1。
[0148] 2蛋白样品的处理
[0149] 在蛋白样品中加入适量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（0. 5MTriS-HC1(PH= 6. 81. 2ml)，甘油 1ml，去离子水 4. 8ml，10%SDS2. 0ml，0. 1%BPB0. 5ml)d100°C煮沸lOmin 后lOOOOr/minlOmin。
[0巧0] 3电泳
[0151] 待胶冷却到室温后，把蛋白样直接上到SDS-PAGE孔内，lOOv电泳90min。
[01巧 4转膜
[0153] 按照电转S明治的安装顺序安装，70v90min。
[0154] 5 封闭
[0巧5] 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的洗漆液中，漂洗2min。
[0156] 6-抗的解育
[0157] 一抗为兔抗鸭疫里默氏杆菌高免血清按1:200稀释，4°C解育过夜，然后用PBS洗 漆3次。
[0158] 7二抗的解育
[0159] 二抗为KPL公司HRP标记的羊抗兔IGg按照说明书1:3000稀释，4°C解育lh，PBS 洗漆3次。
[0160] 8底物显色
[0161] 加入酶底物显色液，用去离子水终止反应，膜自然惊干，保存于暗处。
[0162] 二、实验结论
[0163] 通过Western-blot蛋白免疫印迹实验，鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白能够与鸭 疫里默氏杆菌的阳性血清产生良好的反应原性（如图9)，可作为检测鸭疫里默氏杆菌血清 抗体的探针或捕获剂。
[0164] 实施例4鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为鸭疫里默氏杆菌抗体捕获剂的间接 ELISA试剂盒
[01化]鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为鸭疫里默氏杆菌抗体捕获剂的应用主要通过 间接化ISA试剂盒进行说明。
[0166] 固相载体；固相载体在化ISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可 作化ISA中固相载体的材料很多，如聚苯己締，其必须满足具有较强的吸附蛋白质的性能， 抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，可制成各种形式。ELISA载体的形 状主要有S种；微量滴定板、小珠和小试管。W微量滴定板最为常用，专用于化ISA的产品 称为化ISA板，国际上标准的微量滴定板为8X12的96孔式。为便于作少量标本的检测， 有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是 可W同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动 化仪器用于微量滴定板型的化ISA检测，包括加样、洗漆、保温、比色等步骤，对操作的标准 化极为有利。
[0167]抗体捕获剂；由于鸭疫里默氏杆菌的培养环境及营养要求较高，不利于培养，易被 污染。所W，本发明中采用的抗体捕获剂为实施例2纯化后的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋 白。
[016引酶标二抗；本发明中采用的酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊 抗鸭IgG)，也可采用其他非鸭动物的抗鸭IgG-HRP(如兔抗鸭IgG-HRP)，除了W辣根过氧化 酶标记，也可W采用其他酶标记，如磯酸醋酶。
[0169] 底物；底物可选用四甲基联苯胺（TMB)、邻苯二胺、2, 2-联氮基-双-(3-己基苯并 唾挫咐-6-横酸）二氨盐（ABT巧及其他HRP有色结合物作为底物。当采用其他酶标记时， 可采用与其有色结合物作为底物。由于本发明的酶标二抗采用的是羊抗鸭IgG-HRP，所W其 底物为TMB。
[0170] 封闭液：封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗 体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不 相关的蛋白质充填该些空隙，从而排斥在化ISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的 手续与包被相类似。最常用的封闭剂是牛血清白蛋白、小牛血清或明胶作为封闭剂的，脱脂 奶粉也是一种良好的封闭剂。
[0171] 终止液：本发明采用的是2mol/LH2SO4。
[0172] -实验方法
[017引 1间接化ISA步骤
[0174] ①将纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白用包被液稀释至终浓度为8.Oug/ml， 依次加入酶标板中，100y1/孔，4°C包被过夜；
[0175] ②洗漆S次，弃液体，于每孔中加入300y1封闭液，37°C封闭30min;
[0176] ⑨洗漆S次，弃液体，将各待检血清稀释后并上样，100y1/孔，37°C解育30min;
[0177] ④洗漆S次，弃液体，于每孔加入稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，100y1/孔， 37°C解育 30min;
[0178] ⑥洗漆S次，弃液体，于每孔加入TMBlOOyl，避光显色20min，然后加入终止液 50y1/孔，轻拍混匀，用酶标仪测0D450nm值。
[0179] 2抗原最佳包被浓度及抗体最适稀释倍数的确定
