猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种猪轮状病毒的快速检测方法以及该方法在鉴 别检测PRV与PrV、PPV、PEDV、TGEV和PRRSV中的应用。
【背景技术】
[0002] 轮状病毒（rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属成员，是引起婴幼儿和 多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原体。猪轮状病毒（porcine rotavirus，PRV)是引起 仔猪病毒性腹泻的主要病原之一，给世界各地的养猪业造成了严重的经济损失。我国猪轮 状病毒感染也非常普遍，有些地区断奶仔猪阳性率高达72%。轮状病毒基因组由11个dsRNA 片段组成，分别编码病毒6个结构蛋白和6个非结构蛋白（NSP)，病毒结构很稳定。VP6蛋 白是其重要的群抗原，属于内层衣壳蛋白，占病毒蛋白总量的51%，具有病毒特异性抗原决 定簇，而且在病毒的复制和装配过程中发挥重要的作用。RV根据其基因组结构和抗原性分 为A-G等7个组。A组、B组和C组可引起人类和动物感染，而D组、E组、F组和G组主要 引起动物感染。其中A组RV在人类和动物中感染最为普遍。
[0003] 1968年美国的Mebus等首次从犊牛粪便中分离出轮状病毒，1973年澳大利亚学者 Bishop在胃肠炎患者的十二指肠超薄切片中也发现轮状病毒，该病毒是引起婴儿及多种幼 龄动物非菌性腹泻的主要病原。目前，我国对PRV的诊断主要依赖于常规实验室诊断，其操 作过程复杂耗时，并且需要昂贵的仪器。因此，建立一种敏感性高、特异性好并能应用于早 期临床检测PRV的方法是十分必要的。传统的血清学方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA) 及胶体金技术等临床常用的检测方法很难检测出早期的PRV感染，且敏感性低。LAMP是 Notorni等发明的DNA扩增方法。由于RT-LAMP方法具有较高的敏感性与特异性，加之无需 特殊仪器设备、操作简单、检测快速等优点，该方法己被用于检测感染性病原体，其中包括 H5N1亚型禽流感病毒、乙型肝炎病毒和口蹄疫病毒等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种猪轮状病毒（PRV)反转录环节导等温扩增（RT-LAMP)检 测方法及应用，为PRV的临床诊断与流行病学调查提供了一种简单、快速、准确的分子生物 学诊断方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种猪轮状病毒RT-LAMP检测方法，包括如下步骤： 一、 建立RT-LAMP反应体系，同时设立阴性对照；所述RT-LAMP反应体系共25 ii L，包 括：模板 2 iiL，0.8 iiMFIP 和 BIP 引物各 0.5 iiL，0.2 iiM 的 F3 和 B3 引物各 0.25 iiL， 2 uL dNTP,5 mM MgS04,8 U Bst DNA polymerase和 lXThermoPol BufTer,l uL MLV反 转录酶，用灭菌水体积补足至25 y L ;所述阴性对照的模板为灭菌水； 二、 在恒温水浴锅中61-65°C反应20-60 min后，80°C终止20 min，扩增产物经琼脂糖 凝胶电泳鉴定或加入2 yL SYBR Green I染料，紫外灯下或肉眼观察结果。
[0006] 本发明的猪轮状病毒与猪A群轮状经典毒株0SU的VP6核苷酸同源性为86. 8%， 氨基酸同源性为97%，所以选用VP6基因序列设计RT-LAMP引物，建立了 PRV的RT-LAMP 检测方法，该方法可用于鉴别检测猪轮状病毒（PRV)与猪伪狂犬病毒（PrV)、猪细小病毒 (PPV)、猪流行性腹泻病毒（PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)和猪繁殖与呼吸综合征病 毒（PRRSV)。
[0007] 本发明具有如下优点： 1、根据PRV DN30209株VP6基因序列设计4条RT-LAMP引物，进行反应条件的优化，建 立能特异性扩增PRV VP6基因的RT-LAMP检测方法，通过加入SYBR Green I紫外灯下颜色 变化判断结果。该方法在62°C恒温下作用40 min，使PRV VP6基因获得了高效率的特异性 扩增，与其他猪易感病毒，如PEDV等无交叉反应；且具有极高的灵敏性，可检测到89. 5 fg/ UL的目标病毒RNA，比普通PCR的灵敏度高四个数量级；反应结束后加入SYBR Green I观 察的结果与扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果一致。
[0008] 2、将哈尔滨市周边猪场的47份临床样品RT-LAMP检测结果与已得到验证的 RT-PCR和ELISA结果进行比对，结果显示符合率为100%。
[0009] 3、本发明建立的PRV的RT-LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设 备要求低等特点，具有实地检测PRV的前景。
【附图说明】
[0010] 图1为PRV RT-LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，M，DL5000 ;1，RT-LAMP产 物；2,阴性对照； 图2为加入SYBR Green I后紫外灯下观察结果，1，RT-LAMP产物；2,阴性对照； 图3为町-1^1^反应温度优化结果，]?，015000;1-5，611：，621：，631：，641：和651：;6， 阴性对照； 图 4 为 RT-LAMP 反应时间优化结果，M，DL5000 ;1-5,20,30,40,50,60 min ;6,阴性对 昭. 图5为RT-PCR灵敏性结果，M，DL2000,1-7,10倍比稀释浓度分别为895 ng/ii L，89. 5 ng/ ii L，8. 95ng/ ii L，895 pg/ ii L，89. 5 pg/ ii L，8. 95pg/ ii L，895 fg/ ii L ;8,阴性对照； 图6为RT-LAMP灵敏性结果，M，DL5000,1-9道，10倍比稀释浓度分别为895 ng/ ii L， 89. 5 ng/u L,8. 95ng/u L,895 pg/u L,89.5 pg/u L,8. 95pg/u L,895 fg/u L,89. 