DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim,曼海姆，德国，1995)，其中按照递增优选次序，建立约50°C_ 68°C、约 52°C - 68°C、约 54°C - 68°C、约 56°C - 68°C、约 58°C - 68°C、约 60°C - 68°C、约 62°C - 68°C、约 64°C - 68°C、约 66°C - 68°C 的温度。约 64°C -68°C 或约 66°C -68°C 的温度 范围是优选的。任选地还可以将盐浓度降低至与〇.2x SSC或0.1 x SSC相应的浓度。通过 使杂交温度以约1_2°C的步长从50°C逐步升高至68°C，可以分离这样的多核苷酸片段：例 如，按照递增优选次序，其与使用的核酸分子的序列具有至少70%、或至少80%、或至少90%、 至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99% 的同一性。关于杂交的其它说明，可以在市场上以所谓的试剂盒（例如DIG Easy Hyb，得自 公司Roche Diagnostics GmbH,曼海姆，德国，目录号1603558)的形式得到。在一个优 选的实施方案中，本文中使用的术语核酸的"变体"包括这样的任意核酸序列：其在遗传密 码简并性的范围内，编码与原始核酸相同的氨基酸序列或该氨基酸序列的变体。
[0047] 在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的细胞具有与其野生型相比至少一种 酶的活性降低，所述酶催化脂肪酸的氧化反应之一，其中这优选地为选自以下的酶：月旨 肪酸辅酶A连接酶、酰基辅酶A脱氢酶、2, 4-二烯酰辅酶A还原酶、烯酰辅酶A水合酶和 3-酮酰基辅酶A硫解酶、脂肪酸输入酶（Fettsjiureimporter)或其变体。脂肪酸的β-氧 化是普遍的代谢途径，其同样允许原核和真核生物氧化脂肪酸和使得其中所含的化学能可 用于代谢。在更宽的含义上，它从将脂肪酸摄取到细胞中开始。在那里，只要条件需要它，在 大肠杆菌FadE的情况下，脂肪酸首先在辅酶A脂肪酸酯的β位置处被酰基辅酶A脱氢酶氧 化。或者，在大肠杆菌FadH中，通过借助2, 4-二烯酰辅酶A还原酶的还原，还可以从双不 饱和脂肪酸形成类似的分子。在大肠杆菌FadB中，多功能的酶，烯酰辅酶A水合酶/3-羟 基酰基辅酶A脱氢酶，然后催化水合，形成仲醇，随后将它氧化为酮。在最后一步中，在大肠 杆菌FadA的情况下，3-酮酰基辅酶A硫解酶催化酮酰基辅酶A的裂解，结果是，释放出乙 酰辅酶A和与起始分子相比缩短了 2个碳原子的脂肪酸的辅酶A酯。如果它也不是乙酰辅 酶Α，则可以将后者重新送入β氧化循环，并通过氧化而缩短。FadR也参与脂肪酸的β氧 化的调节，Fad操纵子的调苄基因，所述Fad操纵子包含脂肪酸的降解所必需的基因，但是 FadR不会催化β氧化反应。在一个优选的实施方案中，术语"催化脂肪酸的β氧化反应 之一的酶"被理解为是指这样的所有酶：其与脂肪酸底物或在通向乙酰辅酶A的途径上的 从所述脂肪酸底物形成的分子直接相互作用，优选地将它识别为底物，并催化它转化为在 该降解途径上更接近乙酰辅酶A的代谢产物，优选地包括实现将脂肪酸摄取到细胞中的脂 肪酸输入酶。例如，根据上述定义，这些酶包括酰基辅酶A脱氢酶，因为它与脂肪酸辅酶A 酯相互作用，并催化它向烯酰辅酶A的转化，所述烯酰辅酶A在β氧化的代谢途径上比脂 肪酸辅酶A酯更接近乙酰辅酶Α。在一个特别优选的实施方案中，本文中使用的术语"催化 脂肪酸的β氧化反应之一的酶"被理解为是指这样的任意酶：其选自得自大肠杆菌的基因 产物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE，和/或它们的变体或得自其它生物体的同系物。得 自大肠杆菌的基因产物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE，以及变体和许多其它生物技术上 有用的生物体的同系物，和它们的核酸-和多肽序列，被描述在现有技术中，例如在登录号 AP009048. 1下的FadA、在登录号BAE77457. 1下的FadB、在登录号BAA15609. 1下的FadD、和 在登录号BAA77891. 2下的FadE。现有技术公开了许多特别适合用于测量酶的活性的试验， 所述酶催化脂肪酸的β氧化反应之一，例如在下述文献中：K Kameda & W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707, Hi Marrakchi, W E Deffolf, C Quinn, J West, B J ?〇11221，〇￥5〇等人（2003)81〇。1^111.丄 370，1055-1062，1^13〇等>1「2001)和父￥11， T Liu, F Zhu，和C Khosla (2011) PNAS，印刷前的电子出版物。
