条件下培养。 当细胞密度达到8X105个/mL时，进行传代培养（离心法），即以lOOOrpm，离心5min，弃掉 上清，以新鲜的10%F-12k培养基重悬细胞，以2X105个/mL的密度传代接种。
[0171] 1. 3MTT法测定本发明产物的抗肿瘤活性
[0172] 将肿瘤细胞用含有10%胎牛血清的培养基悬浮，以2X103个细胞/孔的细胞密度 接种96孔培养板（180yL/孔），37°C、5% 0)2培养过夜，每孔加入不同浓度的本发明产物， 阴性对照组加入等体积不加药物且含有1%。DMS0的培养基，37°C、5%C02培养72小时后检 测本发明产物对细胞的抑制率。
[0173] 本发明产物对细胞的抑制率采用MTT比色法检测。MTT是一种四甲基偶氮唑盐，其 水溶液外观呈淡黄色，被活细胞摄入后，在细胞内形成蓝紫色结晶甲瓒。甲瓒可用DMS0溶 解，在酶标仪上进行比色，所检测0D值的大小可反映细胞代谢活性的强弱。检测时将本发 明产物处理后的细胞培养液弃掉，按照终浓度0. 5mg/ml加入MTT在培养箱中孵育3小时后 去除MTT溶液，加入150yLDMS0,振荡器震荡10min使结晶溶解，酶标仪570nm，650nm双波 长检测。利用GraphPadPrism5. 01软件，计算药物的IC5。（半数抑制浓度）。
[0174] 本发明产物对四种肿瘤细胞系PC-3,SGC-7901，A549和MDA-MB-435S的生长抑制 作用见表1，结果显示，本发明产物对肿瘤细胞生长具有较强的抑制作用，具有开发成抗肿 瘤药物的潜力。
[0175] 表1本发明产物体外抗肿瘤活性筛选
[0176]
[0177」
[0178] 2实施例15中9a，12a-二-(3,4_二甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯的体内抗肿 瘤活性
[0179] 2. 1裸小鼠人肺癌模型建立
[0180]Balb/c裸小鼠，6-8周龄，体重18-22g，雌雄兼用，购自扬州大学比较医学中心，饲 养于SPF级动物实验室。将A549细胞在37°C、5%C02，含10%胎牛血清的DMEM培养基中 培养，将处于对数生长期的细胞用〇. 25%胰蛋白酶消化，用无菌PBS液重悬制成5X107个 /mL的单细胞悬液，每只裸小鼠于右侧腹股沟区皮下接种0. 2mL细胞悬液，每天观察各注射 点有无红肿破溃。
[0181] 2. 2抑瘤率测定
[0182] 造模7天后，注射局部出现明显皮丘，所有裸小鼠均出现直径9-llmm的皮下结节， 移植瘤模型建立。将小鼠随机分成治疗组和对照组（每组5只小鼠）。9a，12a-二_(3， 4-二甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯给药剂量为10、20、40mg/kg体重，给药频率为每天给药 (自第〇天起），均每日灌胃给药，连续15天。阳性对照组给予药物5-氟尿嘧啶，给药剂量 为20mg/kg体重。对照组注射生理盐水。观察肿瘤体积和生长速度，停药后第2天处死裸 小鼠，称体重，分离瘤组织，称取瘤质量，计算抑瘤率。抑瘤率=(1-试验组平均瘤质量/对 照组平均瘤质量）X100%。
[0183] 9a，12a-二-(3,4_二甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯对人肺癌A549裸小鼠肿瘤 生长的抑制作用见表2,结果显示，其可以剂量依赖的抑制肺癌A549细胞在动物体内的生 长，且抑制效果优于5-氟尿嘧啶，相同的剂量下，其抑瘤率高于5-氟尿嘧啶，且在整个治疗 过程中，动物的体重与对照组相比并没有明显的差异，提示本发明产物9a，12a-二_(3， 4-二甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯对小鼠无明显的毒副作用。
[0184]表2 9a，12a-二_(3,4_二甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯的体内抗肿瘤活性
[0185]
[0186] 实施例36:本发明产物的免疫抑制活性研究
[0187] 1本发明产物的体外免疫抑制活性筛选
[0188] 1.1脾细胞的制备
[0189] 健康ICR雄性小鼠，体重18_20g，购自扬州大学比较医学中心，并按规定饲养于 SPF级动物房。
[0190] 取健康ICR小鼠，颈椎脱臼处死，浸泡于75 %酒精中消毒。超净台内无菌取出小 鼠脾脏，用PBS及RPMI1640不完全培养基分别冲洗。将冲洗后的小鼠脾脏置于盛有5ml RPMI1640不完全培养基的一次性平皿（直径60X15mm)中，剪碎，使用一次性5mL注射器 活塞进行研磨并过200目筛网。细胞悬液用移液器转移至10mL玻璃离心管中。900rpm离 心51^11收集细胞，使用作18-见14(：1破除红细胞。850印111离心5111111收集细胞，用10%胎牛 血清的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，得到小鼠脾淋巴细胞悬液。台盼蓝染色，细胞计数 板计数活细胞达到95 %以上。调整脾淋巴细胞密度为5X106个/mL，待用。
[0191] 1. 2本发明产物对T细胞和B细胞增殖的抑制作用
[0192] 将按上述方法制备的小鼠脾淋巴细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，每孔 100yL。ConA、LPS及不同浓度本发明产物使用RPMI-1640完全培养液配置。
[0193]ConA刺激T细胞增殖试验分组：
[0194] 空白组：每孔分别加入100yL的RPMI-1640完全培养液；
[0195] 模型组：每孔加入50yLConA(20yg/mL)及50yLRPMI-1640完全培养液。
