6小时，离屯、收集菌液，按OMEGA质粒DNA小 量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。
[01化]b重组质粒祀T32a-〇mpH转化表达菌；采用氯化巧法制备E.coliBL21 (DE3)感受 态细胞，并将重组质粒祀T32a-〇mi)H转化到表达宿主菌E.coliBL2UDE3)中。
[0106] C重组质粒祀T32a-〇mpH的诱导表达；从上述LB固体培养基上挑取阳性克隆菌接 种LB液体培养基，37 °C培养过夜，次日取菌液按1:50的比例接入含Amp的LB液体培养基 中，剧烈振荡培养至0D600 = 0. 4时，加入IPTG诱导培养，收集1血培养菌液，4°C1300化/ min离屯、2min，弃上清，沉淀中加入40y1超纯水和10y1 10XSDS上样缓冲液，100°C水浴 加热变性lOmin，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。
[0107]d重组质粒pET32a-〇mpH表达产物的可溶性分析；将于37°C和IPTG= 0. 4mmol/ L诱导表达过夜的重组质粒祀T32a-〇m抑表达菌液和空载体表达的菌液，分别按下步骤 处理；4 °C，lOOOOr/min离屯、5min，菌体沉淀用20血20mmolTris-肥1 (P服.0)悬浮； 置-20°C过夜后，超声波（冰浴）间歇破碎菌体化00w，30sec/次，10次），4°C，10000r/min 离屯、lOmin，取上清备用①；沉淀用10血尿素液（lOmmol/LPBS+2mol/L尿素）悬浮，4°C， 100(K)r/min离屯、lOmin后，沉淀再次用lOmL洗液悬浮，重复洗漆S次后，用适量尿素溶液 (lOmmol/LPBS+8mol/L尿素）溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶 液溶解的沉淀②，向其中加入40y1超纯水和10y1 10XSDS上样缓冲液，100°C水浴加热 变性lOmin，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮藍染色后，观察结果。
[0108] 2. 2. 3重组质粒祀T32a-〇mpH表达条件的优化
[0109]a诱导剂IPTG的浓度优化；取含重组质粒祀T32a-〇mpH的表达宿主菌化21 0E3)， 接种于含Amp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB 液体培养基中，37°C培养培养至0D600值约0. 4时，取其中4只试管，分别加入IPTG至终浓 度为0mmol/L、0. 4mmol/L、0. 8mmol/L、1. 2mmol/L37°C诱导化后，按上述方法对样品进行 处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。
[0110] b温度条件优化：取含重组质粒祀T32a-〇mpH的表达宿主菌化21 0E3)，接种于含 Amp的5mLLB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液 体培养基中，37°C培养培养至0D600值约0. 4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓 度为0. 4mmol/l，分别置于25°C、30°C、37°C诱导化，按上述常规方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。
[01C诱导时间优化：取含重组质粒祀T32a-0mpH的表达宿主菌化21 0E3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养 基中，继续培养至OD600值约0. 4时，加入IPTG至终浓度为0. 4mmol/l，37°C分别诱导0、5、 7、9h，吸取1血培养液，按上述方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。
[0112] 2. 3鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的大量制备与纯化
[0113] 2.3. 1鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白的大量制备（上清处理）
[0114] 将诱导表达的500血菌液于4°C100(K)r/min离屯、lOmin，将菌体沉淀用40血 20mmolTris-HCl(p服.0)悬浮；超声波（冰浴）间歇破碎菌体（200w，30sec/次，5~10次）， 4°ClOOOOr/min离屯、lOmin。取上清，4°C保存备用。
[0115] 2. 3. 2鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的纯化
[0116] 镶琼脂糖凝胶（Ni2+-NAT)亲和层析纯化鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白；根据融合 蛋白的6-His标签对镶离子特殊的亲和作用，使带有标签的融合蛋白能够结合于镶琼脂糖 凝胶上，改变洗脱液的条件将其洗脱，而达到纯化的目的。具体操作步骤为：
[0117] (1)装柱；镶琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL;
[011引 似平衡：用平衡缓冲液约5个床体积平衡层析柱，流速为ImL/min;
[0119] 做上样：将0. 45ym滤膜过滤的可溶性上清蛋白样品约50mL，加入层析柱中，流 速为 0. 4mL/min；
[0120] (4)洗漆；用平衡缓冲液再洗2-5个床体积，流速为ImL/min;