[0048] 就根据本发明的全细胞催化剂的效率而言，有利的是，要转化的底物、优选羧酸或 二羧酸或其单酯可以容易地接触根据本发明必需的酶，所述酶位于全细胞催化剂的内部。 因此，至关重要的是，所述底物可以到达细胞的内部。为了使其变得容易，优选的是，在细 菌、尤其是革兰氏阴性全细胞催化剂的情况下，所述全细胞催化剂表达脂肪酸输入酶，特别 优选脂肪酸输入酶FadL (数据库代码：BAA16205. 1)或变体，优选地以浓度和活性与相 应的全细胞催化剂的野生型的活性相比增加。通过本领域技术人员常规地可接近的多种途 径，可以实现多肽活性与细胞的野生型相比的增加，所述途径例如：掺入在功能上与启动子 连接的编码多肽的核苷酸序列的额外拷贝，或将天然启动子置换为更强的启动子。
[0049] 已经表明，根据本发明，在下述情况下，以更高产率和纯度生产胺和二胺：优化在 全细胞催化剂中内源性地表达的酶的背景，从而降低或关闭内源酶的活性，所述内源酶在 代谢途径中降解根据本发明的方法或使用根据本发明的细胞的反应物、中间产物或产物 (优选ω-氨基羧酸、ω-羟基羧酸、ω-氧代羧酸和二羧酸的甲酯)，或者以偏离期望产物的 形成的其它方式修饰它们。在该背景下，可能有利的是，根据本发明的全细胞催化剂是这样 的细胞，其具有与它的野生型相比降低的酯酶BioH [数据库代码ΥΡ_492020. 1]或其变体 的活性。这样的具有降低的BioH活性的细胞、它们的生产和活性确定试验描述于欧洲专利 申请 ΕΡ12007663. 3 中。
[0050] 对于化合物的混合物作为使用羧酸、二羧酸或其单酯的情况，在所述化合物中，末 端羧基以高程度存在，优选地至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%以酯的形式存在，例如 因为这些底物的更好可用性或游离羧酸或二羧酸的毒性，所述单酯可以通过完全酯化的二 羧酸的部分或完全水解来提供，且所述游离羧酸通过完全酯化的羧酸的部分或完全水解来 提供。对于该情况有利的是，通过合适的酯酶的过表达来增加细胞对酯水解的能力。为此， 在一个优选的实施方案中，酯水解酶BioH或其变体的活性与使用的全细胞催化剂的野生 型相比增加，特别优选地通过过表达。然后通过酯水解原位提供相应的单酯和/或未酯化 的羧酸或二羧酸。还可以通过化学催化的水解，例如在低pH值下，实现完全酯化的二羧酸 的部分或完全水解。
[0051] 根据本发明的全细胞催化剂可以优选地用在将羧酸或二羧酸或其单酯转化成对 应胺或二胺的方法中，其中所述羧酸或二羧酸或其单酯是式（I)的化合物 R1 - A - COOR2 (I)， 其中R1选自-H和COOR 3,其中R2和R 3各自并彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，前 提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或 未被取代的、具有至少4个碳原子的烃基。在一个优选的实施方案中，A是式-(CH2)n-的结 构，其中 η 优选地是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29或30。在一个优选的实施方案中，所述羧酸或二羧酸是月桂酸或〇-羧基月 桂酸。在另一个最优选的实施方案中，所述羧酸是式CH3- (CH2) n-C00H的羧酸，其中η优选地 是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30,优选是己酸或癸酸。在另一个最优选的实施方案中，所述羧酸或二羧酸是式HOOC- (CH2)n-C00H 的二羧酸，其中 η 优选地是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29或30，优选是〇-羧基己酸或〇-羧基癸酸。在另一个最优选 的实施方案中，所述羧酸或二羧酸是ω-羧基十四烷酸。因此，根据本发明生产的胺或二胺 优选地是式CH3- (CH2) "-順2或NH 2- (CH2) η-ΝΗ2的化合物，其中η在每种情况下优选地是4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
[0052] 关于羧酸或二羧酸或其单酯和关于在本申请中描述的任意化学化合物，所述的各 个式包括各种化合物的所有盐(质子化的或去质子化的)。例如，月桂酸不仅包括质子化形 式，而且包括具有所有阳离子的月桂酸盐，例如月桂酸钠。
[0053] 根据本发明的方法要求，在水溶液中使根据本发明的方法使用的酶(任选地，以根 据本发明的全细胞催化剂的形式提供）与羧酸或二羧酸或其单酯接触。在一个优选的实施 方案中，本文中使用的术语"接触"被理解为是指，各自的酶与它的底物直接接触，尤其是在 二者之间没有插入物理屏障诸如不透性膜等。在最简单的情况下，通过将底物加入酶或全 细胞催化剂所在的水溶液中来进行所述接触。
