化
[0214] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原并按最佳包被条 件包被，分别用1%BSA、5%BSAU0%BSA和5%的脱脂奶粉封闭，然后进行间接化ISA试 验，每个样本重复检测3次，选择最优的封闭液，结果如表11所示。1%BSA封闭液封闭后 检测出的阳性值最高，故选择该浓度的封闭液作为本方法的最佳封闭液。
[021引表11封闭液的优化[0216]
[0218] 4 一抗和二抗结合时间的优化
[0219] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原并按最佳包被 条件包被，用最佳封闭条件封闭，然后进行间接化ISA试验，一抗和二抗分别反应120min、 90min、60min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优的反应时间，结果如表12和表13 所示。0D450nm值均随着一抗和二抗反应时间的增多而升高，故一抗和二抗的作用时间均选 择 120min。
[0220] 表12 -抗结合时间的优化
[0221]
[0224] 5酶标抗体最适浓度的确定
[022引结果见表14,当酶标羊抗鸭抗体IgG作1:400体积稀释时，P/N值最大为 30. 17647,因此确定最佳酶标抗体体积稀释倍数为1:400。
[0226]表14酶标抗体最佳工作浓度的确定
[0227] 悦2引 6TMB显色时间的优化
[0229] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原并按最佳包被 条件包被，用最佳封闭条件封闭，然后进行间接ELISA试验，TMB的底物显色时间分别为 10min、20min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优显色时间。结果如表15所示，TMB 在37°C反应lOmin效果最优，故本方法的最优底物显色时间为lOmin。
[0230] 表15TMB底物显色时间的优化
[0231]
[0232] 7阴阳性临界值判定标准的确定
[0233] 用上述优化的各化ISA条件对20份RA阴性血清样品进行检测，所得结果 如表16所示。X值为0. 23535,SD值为0. 045833,确定阴阳性临界点为X+3SD= 0. 23535+3X0. 045833 = 0. 37。
[0234] 表16RA阴性血清检测结果
[0235]
[0236] 因此，鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为鸭疫里默氏杆菌抗体捕获剂的间接 ELISA方法为：用8ug/mL鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白4°C包被过夜，1 %BSA于37°C封闭 30min，1:100稀释的待检血清37°C作用120min，1:400稀释的酶标二抗37°C作用120min， TMB显色lOmin，若待测样品的0D450皿值大于0.37时判定为阳性，小于或等于0.37时则 判定为阴性。
[0237] 8特异性试验
[023引按已建立的间接化ISA方法对包括鸭疫里默氏杆菌血清在内的7种病原阳性 血清分别进行测定，结果如表17所示，除鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC 11845株阳性血清和 RA-CH-2阳性血清W外，其余5种阳性血清的0D450nm值均小于0. 37,表明除鸭疫里默氏杆 菌RA-ATCC 11845株和RA-CH-2株阳性血清W外，该抗原不与上述其它5种病原阳性血清 发生交叉反应，由此说明建立的W鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原检测RA抗体的 ELISA方法具有较好的特异性，且该重组蛋白能够作为RA-CH-1、RA-ATCC 11845和RA-CH-2 不同血清型RA抗体检测的通用抗原。
[0239] 表17特异性实验结果
[0240]
[0241] 9稳定试验
[0242] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白包被constar酶标板，按照 建立的间接化ISA方法检测5份待检血清，每份血清样品重复5孔；再用实施例2制备纯化 的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白包被5个不同批次的constar酶标板检测5份待检血清。 通过所得每份血清的0D450nm值计算出平均0D450nm值及标准方差（SD)，再计算出每份血 清的批内及批间变异系数（CV)，结果如表18和表19所示，批内重复试验5组血清变异系数 均值为1. 9098%，且每组变异系数低于10%，批间重复试验5组血清的变异系数平均值为 3.0066%，且每组变异系数均低于10%，由此说明本研究建立的基于鸭疫里默氏杆菌OmpH 重组蛋白的间接化ISA方法具有较好的稳定性。
[0243] 表18批内重复试验
[0244]
[0245] 表19批间重复试验
[0246]
[0248] 10敏感性试验
[0249] 同一份血清样本分别进行琼扩试验、玻片凝集试验、微量凝集实验和破碎RA-CH-1 全菌的化ISA检测并与本方法比较。琼扩试验不能出现沉淀线，故无法判定抗体效价。玻 片凝集实验的效价为1:8(如图10)。微量凝集实验的效价为1:32(如图11)。破碎后的全 菌ELISA效价为1 ;6400。利用本实验方法的结果如表20所示，随着RA-CH-1阳性血清稀 释度的增加〇D450nm值下降，当稀释倍数为1:41600时，血清检测结果低于阴性值，因此，用 本研究制备的纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原最低可检测到的阳性血清稀 释倍数为1:20800。
[0巧日]表20敏感性实验结果
[0巧1]