[0121] (5)洗脱；分别用含20、200、250mmol咪挫的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，流速为 ImL/min，收集各梯度的洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
[0122] (6)清洗；用超纯水洗5个柱床体积，再用25%的己醇洗3个柱床体积，流速为 ImL/min，回收镶琼脂糖凝胶柱，于4°C中保存。
[0123] 3实验结果
[0124] 3. 1鸭疫里默氏杆菌Om抑基因的扩增、T-克隆与鉴定结果 [01巧]3. 1. 1鸭疫里默氏杆菌OmpH基因的PCR扩增结果
[01%]WRA-CH-1基因组DNA为模板对OmpH基因进行PCR扩增，其产物经1. 0%琼脂糖 凝胶电泳，获得了一条约66化P的特异性DNA条带（图1)。
[0127] 3. 1. 2鸭疫里默氏杆菌OmpH基因T克隆鉴定结果
[0128]PCR产物经胶回收纯化后，与PMD19-T(simple)载体连接并转化感受态细胞 D册a，得到的T克隆命名为pMD19-〇mpH。对pMD19-〇mpH进行PCR、酶切（图2 ;重组质粒 pMD19-〇mpH用BamHI和化0I双酶切得到两个片段，小片段的分子量大小约为66化P)和 测序鉴定，结果表明T克隆所获得的OmpH基因DNA序列（SEQIDNO: 2所示）同已知的鸭 疫里默氏杆菌RA-CH-1的OmpH基因DNA序列完全一致。
[0129] 3. 2原核表达质粒祀T32a-〇mpH的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果
[0130] 3. 2. 1重组表达质粒祀T32a-〇mpH的构建与酶切鉴定
[0131] 用BamHI和化0I双酶切T克隆质粒后回收目的片段，与经相同酶切的祀T-32a 表达载体进行连接并转化D册a，得到重组表达质粒祀T32a-〇mpH，经BamHI和化0I双酶 切后得到两条片段，化OI、Ba恤I单酶切后得到一条片段，且大小与理论值相符，表明重 组原核表达质粒构建成功（图3)。
[0132] 3. 2. 2重组质粒祀T32a-〇mpH的诱导表达
[0133] 诱导空载体祀T-32a(+)转化菌株在约20kDa处出现一特异性蛋白条带，为载体本 身标签蛋白大小；重组表达质粒祀T32a-〇mpH表达的重组融合蛋白在大约38kDa处，与理论 值相符；另外，表达蛋白可溶性分析结果显示其主要存在于上清中，说明重组表达蛋白在菌 体中W可溶的形式存在（图4)。
[0134] 3. 2. 3重组质粒祀T32a-〇mpH表达条件的优化
[0135] aIPTG浓度的优化；在37°C条件下，加入IPTG使其终浓度分别为Ommol/L、 0. 4mmol/L、0. 8mmol/L、l. 2mmol/L诱导培养化，结果显示；未加诱导剂的对照管无特异性 蛋白条带；随IPTG浓度的增高，当IPTG= 1.2mmol/L时表达量最大（图5)。因此，选择 1. 2mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。
[0136]b诱导温度条件的优化；IPTG终浓度为0. 4mmol/L，分别于25百、301：、371：诱导 化，结果显示，当温度在30°C和37°C时，诱导蛋白量较少，而当25°C时最高，因此，选择温度 25°C作为最佳诱导温度（图6)。
[0137]C诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.4mmol/L，37°C条件下，分别诱导化、5K化、 化，结果化时即有大量的蛋白表达，而诱导化-7h的重组蛋白表达量不大（图7)，因此，选 择化作为最佳诱导时间。
[0138] 实施例2鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的纯化
[0139] 将实施例1制得的含有鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白的表达产物经过收集菌体、 超声波破碎、收集上清等一系列处理后，镶琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组Om抑重组蛋白。 蛋白样品过柱纯化后的UV曲线图显示出3个峰，峰1为穿透峰，峰2为200mmol咪挫洗脱 峰，峰3为250mmol咪挫洗脱峰。同时收集不同浓度咪挫洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳，检验 纯度及浓度，结果显示；在250mmol咪挫洗脱峰中含有大量高纯度的Om抑重组蛋白（图8)。 将纯化的Om抑重组蛋白经超滤管浓缩后，用核酸蛋白仪测定蛋白的终浓度，分装后备用。
[0140] 实施例3鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的Western-blot(蛋白免疫印迹）
[0141] 一、实验方法
[0142] 将实施例1获得的含有鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为检测鸭疫里默氏杆菌 血清抗体的探针。
[0143] 1SDS-PAGE凝胶配制
[0144]1. 1 12%分离胶的配制
[0145]去离子水 1215ul，1.5MTris-HC1(PH= 8. 8)950ul，10%SDS37.加1,10%AP 37. 5ul，TEMED1.加1,30%丙締酷胺 1. 5ml。
[0146] 1.2 5%浓缩胶的配制
[0147]去离子水 700ul，1.0MTris-HCl(PH= 6. 8) 12加 1，10 %SDS10.Oul，10 %AP 10.Oul，TEMED1. 0ul，30%丙締酷胺 16加