[0196] 给药组：每孔加入50yLConA(20yg/mL)及50yL不同浓度的本发明产物。
[0197]LPS刺激B细胞增殖试验分组：
[0198] 空白组：每孔分别加入100yL的RPMI-1640完全培养液；
[0199] 模型组：每孔加入50yLLPS(8yg/mL)及50yLRPMI-1640完全培养液。
[0200] 给药组：每孔加入50yLLPS(8yg/mL)及50yL不同浓度的本发明产物。
[0201] 每组重复5个平行孔。将96孔板置于37°C、5%C02培养箱中连续培养44h。培 养44h后，每孔加入20yL的MTT溶液（5mg/mL)，继续培养4h。1500r离心弃去上清，每孔 加入150yL的DMS0溶液，震荡lOmin直到形成的紫色的结晶溶解，按双波长校正法，使用 酶标仪于波长570nm、650nm处测定吸光度（0D值=0D5TO-0D65。）。
[0202] 抑制率（％ ) = 100X(0Dm_0DmJ/0Dm
[0203] 0DM为模型组吸光度；0Dfed为给药组吸光度。
[0204] 1. 3部分本发明产物对T细胞、B细胞的细胞毒作用
[0205] 将制备好的小鼠脾淋巴细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，每孔100yL。设空 白组、不同浓度的本发明产物组。使用RPMI1640完全培养液配制，根据不同初试结果，设 置5个浓度梯度。空白对照组给予相同体积的RPMI-1640完全培养液，每组重复5个平行 孔。将96孔板置于37°C、5%C02培养箱中连续培养44h。培养44h后，每孔加入20yL的 MTT溶液（5mg/mL)，继续培养4h。1500r离心弃去上清，每孔加入150yL的DMS0溶液，震 荡lOmin直到形成的紫色的结晶溶解，按双波长校正法，使用酶标仪于波长570nm、650nm处 测定吸光度（0D值）。
[0206] 10yM浓度下本发明产物对LPS诱导的B细胞增殖、ConA诱导的T细胞增殖的抑 制率见表3。部分本发明产物对LPS诱导的B细胞增殖、ConA诱导的T细胞增殖的抑制作 用即IC5。和对T细胞、B细胞的细胞毒作用即CC5。值如表4。结果显示，本发明产物对T细 胞、B细胞增殖具有较强的抑制作用，且对T细胞、B细胞的细胞毒作用较低。本发明产物显 示出开发成免疫抑制类药物的巨大潜力。
[0207] 表3 10yM本发明产物对T细胞、B细胞增殖的抑制作用
[0208]
[0209] 表4部分本发明产物对B细胞、T细胞增殖抑制作用即IC5。和细胞毒作用即CC5。
[0210]
[0211] a.选择性指数（SI)指CC5Q/IC5。。
[0212] 2实施例10中9a，12a-二_(邻氯肉桂酸）双氢青蒿素酯对小鼠II型胶原关节 炎（CIA)的治疗作用
[0213] 2.III型胶原关节炎（CIA)模型的建立
[0214] 健康ICR雄性小鼠，体重18_20g，购自扬州大学比较医学中心，并按规定饲养于 SPF级动物房。
[0215] 将C11(11型胶原）溶于0.lmol/L乙酸中，在4°C下搅拌使之充分溶解，质量浓度 为2g/L，置4°C冰箱中过夜；再与等体积的完全弗氏佐剂混合、乳化，制成CII乳剂（即每 mL含lmgCII和lmg卡介苗），在第0天将该乳剂于每只小鼠的尾根部皮内注射0.lmL致 炎，第20d，腹腔注射该乳剂0.lmL作为激发注射。
[0216] 2. 2实验分组
[0217] 将模型小鼠随机分为5组
[0218]空白组：10 只，溶剂CMC_Na20ml/kg
[0219]模型组：10 只，溶剂CMC-Na20ml/kg
[0220] 给药组：10 只，75mg/kg
[0221] 阳性药组：10只，青蒿琥酯75mg/kg
[0222] 于注射CII乳剂19天后开始灌胃给药，每天1次，连续20d
[0223] 2. 3关节炎指数考察结果
[0224] 关节炎指数（AI):观察小鼠体重、红斑、尾结节、足肿胀等情况，按下列评分标准 计算多发性关节炎的严重程度，
[0225] 0分：正常；
[0226] 1分：仅限于部分关节或脚趾的轻度发红或肿胀；
[0227] 2分：趾关节和足拓或踩关节出现中度肿胀；
[0228] 3分：躁关节严重肿胀或踩关节以下全部肿胀；
[0229] 4分：整个脚爪全部肿胀或关节严重变形；
[0230] 4个脚爪的评分之和作为每个小鼠的关节炎评分。
[0231] 结果见表5,实施例10中9a，12a-二-(邻氯肉桂酸）双氢青蒿素酯对CIA鼠发 挥治疗作用，减缓小鼠的关节炎症状况、减少关节损伤，且效果优于青蒿琥酯。因此，其具有 发展成为治疗RA药物的潜质。
[0232] 表5关节病变轻重程度评分结果（又±S:)
[0233]
【主权项】
1. 一种结构如通式I和通式II所示的新型羟基双氢青蒿素衍生物或其药学上可接受 的盐，或其对映异构体、非对映异构体或外消旋体，其中， X为-或=; R为任选1-5个相同或不同的取代基，为氢、羟基、甲基、乙基、丙基、氟、氯、溴、碘、甲氧 基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、氰基、氨基、乙氧基、二甲氨基、丙氧基、亚甲二氧基。2. 权利要求1所述的通式I和II的衍生物、其药学上可接受的盐，或其对映异构体、非 对映异构体或外消旋体，其中， X为_，R分别独立地优选氢。3. 权利要求1所述的通式I和II的衍生物、其药学上可接受的盐，或其对映异构体、非 对映异构体或外消旋体，其中， X为=，R分别独立地优选氢、甲基、氟、氯、溴、甲氧基、硝基、三氟甲基。4. 