-bb母液、EGF母液、IGF-1母液、TGF-β母液、纤维连接蛋白母液、胎球蛋白母液和β细胞素母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
[0037]重组人胰岛素母液的制备:取lg，用0.0lmol/L盐酸溶解，配成100mg/mL的母液，-20度保存。重组转铁蛋白母液的制备:取10mg，用MDM基础培养基溶解，配成2.5mg/mL的母液，-20度保存。维生素C母液的制备:取10g，用MDM基础培养基溶解，配成16.1mg/mL的母液，-20度保存。bFGF母液的制备:取10mg，用MDM基础培养基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。H)GF-bb母液的制备:取10mg，用MDM基础培养基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。EGF母液的制备:取10mg，用MDM基础培养基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。IGF-1母液的制备:取10mg，用MDM基础培养基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。TGF-β母液的制备:取10mg，用MDM基础培养基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。纤维连接蛋白母液的制备:取10mg，用MDM基础培养基溶解，配成Img/mL的母液，-20度保存。Fetuin母液的制备:取lg，用MDM基础培养基溶解，配成10mg/mL的母液，-20度保存。β细胞素母液的制备:取100 μ g，用MDM基础培养基溶解，配成10mg/mL的母液，-20度保存。
[0038]实施例三无血清的人脐带间充质干细胞培养基
无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素lmg/mL、重组转铁蛋白2yg/mL、维生素C 15 μ g/mL、人血清白蛋白
1.5mg/mL、bFGF 15ng/mL、PDGF-bb 10ng/mL、EGF 10ng/mL、IGF-1 15ng/mL、TGF-β 1ng/mL、纤维连接蛋白15ng/mL、胎球蛋白3mg/mL和β细胞素15ng/mL。
[0039]制备方法:与实施例二中的制备方法类似。
[0040]实施例四无血清的人脐带间充质干细胞培养基
无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素2mg/mL、重组转铁蛋白I yg/mL、维生素C 10 μ g/mL、人血清白蛋白2mg/mL、bFGF 15ng/mL、PDGF-bb 15ng/mL、EGF 15ng/mL、IGF-1 10ng/mL、TGF-β10ng/mL、纤维连接蛋白10ng/mL、胎球蛋白2mg/mL和β细胞素5ng/mL。
[0041]制备方法:与实施例二中的制备方法类似。
[0042]实施例五人脐带间充质干细胞在培养基中培养的形态
将Pl代HUMSC以5000个/cm2的密度接种于培养瓶中，分别用培养基1、培养基2和培养基3培养，待细胞汇合度达85%时进行传代培养，直至P5代，显微镜下观察细胞形态，结果如图2所示。从图2可知，本发明提供的培养基所培养的细胞形态更为均一，呈梭形，维持良好的干细胞幼稚状态，而其他培养基培养的细胞形态不一，并呈现出老化状态。
[0043]实施例六人脐带间充质干细胞在培养基中培养的增殖
将Pl代HUMSC以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，分别用培养基1、培养基2和培养基3培养，每3天将细胞用0.25%胰酶消化下来，收集细胞并计算数量，并以5000个/cm2的密度再次接种培养，直至P5代，根据每个代次的细胞收获数量，绘制细胞增殖曲线，结果如图3所示。从图3可知，本发明提供的培养基I所培养的细胞增殖速率更高。
[0044]实施例七人脐带间充质干细胞在培养基中培养的克隆增殖
取P3代HUMSC100个接种于1cm培养皿中，分别加入1mL培养基1、培养基2和培养基3进行培养，每3天半量换液一次，待最大的细胞克隆所含细胞数目为200个以上时，用结晶紫进行染色，肉眼计算培养皿中的细胞克隆数量，结果如图4所示。从图4可知，本发明提供的培养基I所培养的细胞克隆数量更多。
[0045]实施例八人脐带间充质干细胞在培养基中培养的表面抗原表达
取实施例五中分别用培养基1、培养基2和培养基3培养的P5代细胞，应用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原⑶59、⑶45、⑶90、HLA-DR的表达水平，结果如图5至图7所示。从图5至图7可知，培养基1、培养基2和培养基3培养的细胞表面抗原均符合人脐带间充质干细胞的表面抗原要求。
[0046]实施例九人脐带间充质干细胞在培养基中培养的成脂诱导分化潜能
取实施例五中分别用培养基1、培养基2和培养基3培养的P5代细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并添加相应的培养基1、培养基2和培养基3进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，并加入成脂诱导分化培养基(购自Life Tecnology公司，货号A10070-01)，每3天换液一次，培养3周后，用油红O进行成脂鉴定，结果如图8所示。同时，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图9所示。从图8和图9可知，本发明提供的培养基I所培养的细胞成脂诱导分化潜能更佳。
[0047]实施例十人脐带间充质干细胞在培养基中培养的成骨诱导分化潜能
