本发明进行修饰/改变，这些包含 在本发明的技术范围内。本发明的范围由权利要求书确定。
[0064] 1.多肽制备与确认
[0065] 实施例中使用的多肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，由上海吉尔生化有 限公司合成，该多肽的表征可通过氢谱和质谱确认合成了所述多肽。液相色谱法检测纯 度：95. 27% (面积归一法）：质谱法检测（ESI-MS):计算分子量：2074. 31，测试值2074. 22。
[0066] 2.检测器件的制各
[0067] 检测芯片是以SJ改性硅胶（iPDMS薄膜）为固体支撑材料，在其上通过点样固定 多肽溶液制备而成。改性硅胶是在传统的聚二甲基硅氧烷材料中加入带烯烃末端的、表面 引发聚合反应的引发剂，并通过热交联（硅氢键键合）固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构 中，得到SJ改性硅胶，其制作过程如图1所示。
[0068] 其中的A和B为聚二甲基硅氧烷的两个组分，聚二甲基硅氧烷 (Poly(dimethylsiloxane), Sylgard 184)购买自美国道康宁（DowCorning)公司，包含 液态组分A(成分为金属钼催化剂与带乙烯基的二甲硅氧烷高分子前体混合物）和交联 剂B(成分为带有乙烯基和Si-H基团的二甲基硅氧烷前体）两种成分。C为末端带乙 烯基的引发剂，购于杭州东伟公司。最后修饰上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯单 体（01igo(ethylene glycol)methacrylate，以下简称 0EGMA，分子量 Mw = 526)购买于 Aldrich。将聚二甲基硅氧烷前体A和交联剂B与带乙烯基末端的引发剂C以A :B:C= 10 : 1 :〇. 5比例充分混合。通过固化反应制成透明的弹性硅橡胶，然后通过SIP技术进行表面 修饰即可得到SJ改性硅胶。实验表明，SJ改性硅胶的表面有足够高密度的、通过共价键固 定的引发剂，其可以通过表面引发聚合反应（SIP)实现表面高分子修饰。使用poly(OEGMA) (聚乙二醇甲基丙烯酸酯）进行反应获得聚乙二醇（Polyethylene Glycol,PEG)修饰的表 面，实现较强的抗蛋白非特异性吸附的能力。
[0069] 制好的SJ改性硅胶薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0070] 采用晶S?PersomlArrayerTM 16个人点样仪在改性硅胶上制备多肽微阵列， 过程为：
[0071] 1)预处理
[0072] 将SJ改性硅胶薄片（15X 15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去离子水淋洗 3次，用氮气吹干，马上用于点样。
[0073] 2)点样
[0074] 将点样液稀释好并转移到384孔板相应的微孔中，将带样本的384孔板置于点样 仪基台上，同时将预处理的改性硅胶薄片置于点样仪的基台上，马上进行点样。点样环境条 件为室温（25°C )，湿度设定为50%。制成的多肽微阵列上每个点的点样量约为0. 6nL，样 点半径为200 μ m。
[0075] 3)化学固定
[0076] 刚制好的多肽微阵列要放在恒温恒湿箱（26°C，60%湿度）中固定至少6h。化学 固定过程如下：
[0077] 首先通过点样仪将包含有捕获多肽分子的缓冲液点在改性硅胶薄膜上，接着缓冲 液开始蒸发，捕获多肽分子与SJ改性硅胶表面亲密接触并相互作用，通过化学结合，改性 硅胶表面的ploy (OEGMA)高分子的末端-COOH与多肽分子的-一順2形成稳定共价键，进而 将有化学活性的多肽分子固定在SJ改性硅胶表面。
[0078] 4)装配
[0079] 固定6h的多肽微阵列必须在两天内装配好。首先通过背胶将SJ改性硅胶薄片贴 在专门的反应柱上，盖上反应腔体。一个反应器由两个反应柱和一个反应腔体组成。
[0080] 5)保存
[0081] 装配好的多肽微阵列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，备用。
[0082] 3.用检测器件讲行检测
[0083] 检验步骤
[0084] 1、开始检测前，将浓缩洗液按1 :10的比例加入纯化水或蒸馏水进行稀释，稀释完 成后得洗液，直接使用，使用移液枪将2mL洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分钟，保证芯片表 面被完全浸润。
