5] 图11为鸭疫里默氏杆菌微量凝集实验图片。在1:8、1:16、1:32和阳性对照孔里 均可见凝集颗粒；1:64孔内无凝集颗粒。
【具体实施方式】
[0046] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进 行详细的描述。
[0047]W下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第=版，J.萨姆布鲁克等 著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0048] 部分氨基酸相应的缩写如下：
[0049] 谷酷胺ginQ;甘氨酸glyG;丝氨酸serS巧氨酸alaA;苏氨酸thrT;鄉氨酸 valV;异亮氨酸ileI;亮氨酸leuL;酪氨酸tyrY;苯丙氨酸地eF;组氨酸hisH;脯氨 酸proP;天冬酷胺asnN;甲硫氨酸metM浴氨酸gluE;色氨酸trpW;赖氨酸lysK;半 脱氨酸cysC;精氨酸argR;天冬氨酸AspD。
[0050] 下述稀释的方式是W体积比方式进行。
[0化1] 实施例1鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的制备 [0化2] 1主要实验材料
[005引 质粒T-VectorpMD19 (^simple)，PrimeSTAR?MaxDNAPolymerase,均购自大 连宝生物工程有限公司；原核表达质粒祀T32a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli D册a、表达宿主菌E.coliBL2UDE3)和RA-CH-1菌株，由四川农业大学禽病研究中屯、提 供。
[0054] 2实验方法
[005引 2. 1RAOmpH基因的克隆
[0056] 2. 1.1引物设计
[0057]根据GenBank上RA-CH-1OmpH基因序列，利用PrimerPremiers. 0 软件设ir| 对 引物。如SEQIDN0:3 所示的上游引物：5'-GGATCCATGAAAAAATTAAGCGTATTGTTTGC-3'（戈1| 线部分为BamHI位点）；如SEQIDN0:4 所示的下游引物：5'-CTCGAGATTTTACATTATTGAGA TGCCCTATTG-3'(划线部分为化0I位点）。引物合成后，W适量灭菌去离子水溶解，使其终 浓度为20mmol/l，-20°C保存备用。
[0化8] 2. 1. 2RA基因组DNA的提取
[0059]a、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株（RA)的培养：取冻干保存的菌种，用2血膜蛋白腺 大豆肉汤培养基（TSB)稀释，然后接种于血平板，C〇2条件下37°C恒温静置18~2化（菌落 呈圆形，微凸起，边缘整齐，奶油状，菌落直径2mm;显微镜下观察菌体呈短粗型）。经过菌落 观察和镜检，挑取单个菌落于膜蛋白腺大豆肉汤培养基TSB(含1%小牛血清）中培养。
[0060] b、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株（RA)的扩大培养；将培养过夜的鸭疫里默氏菌菌液 按1:100接种到含1%小牛血清的膜蛋白腺大豆肉汤培养基（TSB)中，37°C水浴振荡培养致 细菌生长到对数生长期。
[0061] C、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株（RA)DNA的提取，具体步骤如下；（1)取生长到对数 期的菌液1ml力巧Ij1ml离屯、管，12000巧m离屯、2min，弃上清。0)加入567y1TEBuffer、 30y110%SDS和3y1蛋白酶K，37°C水浴比，溶解沉淀。（3)加入等量的酪/氯仿抽提 DNA，12000巧m离屯、5min，取上清。重复该步骤一次。（4)加入等量氯仿/异戊醇提DNA， 1200化pm离屯、5min，取上清。（5)加入两倍体积的无水己醇洗，10%体积的3mol/L的醋酸 钢，冰浴30min，1200化pm离屯、15min，弃上清。（6)用70 %的己醇洗漆沉淀两次，弃上清。 (7)室温下自然干燥沉淀DNA，加入适量TE(P服.0)溶解沉淀DNA，-20°C保存备用。
[006引 2. 1. 3PCR扩增鸭疫里默氏杆菌OmpH基因
[006引 PCR反应体系如表1所示；
[0064]表1PCR反应体系
[00 化]
[0066] 轻轻混匀，4000r/min瞬时离屯、后进行PCR。
[0067]反应参数；95°C5min，然后进入 94°C40s、55°C40s、72°C60s，共 30 个循环，最后 72°C延伸lOmin，于4°C保存备用。取5ylPCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片 段的长度。
[0068] 2. 1. 4鸭疫里默氏杆菌OmpH基因PCR产物的回收
[0069] 按OMEGA公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA贬存于-20°C保存备用。
[0070] 2. 1. 5纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH基因与PMD19-T的连接
[0071] 连接反应体系如表2所示：
[0072] 表2连接反应体系
[0073]