取实施例五中分别用培养基1、培养基2和培养基3培养的P5代细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并添加相应的培养基1、培养基2和培养基3进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，并加入成骨分化培养基(购自Life Tecnology公司，货号A10072-01 )，每3天换液一次，培养4周后，用茜素红进行成骨鉴定，结果如图10所示。同时，用qPCR鉴定成骨细胞相关基因OPN的表达水平，结果如图11所示。从图10和图11可知，本发明提供的培养基I所培养的细胞成骨诱导分化潜能更佳。
[0048]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于:包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素0.5~5mg/mL、重组转铁蛋白1~5 μ g/mL、维生素C5~50 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~5mg/mL、成纤维细胞生长因子5~50ng/mL、血小板衍生生长因子5~50ng/mL、表皮生长因子5~50ng/mL、胰岛素样生长因子5~50ng/mL、转化生长因子5~50ng/mL、纤维连接蛋白5~50ng/mL、胎球蛋白0.5~5mg/mL和β细胞素5~50 μ g /mLo
2.根据权利要求1所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于:包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素0.5~2mg/mL、重组转铁蛋白1~4 yg/mL、维生素C 5~30 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~2mg/mL、成纤维细胞生长因子5~20ng/mL、血小板衍生生长因子5~20ng/mL、表皮生长因子5~20ng/mL、胰岛素样生长因子5~20ng/mL、转化生长因子5~20ng/mL、纤维连接蛋白5~20ng/mL、胎球蛋白0.5~3mg/mL 和 β 细胞素 5-20 μ g /mLo
3.根据权利要求2所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于:包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素lmg/mL、重组转铁蛋白2.5 μ g/mL、维生素C 16.1 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、成纤维细胞生长因子10ng/mL、血小板衍生生长因子10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、胰岛素样生长因子10ng/mL、转化生长因子10ng/mL、纤维连接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL和β细胞素10 μ g /mL。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于:所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，所述血小板衍生生长因子为H)GF-bb，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1，所述转化生长因子为转化生长因子-β O
5.根据权利要求1至3中任一项所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于:还包括1%体积百分比的非必需氨基酸。
6.根据权利要求1所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:向MDM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素母液、重组转铁蛋白母液、维生素C母液、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子母液、血小板衍生生长因子母液、表皮生长因子母液、胰岛素样生长因子母液、转化生长因子母液、纤维连接蛋白母液、胎球蛋白母液和β细胞素母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
7.根据权利要求6所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于:所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，所述血小板衍生生长因子为roGF-bb，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1，所述转化生长因子为转化生长因子-β O
8.根据权利要求1至5中任一项所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基在人脐带间充质干细胞培养中的用途。
【专利摘要】本发明提供一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基，属于干细胞技术领域，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分：重组人胰岛素、重组转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、纤维连接蛋白、胎球蛋白和β细胞素。本发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基无需进行培养瓶包被，细胞贴壁性和形态良好，细胞增殖速率高。
【IPC分类】C12N5-0775
【公开号】CN104877963
【申请号】CN201510177092
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 戴国胜, 麦锦连
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月15日