[0054] 适合用于实现根据本发明的教导的是这样的反应混合物，其包含水溶液中的根据 本发明的全细胞催化剂8和式（I)的羧酸或二羧酸或其单酯，其中R1选自-H COOR 3,其中 R2和R3各自并彼此独立地选自Η、甲基、乙基和丙基，前提条件是，残基R2和R 3中的至少一 个是Η，其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳的烃 基，优选式-(CH2)n -，其中η是至少4,特别优选至少10。这里的水溶液例如就组成、pH 和温度而言，必须构造成使得所述溶液促进全细胞催化剂的生存力或至少催化能力至少一 定时间。本领域技术人员已知许多适合作为水溶液的水性培养基，它们适合用于维持或培 养细胞，尤其是在生物技术上重要的细胞。这些同样包括完全培养基诸如LB培养基、基本 培养基诸如M9培养基和选择性培养基，例如含有高盐浓度且因此仅允许嗜盐的或至少耐 盐的生物体的生长的那些。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语"水性培养基"被 理解为是指基于水的反应介质，其就所有有关的因素(尤其是PH、盐含量和温度）而言，被 构造成使得它会维持或促进其中所含的细胞(优选微生物）的生存力，并且水性培养基以及 疏水有机相都以液体形式存在。从微生物学和分子生物学教科书(例如Fuchs/Schlegel, 2008)，可以知悉不同的在生物技术上重要的细胞的温度需求。在一个优选的实施方案中， 在接触时，水性培养基的pH值在4-9之间，更优选在4. 5至8. 5之间，最优选在6. 5至7. 5 之间。在另一个优选的实施方案中，所述温度是在〇_45°C之间，更优选15-40?之间，最优 选在20-37?之间。所述反应混合物通常含于发酵罐中。可以被灭菌(优选高压灭菌)并允 许培养全细胞催化剂、通气和控制反应条件(例如氧含量和温度）的任何反应容器可以充当 发酵罐。
[0055] 在一个优选的实施方案中，所述反应混合物除了包括水溶液以外还包括疏水有机 相。这可以包含有机溶剂和/或疏水液体阳离子交换剂，所述阳离子交换剂用于从水溶液 中除去ω-氨基脂肪酸。合适的溶剂和阳离子交换剂描述于EP11191520.3中。
[0056] 此外，通过下述附图和非限制性实施例更具体地描述了本发明，从其中可以推知 本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
[0057] 图 I :21· 75 h 处理时间以后，菌株犬廢//磨 W3110 pACYC{Placuv5} [carA_ Ms-npt_N0C]/pJ281_alaDH_B. s._TA_C.v· (ct)的发酵液中的单胺和二胺的检测。
[0058] 实施例1 生产用于表达得自耻垢分枝杆菌的基因 MSMEG_2956和 得自诺卡氏菌属（Abcart/ia 5/7.)的基因的表达载体 为了生产用于共表达得自耻垢分枝杆菌的编码脂肪酸还原酶（ΥΡ_887275. 1)的 MSMEG_2956 (carA，SEQIDNo. 1)和得自诺卡氏菌属的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶 (ABI83656.1)(其将脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺化）的(SEQ ID No. 2)的载体， 借助于PCR扩增两个基因，插入用于重组克隆的同源区域。在这方面，供体生物体的用于扩 增基因 MSMEG_2956的基因组DNA和用于扩增基因的合成DNA片段充当模板。所述基 因是在lacuv5启动子（SEQ ID No. 3)的控制下，其同样借助于PCR从现有的载体起始进 行扩增，插入用于重组克隆的同源区域。
[0059] 在这方面，使用以下寡核苷酸： Plac_Hl_fw: 5 '-TTATGCGACTCCTGCTGGCTATGGTGGGATTTCC-3 '（SEQ ID Nr. 4) Plac_H2_rv: 5 '-GATCGTCATATGCCACTCTCCTTGGTTCC-3 '（SEQ ID Nn 5) carA_H2_fw: 5 '-TGGCATATGACGATCGAAACGCGCG-3 '（SEQ ID Nr. 6) carA_H3_rv: 5 '-TCCTTCTCTTACAGCAATCCGAGCATCT-3 '（SEQ ID Nr. 7) npt_H3_fw: 5 '-GCTGTAAGAGAAGGAGTTCTATCATGATCGAG-3 '（SEQ ID Nr. 8) npt_H4_rv: 5 '-GCAGCCTAGGTTAATTTATCAGGCGTACGCGATCG-3 '（SEQ ID Nr. 9)。