[0085] 2、将待测血清样本用样本稀释液按照1 :40稀释混匀。
[0086] 3、弃去浸泡芯片的洗液，在芯片表面完全湿润的状态下，每个血清样本吸取 200 μ L稀释后的血清加入到芯片反应器内。
[0087] 4、将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温 孵育30分钟。
[0088] 5、弃去芯片反应器内的血清样本，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
[0089] 6、清洗完成后，每个芯片反应器分别加入200 μ L酶标二抗溶液，将芯片反应器放 入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。
[0090] 7、弃去芯片反应器内的酶标二抗溶液，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3 次。
[0091] 8、可预先将发光底物液A和发光底物液B以等体积混合均匀，得发光底物混合溶 液（45分钟内使用）。待清洗完成后，取下反应腔体，每个芯片表面分别加入15 μ L发光底 物混合溶液，使发光底物混合溶液能均匀的铺于芯片表面。
[0092] 9、将加入了发光液的芯片置于凝胶成像仪中化学发光成像，并判读结果。
[0093] 健康正常人血清、肠道病毒71型感染病人血清及其他疾病病人血清样本由合作 医院提供，疾病标准均经过临床检验确证，均获得了提供者的知情同意书。
[0094] 阴性对照有PBS缓冲液（即在第3步中不用待测血清孵育，而用PBS溶液孵育，其 余步骤相同）的对照，血清稀释液的对照，及阴性血清（指健康人及非肠道病毒71型感染 病人的血清）的对照。
[0095]多肽微阵列的点样模式如图2所示：其中，黑色圆形的16个点的样本为人IgM，作 为定位点；正方形的4个点的样本为PB点样液，作为实验的空白对照；白色圆形点的样本 是其他的肠道病毒71型自身抗原蛋白多肽，作为检测指标（这些多肽有响应说明被检测的 血清中有肠道病毒71型自身抗体）；星形点的样本多肽为本发明的多肽，它是肠道病毒71 型自身抗原蛋白多肽，会对肠道病毒71型感染患者血清产生响应。
[0096] 使用该多肽微阵列按照上述检测步骤对肠道病毒71型感染病人血清及阴性对照 进行了检测，响应模式如图3~4所示：其中，图3显示了阴性对照的检测结果，只有黑色 圆形所示的点的样本有响应。图4显示了肠道病毒71型感染病人血清的检测结果，黑色圆 形、白色圆形和星形点的样本有响应。需要说明的是，仪器测得信号值由低到高，相应的信 号点颜色由黑一红一白渐变。
【主权项】
1. 一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，即：FTEMAAPLKSPSAEACGYSD。2. -种检测器件，其包括： 固体载体，以及 连接于该固体载体上的权利要求1所述的多肽。3. 根据权利要求2所述的检测器件，其中，所述固体载体是SJ改性硅胶。4. 根据权利要求2所述的检测器件，其用于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊 断。5. -种检测试剂盒，其包括权利要求2~4中任一项所述的检测器件。6. 根据权利要求5所述的检测试剂盒，其用于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊 断。7. 权利要求1所述的多肽在制备检测试剂盒中的用途。8. 根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒用于肠道病毒71型的早期筛查 和临床辅助诊断。9. 根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒包括权利要求2~4中任一项所 述的检测器件。
【专利摘要】本发明涉及多肽、包含多肽的检测器件、以及包含检测器件的诊断试剂盒。将本发明应用于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断，能够取得令人满意的效果。
【IPC分类】C07K7/08, G01N33/569, G01N33/68
【公开号】CN104945482
【申请号】CN201410852500
【发明人】马雄明
【申请人】苏州偲聚生物材料有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年12月31日