5fg/ U L ;9,阴性对照； 图7为PRV RT-LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，M，DL5000 ;l-6 :PRV、PEDV、 TGEV、PPV、PRRSV、PrV;7,阴性对照； 图8为加入SYBR Green I后紫外灯下观察结果，M，DL5000 ; 1-6 :PRV、PEDV、TGEV、 PPV、PRRSV、PrV;7,阴性对照。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0012] 本发明提供了一种猪轮状病毒RT-LAMP检测方法，具体内容如下： 1材料与方法 1. 1材料 1. 1. 1病毒 猪轮状病毒（porcine rotavirus, PRV)，猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV),猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)，猪细小病毒（porcine parvovirus, PPV)，猪繁殖与呼吸综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV),伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PrV)〇
[0013] 1.1.2临床样本 2014年11月从哈尔滨市周边猪场采集47份仔猪腹泻粪便样。
[0014] 1. 1. 3主要试剂包被稀释液 0.01 mol/L PBS、1XPBST、0PD显色液、2 mol/L H2504、0.5%脱脂乳。Bst DNA聚合 酶购自于NEB公司。SYBR Green I购自于Invitrogen公司。琼脂糖购自Promega公司。 Easy Taq DNA聚合酶、标准分子质量核酸DL2000 DNA Marker购自博大泰克生物技术有限 公司。DNA标准分子量DL5000购自大连宝生物公司。DMEM细胞培养液购自GIBC0公司。飞 捷RNA提取试剂盒购自南京凯基公司。反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、RNA酶等均购自于 Sigma公司。HRP标记的羊抗兔酶标抗体购自购自武汉博士德公司。
[0015] 1.2引物设计与合成 根据GenBank中登录的PRV毒株DN30209株序列，利用RT-LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V4 (Eiken Chemical, Japan, http://www. primerexplorer. jp/e/)设 计两对町-1^1^引物？1?、81?、？3、83以及1对町-?0?引物？1、？2(表1)，以上引物均由 北京华大科技有限公司合成。
[0016] 表1弓丨物序列表
【主权项】
1. 一种猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法，其特征在于所述检测方法步骤如 下： (1) 建立RT-LAMP反应体系，同时设立阴性对照；所述RT-LAMP反应体系共25iiL，包 括：模板 2iiL，0.8iiMFIP和BIP引物各 0.5iiL，0.2iiM的F3 和B3 引物各 0.25iiL， 2ULdNTP, 5mMMgSO4,8UBstDNApolymerase和IXThermoPolBuffer,IULMLV反 转录酶，用灭菌水体积补足至25yL;所述阴性对照的模板为灭菌水； (2) 在恒温水浴锅中61-65°C反应20-60min后，80°C终止20min，扩增产物经琼脂糖 凝胶电泳鉴定或加入2iiLSYBRGreenI染料，紫外灯下或肉眼观察结果。
2. 根据权利要求1所述的猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法，其特征在于所 述最佳反应条件为62°C40min。
3. 根据权利要求1所述的猪轮状病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于所述FIP引物序 列如下：GCACAGATTCACAAACTGCAGATATATTTCATGCTACAGTTGGACT。
4. 根据权利要求1所述的猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法，其特征在于所 述BIP引物序列如下：CGCTTCCGAAACTTTAITGGCAATACCTGGTGGGAACACTG。
5. 根据权利要求1所述的猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法，其特征在于所 述F3 引物序列如下：CAAACCTAITTCCGCAAGC。
6. 根据权利要求1所述的猪轮状病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于所述B3引物序列 如下：GAATAATTGGTAATCAATTCTGTCC。
7. 权利要求1-6任一权利要求所述的猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法在 鉴别检测猪轮状病毒（PRV)与猪伪狂犬病毒（PrV)、猪细小病毒（PPV)、猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用。所述检测方法步骤如下：（1）建立RT-LAMP反应体系，同时设立阴性对照；所述RT-LAMP反应体系共25μL，包括：模板2μL，0.8μM FIP和BIP引物各0.5 μL，0.2 μM的F3和B3引物各0.25μL，2μL dNTP，5 mM MgS04，8UBst DNA polymerase和1×ThermoPol Buffer，1μL MLV反转录酶，用灭菌水体积补足至25 μL；所述阴性对照的模板为灭菌水；（2）在恒温水浴锅中61-65℃反应20-60 min后，80℃终止20 min，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定或加入2 μL SYBR Green I染料，紫外灯下或肉眼观察结果。本发明为PRV的临床诊断与流行病学调查提供了一种简单、快速和准确的分子生物学诊断方法。
【IPC分类】C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公开号】CN104694670
【申请号】CN201510122293
【发明人】李广兴, 高睿泽, 任玉东, 白云云, 黄小丹
【申请人】东北农业大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月20日