[0180] 将鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白用包被液倍比稀释并包被酶标板，100y1/孔； 将RA阳性和阴性血清分别用抗体稀释液体积倍比稀释后加入酶标板中，lOOyl/孔。W方 阵法进行试验，选择P/N(阳性血清0D450nm值/阴性血清0D450nm值）最大时的OmpH重 组蛋白包被浓度和血清稀释倍数作为最佳抗原包被浓度和最适抗体稀释倍数。
[0181] 3抗原包被时间的优化
[0182] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原并按最佳包被浓 度分别4°C包被过夜、37°C解育比后4°C包被过夜和37°C解育化后4°C包被过夜，然后进 行间接化ISA试验，每个样本重复检测3次，选择最优的抗原包被时间。
[0183] 4不同封闭液的优化
[0184] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原并按最佳包被条 件包被，分别用1 %BSA、5%BSA、10%BSA和5%的脱脂奶粉进行封闭，然后进行间接化ISA 试验，每个样本重复检测3次，选择最优的封闭液。
[0185] 5 -抗和二抗结合时间的优化
[0186] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原并按最佳包被 条件包被，用最佳封闭条件进行封闭，然后进行间接ELISA试验，一抗和二抗分别反应 120min、90min、60min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优的反应时间。
[0187] 6酶标抗体最佳工作浓度测定
[0188] 根据已确定的抗原最佳包被浓度和抗体最适稀释倍数，将羊抗鸭IgG-HRP(辣根 过氧化酶标记的羊抗鸭IgG，购自美国KPL公司）作不同体积倍数（1:50、1:100、1:200、 1:400、1:800、1:1600, 1:3200,1:6400)稀释并进行间接化ISA试验，每个稀释度重复4次， 求出平均P值和N值，从而确定羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗的最佳工作浓度。
[0189] 7TMB显色时间的优化
[0190] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原并按最佳包被条 件包被，用最佳封闭条件进行封闭，然后进行间接ELISA试验，TMB的底物显色时间分别为 10min、20min、30min，每个样本重复检测3次，选择最优的显色时间。
[0191] 8阴阳性临界值判定标准的确定
[0192] 取20份RA阴性鸭血清，按照上述建立的间接化ISA方法进行检测。将20份阴性 样品的0D450nm值的平均值狂）和3倍标准方差（SD)之和作为阴性样品值的上限，即待检 样品的0D450nm值 > 阴性样品0D450nm值的临界值狂+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性。
[0193] 9特异性试验
[0194] 用已建立的间接化ISA方法分别检测鸭病毒性肝炎病毒值HV)阳性血清、禽流 感病毒（AIV)阳性血清、鸭沙口氏菌（Salmonellabacillus,SB)阳性血清、鸭大肠杆菌 巧.coli)阳性血清、鸭肿头症病毒阳性血清、鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC11845株和RA-CH-2 株阳性血清，W检测其特异性，每份血清样本重复检测3次。
[01巧]10稳定试验
[0196] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白包被constar酶标板，按照 建立的间接化ISA方法检测5份待检血清，每份血清样品重复5孔，判定批内重复性。再用 实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白包被5个不同批次的constar酶标板 检测5份待检血清，判定批间重复性。
[0197] 11敏感性试验
[019引将RA阳性血清进行体积倍比稀释，用已建立的间接ELISA试验进行检测，同时用 琼扩试验、玻片凝集试验、微量凝集试验W及破碎的RA-CH-1的全菌化ISA进行检测，所有 检测试验重复操作3次，取平均值，比较其敏感性。
[0199] 二实验结论
[0200] 1抗原（抗体捕获剂）包被浓度和血清稀释度的确定
[0201] 通过方阵滴定试验，鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1阳性血清和阴性血清的检测结果分 别如表7和表8所示，当抗体捕获剂的包被浓度为8ug/mU血清稀释体积倍数为1:100时， 阳性血清0D450皿值为0. 417,相应的阴性血清0D450皿值为0. 044,如表9所示P/N值最 大巧.477)。因此，抗体捕获剂最佳包被浓度为8ug/mU血清最适体积稀释倍数为1:100。
[0202] 表7阳性血清检测结果
[0203]
[0209] 2抗原包被时间的优化
[0210] 用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白作为抗原并按最佳包被浓 度分别于4°C包被过夜、37 °C解育比后放4°C包被过夜和37 °C解育化后放4°C包被过夜，然 后进行间接化ISA试验，每个样本检测3次，结果如表10所示。直接放4°C包被过夜后检测 出的阳性值最高，且测定的数值比较稳定，故选择该条件作为本方法的最佳抗原包被条件。
[0211] 表10抗原包被条件的优化
[0212]
[0213] 3不同封闭液的优