分离器包括含羟基磷灰石之纤维的纤维状材料。
文档编号C12M1/12GK87102643SQ87102643
公开日1987年12月30日 申请日期1987年3月22日
发明者鹤纯明, 森省一, 小松纪子, 藤井茂夫 申请人:东亚燃料工业株式会社, 旭光学工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan