本SAYNO公司），PCR扩增仪（英国PERKIN ELMER公司），流式细胞仪（美国FACSC ALIBUR公司），电子天平JA5003 (北京赛多利斯公司），倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公 司），超净工作台（美国ESCO公司），台式离心机Biofuge primo R(德国HERAEUS公司）， CO2恒温培养箱（美国SHELLA公司），电热恒温干燥箱SKG-02 (中国恒丰公司），全自动高压 蒸汽消毒器（日本SANYO公司），全自动酶标分析仪（美国BIO-RAD公司），普通显微镜（日 本OLYMPUS公司），荧光显微镜（日本OLYMPUS公司），低温高速离心机Labofuge400R(德 国HERAEUS公司）。
[0034] 二、试验方法
[0035] 1、细胞培养
[0036] 用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基培养人急性单核细胞性白血病细胞 株U937细胞和急性髓系部分分化型白血病细胞株HL60细胞。在37°C，5% 0)2饱和湿度 条件下传代培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态，U937细胞为轻微贴壁生长细胞，呈 70% -80%融合状态时传代，隔日换液，每2-3天传代一次。HL60细胞为悬浮生长细胞，每 2-3天传代一次。所有实验均在细胞处于对数生长期时进行
[0037] 2、Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒检测细胞增殖反应
[0038] 取对数生长期人白血病细胞株U937细胞和HL60细胞，充分吹打混匀成单细胞悬 液并在镜下计数后，分别用RPMI1640完全培养基调整细胞密度为2 X 105/mL，将细胞接种于 96孔培养板，每孔含细胞悬液50 μ L，每组设3个平行复孔，共设5个组。实验组分别加入经 不同浓度的化合物（I)溶液50 μ L，使药物终浓度分别为1、10、100 μ mol/L，各培养孔终体 积为100 μ L，每一浓度均设3个平行复孔。并设不含药物、只含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基的1640对照组，以及不含药物含2%二甲基亚砜的DMSO对照组。将96孔板置入培 养箱培养48h后，参照CCK-8试剂盒说明书，向各培养孔加入CCK-8溶液10 μ L，再置入培养 箱孵育2h，选择450nm波长，在酶标仪上检测各孔光吸收值（0D14值）。上述实验重复3次。 生长抑制率（％ )=(对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值X 100 %。计算药物对细 胞增殖的抑制率并据抑制率求出48h的半数细胞抑制浓度（IC50)。再根据IC50值确定要检 测的各指标的药物作用浓度及分组。IC50计算公式如下：lgIC50 = Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4] (Xm为最大剂量的对数，I为最大剂量与相邻剂量比值的对数，P为阳性反应率之和，Pm为 最大阳性反应率，Pn为最小阳性反应率）。在上述实验基础上，选用倍比稀释后的三个化 合物（I)浓度（40、80、160ym〇l/L)为工作浓度，进行CCK-8实验，并使药物终浓度分别为 20 ymol/L、40 ymol/L、80 μ mol/L，计算药物对细胞增殖的抑制率。
[0039] 3、流式细胞术（FCM)检测细胞凋亡和细胞周期分布
[0040] 分别取对数生长期的U937细胞和HL60细胞，调整细胞密度为I X 105/mL，接种 于12孔培养板中，每孔加入细胞悬液lmL，分别设三个加药的处理组及一个不含药物的 对照组，向处理组中加入化合物（I)，使各处理组的终浓度分别为20 ymol/L、40 ymol/L、 80 μ mol/L。放入培养箱培养48h后，分别收集经不同浓度化合物（I)作用的U937细胞和 HL60细胞，1500rPm离心5min，去上清，PBS缓冲液洗涤细胞1次，离心去掉PBS，用预冷的 70%乙醇4°C固定lh，离心弃固定液，PBS重悬5min，离心去掉PBS，加入浓度为lOOyg/mL 的RNA酶250 μ L，消化IOmin后经300目筛网过滤；加入浓度为50 μ g/mL的PI染料500 μ L， 4°C避光放置30分钟后上机，流式细胞仪检测分析细胞凋亡率和细胞周期分布。
[0041] 4、统计学分析
[0042] 所有数据采用SPSS 13. 0统计学软件进行统计分析，实验结果以[士s表示，两个 独立样本组间均数比较用t检验，多组的组间比较用方差分析，P〈0. 05表示差异有显著性， P>0. 05为差异无显著性。
[0043] 三、结果及结论
[0044] 1、化合物（I)能有效抑制人白血病细胞株U937和HL60增殖
[0045] CCK-8试剂盒检测细胞增殖状态的结果显示，与对照组相比，化合物（I)在1~ 100 ymol/L浓度范围内对U937和HL60细胞增殖有明显的抑制作用，存在剂量-效应关 系，抑制率分别随着药物浓度的增加而增加。不同浓度之间抑制率比较具有统计学差异 (P〈0. 05)，以100 μ mol/L化合物（I)作用48h时对U937的抑制率最高，达到83. 97%，化合 物（I)对HL60增殖抑制作用不及U937明显，但作用48h的最高抑制率也能达到71. 64%。 (见表1，与对照组比（0ymol/L)，*P〈0.05)。不同浓度化合物（I) (l、10、100ymol/L)作用 48h时，U937和HL60细胞增殖的半数抑制浓度（IC50)分别为：21·86μπιο1/1，46·41μπιο1/ L，在此实验结果基础上，选用倍比稀释后的三个化合物（I)浓度（40、80、160ym〇l/L)为工 作浓度，进行CCK-8实验，并使药物终浓度分别为20 ymol/L、40 ymol/L、80 ymol/L，计算 药物对细胞增殖的抑制率。试验结果表明，化合物（I)在20、40、80ymol/L作用浓度范围 内存在明显的剂量-效应关系，抑制率分别随着药物浓度增加而增加，与对照组相比具有 统计学差异（Ρ〈〇· 05)(见表2,与对照组比（0 μ mol/L)，*Ρ〈0· 05) 〇
[0046] 2、化合物（I)对U937和HL60细胞周期的影响
[0047] 流式细胞术检测结果显示，化合物（I)能够使U937细胞阻滞在G0/G1期，而使 HL60细胞阻滞在S期。化合物（I)作用后U937细胞G0/G1期细胞明显增加（由51. 30% 上升至94. 10% )，G2/M、S期细胞明显减少；而HL60细胞则主要发生S期阻滞（由39. 48% 上升至67. 93% )，G0/G1、G2/M期细胞减少，与对照组相比，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。 结果见表3(注：与对照组比（0ymol/L)，*P〈0. 05)及表4(注：与对照组比（Ομπιο?/ L), *Ρ〈0.05)。
[0048] 表1化合物⑴对U937和HL60细胞增殖的抑制作用（X土 s，η = 3)
[0049]
[0056] 实施例3
[0057] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0058] 实施例4
[0059] 口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制 成口服液。
[0060] 实施例5
[0061] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如 酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0062] 实施例6
[0063] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0064] 实施例7
[0065] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石 酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌 熔封得粉针剂。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I )，2. 权利要求1所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)补 骨脂干燥的成熟果实粉碎，用85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石 油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇 萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用15%乙醇和75%乙醇洗 脱，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤（b)中75 %乙醇洗脱 浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、 12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2用十八烷基 硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱 体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I )。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树 脂。4. 药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I )和药学上可接 受的载体。5. 权利要求1所述的化合物（I )在制备治疗白血病的药物中的应用。6. 权利要求4所述的药物组合物在制备治疗白血病的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的三萜化合物及其制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的三萜类化合物，可以从补骨脂干燥的成熟果实中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能抑制白血病细胞株U937和HL60的增殖，可以用来开发成治疗白血病的药物。
【IPC分类】A61P35/02, C07C59/82, C07C51/47, A61K31/185
【公开号】CN105061197
【申请号】CN201510541034
【发明人】林天样
【申请人】林天样
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月28日