[0252] 上述实施例为本发明优化后的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例 的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简 化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白，其特征在于鸭疫里默氏杆菌OmpH 重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。3. -种基于鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA 试剂盒包括固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液、终止液，所述抗体捕获剂为 权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白。4. 根据权利要求3所述的基于鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的ELISA试剂盒，其特征 在于：所述抗体捕获剂为浓度彡8. 0 y g/mL的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白。5. 根据权利要求3所述的基于鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的ELISA试剂盒，其特征 在于：所述酶标二抗为作400倍体积稀释的羊抗鸭IgG-HRP。6. 根据权利要求3所述的基于鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的ELISA试剂盒，其特征 在于：封闭液为1% BSA。7. 权利要求3~6任一项所述的ELISA试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法，其特 征在于：所述方法还包括平行的阴性实验，具体为： A、 将鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结 合的抗原及杂质，得固相抗原； B、 将待检血清通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗 原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质； C、 将所述酶标二抗与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原一抗体一二抗复合物； D、 在步骤C所得抗原一抗体一二抗复合物加入TMB底物显色液避光显色后，加入2mol/ LH2SO4终止液终止反应得显色样品液； E、 将步骤D所述显色样品液用酶标仪测0D450nm值，待检血清的0D450nm值> 阴性样 品0D450nm值的临界值X+3SD时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品0D450nm值 的均值，SD为阴性样品0D450nm值的标准方差。8. 根据权利要求7所述的ELISA试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法，其特征在于： 具体步骤为： 1) 将浓度彡8. 0 y g/mL的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液 封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原； 2) 将待检血清作100倍稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤1)所得 固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质； 3) 将羊抗鸭IgG-HRP作400倍体积稀释后的酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合 物结合，得抗原一抗体一二抗复合物； 4) 在步骤3)所得抗原一抗体一二抗复合物加入底物显色液避光显色后，加入终止液 终止反应得显色样品液； 5) 将步骤6)所述显色样品液用酶标仪测0D450nm值，待检血清的0D450nm值> 0? 37 时则为阳性，反之则为阴性。9. 根据权利要求8所述的ELISA试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法，其特征在于： 步骤1)中所述鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白、步骤2)中所述稀释血清及步骤3)中所述 酶标二抗稀释液的加入量为等体积。10.根据权利要求8所述的ELISA试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法，其特征在 于：步骤1)中所述鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白与固相支持物连接的条件为4°C包被过 夜。步骤2)中稀释血清的保温反应时间和步骤3)中酶标二抗的结合时间均为120min。步 骤4)中的TMB底物显色时间为IOmin。
【专利摘要】本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白及其ELISA试剂盒，属于生物工程领域。本发明所述ELISA试剂盒由固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液组成，所述抗体捕获剂为鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；检测方法包括：固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色、检测并判定几步骤；本试剂盒特异性、敏感性及稳定性好；本检测方法操作简单。
【IPC分类】C07K14/195, C12N15/31, G01N33/569, G01N33/68
【公开号】CN104987369
【申请号】CN201510333609
【发明人】程安春, 高群, 汪铭书, 朱德康, 杨乔, 陈孝跃
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月16日