[0074] 将上述试剂加入PCR反应管中，小屯、混匀，瞬时离屯、后，于16°C连接过夜。
[0075] 2. 1. 6D册a感受态细胞的制备
[0076] 采用氯化巧法制备新鲜的D册a株大肠杆菌感受态细胞，简述如下；（1)无菌挑取 平板上新鲜培养的D册a单克隆菌落接种于5mLLB培养液中，于37°C振荡培养过夜；（2) 取1血上述培养液接种于100血LB培养液中，37°C20化/min振荡培养2. 5~化，使0D600 =0. 4~0. 5左右；（3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离屯、管中，冰浴lOmin; (4)于 4°C4000r/min离屯、lOmin，弃上清；（5)加10血冰预冷的0.Imol/L的化化，温和悬起细菌 沉淀，冰浴30min; (6)于4°C4000;r/min离屯、lOmin，弃上清，力日4mL冰预冷的0.Imol/L的 化Cl2再次重悬沉淀，加入终浓度为15 %的灭菌甘油化C12,混匀后分装为100y1/管，4°C 冰箱中保存过夜W提高转化效率。
[0077] 2. 1. 7转化感受态细胞
[007引将10y1连接体系全部取出加到100y1畑5a感受态细胞中，冰浴30min;再置 于42°C温浴90s，之后再冰浴2min;然后立即加入890y1LB培养基，37°C水浴振荡培养 45min，取200y1涂于含Amp的培养基上，置37°C培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌 落接种于含Amp的LB液体培养基中，37°C水浴振荡培养1她后进行质粒抽提。
[0079] 2. 1.8质粒的抽提
[0080] 按OMEGA公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贬存于-20°C保存备用。 [OOW] 2. 1. 9重组质粒的PCR和酶切鉴定
[008引将上一步抽提的重组质粒命名为pMD19-0mpH，分别WBamHIAhoI双酶切消化 与化0I单酶切消化、BamHI单酶切消化，酶切体系见表3所示，1. 0%凝胶电泳观察结果。 同时做PCR扩增目的基因。
[0083] 表3单酶切和双酶切的体系
[0084]
[0086] 2. 1. 10鸭疫里默氏杆菌OmpH基因序列测定
[0087] 将酶切鉴定正确的质粒寄送上海英駿生物有限公司进行测序。
[008引 2. 2原核表达质粒祀T32a-0mpH的构建、诱导表达与表达条件的优化
[0089] 2. 2. 1原核表达质粒祀T32a-〇mpH的构建与鉴定
[0090] a目的片段的酶切与连接；限制性内切酶BamHI和化0I分别双酶切pMD19-〇mpH 质粒和原核表达载体祀T32a(+)，酶切体系如表4所示；
[OOW]表4pMD19-〇mpH质粒和原核表达载体祀T32a(+)的酶切体系
[0092]
[009引 37°C水浴化，按OMEGA的DM胶回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照表 5连接体系16°C连接过夜。
[0094] 表5连接体系
[0095]
[0096]b重组质粒的转化；采用氯化巧法制备D册a感受态细胞。之后，取连接液10y1 加到含100y1感受态D册a的离屯、管中，混匀后冰浴30min;置于42°C水浴90s，然后迅速 冰浴2min;加入不含Amp的LB液体培养基890y1，37°C振摇（15化/min)培养1~1.化； 取200y1培养物涂布于含Amp的LB平板，37°C培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL含 Amp的LB液体培养基中，37°C培养12~16h，同时设立空载体转化组（空载体10y1+感受 态D册a100iU)、无载体对照组（灭菌超纯水10y1+感受态D册a100iU)。
[0097] C菌液的PCR鉴定；
[009引 W重组质粒菌液为模板，SEQIDNO: 3所示的上游引物：5'GGATCCATGAAAAAAT TAAGCGTATTGTTTGC-3'（划线部分为BamHI位点）；如SEQIDN0:4所示的下游引物：5'-牲CGAGATTTTACATTATTGAGATGCCCTATTG-3^ (划线部分为化0I位点）。进行PCR反应，其方法 和扩增条件同上，取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳检测。
[0099] d重组质粒的酶切和PCR鉴定；将上述保存的克隆菌种接种于5血含Amp的LB 液体培养基中，37°C水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用化0I单酶 切、BamHI和化0I双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如表6所示：
[0100] 表6酶切体系中各组分的含量
[0101]
[0102] 经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒祀T32a-〇mpH。
[0103] 2. 2. 2重组表达质粒祀T32a-〇mpH的诱导表达
[0104]a重组质粒祀T32a-〇mpH的提取；挑取已鉴定含阳性重组质粒祀T32a-〇mpH的 D册a菌种划线接种于含Amp的LB琼脂平板上，37°C培养过夜，次日取单个菌落接种于含 Amp的LB液体培养基中，剧烈振荡培养10~1