[0060] 将下述参数用于扩增Plaeuv5和基因的PCR :1 X :最初变性，98°C，0:30 min ;35 x :变性，98°C，0:10 min，退火，55°C，0:20 min ;延伸，72°C，0:15 min ;1 x :末端延伸，72°C， 10 min。为了扩增基因 MSMEG_2956,使用以下参数：1 x:最初变性，98°C，0:30 min;35 x:变 性，98°C，0:10 min，退火，65°C，0:20 min;延伸，72°C，1 min;l X:末端延伸，72°C，10 min。 为了扩增，根据生产商的推荐，使用得自New England Biolabs (Frankfurt)的Phusion? High-Fidelity Master Mix。在每种情况下，然后在1%浓度的TAE琼脂糖凝胶上拆分5〇μ1 PCR反应物。以本领域技术人员已知的方式进行PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙锭染 色和PCR片段大小的确定。在所有情况下，可以扩增预期大小的PCR片段。这些对于Plarav5而言为325个碱基对，对于MSMEG_2956而言为3. 5千碱基对，且对于耶?而言为718个碱 基对。为了从琼脂糖凝胶分离DNA，使用解剖刀从凝胶切出靶DNA，并根据生产商（Qiagen， Hilden)的说明书使用必/icA 6?/提取试剂盒纯化。根据生产商（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)的说明书，使用Geneart?无缝克隆和装配试剂盒通过重组将纯化的 PCR 产物克隆进 AcoNI-和切割的 pACYCDuet-1 载体（Merck, Darmstadt)中。以 本领域技术人员已知的方式，转化化学感受态的大肠杆菌DHlO β (New England Biolabs, Frankfurt)。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过DNA测序证实插入的基因的 真实性。完成的表达载体被称作pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc](SEQIDNo·10)。
[0061] 实施例2 生产用于共表达得自枯草芽孢杆菌的基因 aid和得自紫色色杆 菌（CXroffioAacteritt? Fio/ace腫）的基因02025的表达载体 为了生产得自枯草芽孢杆菌的编码丙氨酸脱氢酶（NP_39107L1)的基因 W (SEQ ID No. 11)和得自紫色色杆菌的编码转氨酶（NP_901695. 1)的CV_激W (SEQ ID No. 12)的大肠杆菌表达载体，将得自枯草芽孢杆菌的基因 aid (替代得自球形芽孢杆菌的 基因 aA/)克隆进大肠杆菌表达载体pJ281_alaD_Bsp_TA_C. V. (ct)(序列和生产，参见 W0/2013/024114中的实施例1和其中列出的SEQ ID No. 17)中。通过PCR从得自枯草芽 孢杆菌菌株168的染色体DNA扩增得自枯草芽孢杆菌的基因 W。在这方面，使用以下的寡 核苷酸： alaDH_pCR22_fw: 5' -ATGATCATAGGGGTTCCTAAAGAG-3' (SEQ ID No. 13) alaDH_pCR22_rev: 5' -TTAAGCACCCGCCACAGATG-3' (SEQ ID No. 14)。
[0062] 将下述参数用于PCR :1 x :最初变性，98°C，0:30 min ;35 x :变性，98°C，0:10 min， 退火，65°C，0:30 min;延伸，72°C，0:20 min;l x:末端延伸，72°C，10 min。为了扩增，根据 生产商的推荐，使用得自 New England Biolabs (Frankfurt)的 Phusion? High-Fidelity Master Mix。在每种情况下，然后在1%浓度的TAE琼脂糖凝胶上拆分5〇μ1 PCR反应物。 以本领域技术人员已知的方式进行PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙锭染色和PCR片段 大小的确定。PCR片段显示1137个碱基对的预期大小，且根据得自生产商的信息使用得自 Qiagen (Hilden)的Quick PCR纯化试剂盒由PCR积成物（PCR-Ansatz)进行纯化。为连接 PCR产物与载体，借助多核苷酸激酶（New England Biolabs, Frankfurt)将5'-磷酸连接 至PCR产物。在这方面，遵循生产商的推荐。
[0063] 将载体用限制性内切核酸酶Λ?αΙΙΙΙ和消化，并由此除去包含的基因/式展芽 廣//磨W。在1%浓度的TAE琼脂糖凝胶上拆分限制酶切消化的积成物。可识别具有5696 bp和1124 bp大小的2个带。为了从琼脂糖凝胶分离载体DNA，使用解剖刀从凝胶分离5696 bp的DNA带，并根据生产商的信息使用得自Qiagen (Hilden)的Quick Gel Extraction Kit进行纯化。为了制备平头末端，使用DNA聚合酶I (New England