权利要求1所述的通式I和II的衍生物、其药学上可接受的盐，或其对映异构体、非 对映异构体或外消旋体， 9a，12a-二-(肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(对甲基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(对氟肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(对氯肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(对甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(对溴肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(对硝基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(对三氟甲基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(邻氟肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(邻甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(邻氯肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二-(间氯肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(间甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二- (2,6-二氯肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(3,4_二甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a-二_(2,3,4_三甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a，12a_二_(3,4,5_三甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9 a，12 a-二-(氢化肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(对甲基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(对氟肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(对氯肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(对甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(对溴肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(对硝基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(对三氟甲基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(邻氟肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(邻甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(邻氯肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(间氯肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a-(间甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a_(2,6-二氯肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a_(3,4_二甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a_(2,3,4-三甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9a-羟基-12a_(3,4,5-三甲氧基肉桂酸）双氢青蒿素酯； 9 a -羟基-12 a -(氢化肉桂酸）双氢青蒿素酯。5. -种药用组合物，包括权利要求1-4中任何一项的新型羟基双氢青蒿素衍生物、其 药学上可接受的盐，或其对映异构体、非对映异构体或外消旋体，作为活性成分以及药学上 可接受的赋型剂。6. 权利要求1-5中任何一项的新型羟基双氢青蒿素衍生物、其药学上可接受的盐，或 其对映异构体、非对映异构体或外消旋体，预防和/或治疗癌症、预防和/或治疗自身免疫 性疾病药物中的用途。
【专利摘要】本发明属于化学医药领域，涉及一类新型羟基双氢青蒿素衍生物及其应用。具体地，本发明公开了一类结构如式I和式II所示的羟基双氢青蒿素衍生物或其药学上可接受的盐，或其对映异构体、非对映异构体或外消旋体，其中X、R如本文中定义。本发明还公开了所述化合物在预防和/或治疗癌症、预防和/或治疗自身免疫性疾病药物中的用途。
【IPC分类】A61P35/00, A61P37/06, C07D493/20, A61K31/357
【公开号】CN105037384
【申请号】CN201510245363
【发明人】刘吉华, 余伯阳, 邓婷, 许藏藏
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年5月13日