检测口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片以及检测方 法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD)、水泡性口炎（Vesicular stomatitis, VS)分别是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV)、水泡性口 炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV)引起的哺乳动物的急性、高度接触性传染病， 其中，口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV)有3种分型，具体是口蹄疫病毒 0型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型。口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒都可以感染猪， 发病率极高，并能够形成大范围的流行，能引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组 织（OIE)列为法定报告动物疫病。这两种疾病均以猪舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上 皮发生水疱为主要症状，因此在临床症状上无法对这两种疾病进行区分，必须通过病原学 进行鉴别诊断。
[0003] 目前，对这两种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长， 也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别两种病毒的方法。因此，有 必要建立能同时进行两种疫病快速检测的方法，同时对口蹄疫病毒进行分型检测。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测口蹄疫病 毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片和试剂盒。
[0005] 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、CDNA、gen〇mi C DNA、多肽、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本发明检测口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片，它包括固相载体以及 固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1~4所示任意一个或者任意多个基 因片段，用于分别检测口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/或水泡 性口炎病毒。
[0007] 其中，它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :13~14所示。
[0008] 本发明检测口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的试剂盒，它包括前述的基因芯片 以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO :5~6、SEQ ID NO :7~8、SEQ ID NO :9~ 10和/或SEQ ID NO :11~12所示引物对，用于扩增口蹄疫病毒0型、口蹄疫病毒A型、口 蹄疫病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒。
[0009] 其中，所述引物对中，上游引物与下游引物的摩尔比为1:1。
[0010] 其中，所述SEQ ID NO :5、7、9、11所示上游引物标记有荧光染料。
[0011] 本发明还提供了 SEQ ID NO :1~4所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检 测口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒的基因 芯片的用途。
[0012] 其中，所述基因芯片还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :13~14所示。
[0013] 本发明还提供了 SEQ ID NO :5 ~6、SEQ ID NO :7 ~8、SEQ ID NO :9 ~10 和 / 或 SEQ ID NO :11~12所示引物对以及SEQ ID NO :1~4所示任意一个或者任意多个基因片 段所示基因片段在制备检测口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/ 或水泡性口炎病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂，SEQ ID NO :1~4所示基 因片段为检测探针。
[0014] 本发明基因芯片和试剂盒可以同时检测口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒，而且能对 口蹄疫病毒进行分型检测，特异性强，灵敏度高耗时短，检测快速，可以迅速掌握畜禽疫病 的感染情况临床应用前景良好。
[0015] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0016] 图1芯片矩阵设计
[0017] 图2水化温度优化
[0018] 图 3 封闭液配比优化。1: 0· 5 % BH4Na, 25 % Ethanol ;2: 0· 25 % BH4Na, 25 % Ethanol ;3:0% BH4Na, 25% Ethanol ;4:0. 5% BH4Na, 15% Ethanol ;5:0. 25% BH4Na, 15% Ethanol ；:0 % BH4Na, 15 % Ethanol ；7:0.5 % BH4Na, 0 % Ethanol ；8:0. 25 % BH4Na, 0 % Ethanol ；9:0% BH4Na, 0% Ethanol.
[0019] 图4探针筛选矩阵设计
[0020] 图5 口蹄疫0型探针筛选
[0021] 图6 口蹄疫Asia I型探针筛选
[0022] 图7 口蹄疫A型探针筛选
[0023] 图8水泡性口炎探针筛选
[0024] 图 9 口蹄疫 0 型芯片灵敏度。A: 10-3 ;B: 10-4 ;C: 10-5 ;D: 10-6.
[0025] 图 10 口蹄疫 A 型芯片灵敏度。A: 10-5 ;B: 10-6 ;C: 10-7 ;D: 10-8.
[0026] 图 11 口蹄疫 Asia I 型芯片灵敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0027] 图 12 水泡性口炎芯片灵敏度。A: 10-5 ;B: 10-6 ;C: 10-7 ;D: 10-8.
[0028] 图 13 口蹄疫 0 型引物的特异性实验。I :FMDV-0 ;2:FMDV-A ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0029] 图 14 口蹄疫 A 型引物的特异性实验。1:FMDV-A ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0030] 图 15 口蹄疫 Asia I 型引物的特异性实验。：FMDV-Asia I ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0031] 图 16 水泡性口炎引物的特异性实验。1:VSV ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ;4:FMDV-Asia I ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0032] 图17 口蹄疫0型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BsiO?丨醛基 基片；B:北京博奥生物有限公司晶芯辦醛基基片
[0033] 图18 口蹄疫A型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiOfl签基 基片；B:北京博奥生物有限公司晶芯M醛基基片
[0034] 图19 口蹄疫Asia I型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiO'! 醛基基片；B:北京博奥生物有限公司晶醛基基片
[0035] 图20水泡性口炎不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiO綱醛基 基片；B:北京博奥生物有限公司晶芯_醛基基片
【具体实施方式】
[0036] 一、实验材料和仪器
[0037] I. 1材料试剂：
[0038]
[0041] I. 3实验试剂的配制
[0042] 引物稀释：根据合成单，将合成的引物干粉加入适量灭菌超纯水，制成100 μΜ的 引物贮存液，使用时按照1 :4(引物贮存液：灭菌超纯水）的体积比将其稀释成20 μM的引 物使用液；
[0043] 10g/L琼脂糖凝胶：称取Ig琼脂糖凝胶，加入IOOmLl X TAE电泳缓冲液中，微波炉 加热3min，溶解完全后加入10mg/mL的EB 5 μ L，震荡混勾，倒入胶槽内，待凝固后点样；
[0044] 营养肉汤培养基：按照产品说明书，称取所需质量的培养基干粉于三角锥瓶内，加 入相应比例的去离子水，121°C灭菌20min，备用；
[0045] 营养琼脂培养基：按照产品说明书，称取所需质量的培养基干粉于三角锥瓶内，加 入相应比例的去离子水，121 °C灭菌20min，备用。
[0046] 20XSSC :称取 NaCl，175. 2g，柠檬酸三钠·2Η20，100· 5g，溶解于少量 mini-Q 超纯 水中，