14] 为克服现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种将脐带间充质干细胞 诱导分化成多巴胺能神经元的方法，本发明还涉及培养得到的神经细胞。
[0015] 为此，本发明提供了如下方法，该方法包括如下步骤： (1) 、脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干 细胞单体按1-5X 105/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次，得到 培养的细胞； 所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2% B27(重量)，2-4mM L-谷氨 酰胺，ImM 硫代甘油，1% 非必需氨基酸（重量)，EGF 20-40ng/ml，bFGF 20-30ng/ml，80-90U/ ml青霉素，60-70 y g/ml链霉素； (2) 、预诱导分化：将步骤（1)得到的培养细胞按1~5X104/ml的细胞密度接种进行 贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终 止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加苷类诱导物，并且保持培养液中所述 诱导物的浓度为5-10 y g/mL ; 所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM~50nM的维生素 C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，l-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素， 80-100 y g/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含有0. 01M磷酸盐缓冲液（PBS)。
[0016] 所述苷类诱导物为抗氧化剂类物质，该类物质具有耐缺氧、清除自由基、抑制细胞 内钙超载的作用，可在体外可促进脐带间充质干细胞向神经元细胞分化，其通过作用于干 细胞激活了与神经细胞定向分化相关的信号通路Wnt /|3-cantine、BMPs /Smad和Nother 等，促进干细胞向神经细胞分化，或者可促进干细胞表达与神经生长、分化有关的如NGF、 NT-3和BDNF等细胞因子，这些细胞因子能诱导干细胞向神经细胞定向分化。
[0017] 在一个最优选的实施方式中，为了进一步促进脐带间充质干细胞向神经元细胞分 化的有效性例如分化效率和选择性，本发明人在一些天然苷类物质的基础上，进行了结构 改进，使得脐带间充质干细胞向神经元细胞分化的效率和选择性得到明显提高。本发明人 经过大量试验和复杂的结构分析，设计出具有如下结构式（I)~（IV)任一种所示的苷类物 质：
【主权项】
1. 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，其特征在于该方法包 括以下步骤： (1) 脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质 干细胞单体按1-5XIO5Ail接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次， 得到培养的细胞；其中所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2%B27， 2-4mML-谷氨酰胺，ImM硫代甘油，1% 非必需氨基酸，EGF20-40ng/ml，bFGF20-30ng/ml， 80-90U/ml青霉素，60-70yg/ml链霉素；和 (2) 预诱导分化：将步骤⑴得到的培养细胞按1~5XIO4Ail的细胞密度接种进行 贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时 终止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加苷类诱导物，并且保持培养液中所 述诱导物的浓度为5-10yg/mL;并且，其中所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在 此基础上还含有20nM~50nM的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，l-8mML-谷氨酰 胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100yg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含 有0.0IM磷酸盐缓冲液。
2. 根据权利要求1所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，其 特征在于：还包括步骤⑶诱导分化：将步骤⑵得到的细胞按1~5XIOVml的细胞密度 接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液， 第3-6天时终止诱导，得到神经细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上 还含有20nmol~50nmol的维生素C，30nM~40nM的维生素B1，0. 01-0. 02%的二甲基亚 砜，0.lmM2-0 -巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维细胞生长 因子，l-8mML-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100yg/ml链霉素。
3. 根据权利要求1或2所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方 法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12, 2%B27,4mML-谷氨酰胺，ImM 硫代甘油，1%非必需氨基酸，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml90U/ml青霉素，70yg/ml链霉素； 所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml 人白细胞抑制因子，8mML-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，80U/ml青霉素，80yg/ml链霉素；所述 诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生 素Bl，0. 01 %的二甲基亚砜，0.lmM2- 0 -巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性 成纤维细胞生长因子，8mML-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，lOOU/ml青霉素，100yg/ml链霉素。
4. 根据权利要求1或2所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方 法，其特征在于：在所述步骤（2)中，培养液的pH维持在7. 1-7. 7。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法培养得到的神经细胞。
【专利摘要】公开了一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法。该方法采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，其中通过加入结构改进的苷类化合物作为诱导物，成功诱导脐带间充质干细胞分化成多巴胺能神经，并且分化比例较高。
【IPC分类】C12N5-0793, C12N5-0775
【公开号】CN104789531
【申请号】CN201510140095
【发明人】安沂华, 董健伸
【申请人】安沂华
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月27日