用于肿瘤过继性免疫的高增殖力、高杀伤力nk细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞免疫领域，设及一种肿瘤免疫细胞，具体设及一种用于肿瘤过继 性免疫的高增殖力、高杀伤力NK细胞。
【背景技术】
[0002] 过继性细胞免疫治疗（ACI)是将淋己细胞经体外刺激培养后回输给肿瘤病人，直 接杀伤肿瘤细胞或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，进行肿瘤治疗的一种生物治疗方 法。近年来，随着医学技术的发展，基于NK细胞的肿瘤过继性细胞免疫治疗应用越来越广 泛。NK细胞主要分布在骨髓、外周血和脾脏，是占外周血淋己细胞10%~20%的天然免疫 系统的主要效应细胞。主要参与机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的过程。在免疫反应 的早期能够分泌不同的细胞因子和各种趋化因子W调节机体获得性免疫应答，从而在天然 免疫与获得性免疫之间起到了很好的桥梁作用。
[0003] NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可W在天然免疫系统发挥其主要杀 瘤效应，而且在免疫反应的早期可W分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得 性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来应用于临床的过程中，其 抗肿瘤治疗的安全性和有效性得到了充分的肯定。但是NK细胞仅占外周血的淋己细胞的 10%~20%，正常人体外周血中NK细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。因此，为了 尽可能获得足够数量的高质量的NK细胞，人们提出了通过体外细胞因子的刺激、培养进行 相对大规模NK细胞的制备的想法。目前文献报道的许多细胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、 比-18等单独或组合均能有效地诱导、刺激特定的细胞增殖和促进其分化成熟，其中IL-2 和IL-15的作用尤为明显。发明人前期工作针对文献报道的4种高效的NK细胞体外扩增 方案，分别从扩增倍数、细胞表型W及杀伤活性等方面进行了研究，认为IL-2和IL-15的细 胞因子组合在体外扩增中可W高效稳定的获得扩增产物，但与发明人理想的效果仍有一定 差距，有待进一步研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种高增殖力和高杀伤力的NK细胞及其体外培养方法。 阳〇化]上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0006] 一种体外扩增NK细胞的方法，包括W下步骤：
[0007] (1)将浓度为0.Ol~3.Omg/ml的抗人CD3单克隆抗体、0.Ol~3.Omg/ml的抗人 CD16单克隆抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为室溫，解育时间为0. 5~化；
[0008] (2)将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在上述的细胞培养 瓶中，刺激12~2地；
[0009] (3)加入NK细胞培养用无血清培养液和浓度为20~50ng/ml的比-2、浓度为 20~50ng/ml的比-15W及浓度为30~80ng/ml的SepulturinA,刺激12~8地，然后转 入细胞抬养袋中继续抬养；
[0010] (4)收获NK细胞。
[0011] 进一步地，所述解育时间为比。
[0012] 进一步地，包被在细胞培养瓶中的抗人CD3单克隆抗体浓度为0. 15mg/ml。
[0013] 进一步地，包被在细胞培养瓶中的抗人CD16单克隆抗体浓度为0. 15mg/ml。
[0014] 进一步地，将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在包被有抗 人CD3和抗人CD16单克隆抗体的细胞培养瓶中刺激16h。
[0015] 进一步地，所述]X-2浓度为35ng/ml。
[0016] 进一步地，所述比-15浓度为35ng/ml。
[0017] 进一步地，所述SepulturinA浓度为 55ng/ml。
[0018] 上述的体外扩增NK细胞的方法制备的NK细胞。
[0019] 所述NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0020] 本发明的有益效果：本发明提供了一种体外扩增NK细胞的方法，该方法可W获得 高增殖力、高杀伤力的NK细胞，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。本申请中的生产设备都是本领 域的常用设备，应当理解，下列所述的实施例仅用W例示本发明，并不用于限定本发明。如 无特殊说明，实施例中所用方法均为常规方法，所用仪器、材料、试剂等，如无特殊说明，均 可通过商业途径获得。S巧uhurinA的结构及制备方法见Hy化oxyclerodanesfromSalvia shannoni，J.化t.Prod.，2013, 76,1970-1975。
[0022] 实施例I:本发明提供的体外扩增NK细胞的方法
[0023] 预先在细胞培养瓶中加入含有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的包被液，室溫解 育比，抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的终浓度均为0. 15mg/ml。
[0024] 通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，将采集的血样转至离屯、管；700g 罔心分罔lOmin,吸取上层血浆抬养时备用；用0.9%生理盐水血样将柄;本还原至原体积， 混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g离屯、20min;吸取分离液界面乳白色单个核细胞 层；离屯、洗涂2次并计数；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.OXlOVml。 阳0巧]转入预先用抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶中刺激1化后，加 入 35ng/ml的]X-2、35ng/ml的]X-15 和 55ng/ml的SepulturinA继续培养 72h。 阳0%] 此后用含有0.5%人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为1XioVml,补加 IL-2和IL-15至原浓度，转入细胞培养袋中培养，每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-15 的无血清培养基，维持细胞浓度在2XlOVml左右，14天后即可得到大量扩增的高纯度、高 毒性的NK细胞。
[0027] 实施例2 :本发明提供的体外扩增NK细胞的方法
[0028] 预先在细胞培养瓶中加入含有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的包被液，室溫解 育化，抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的终浓度均为0.Olmg/ml。
[0029] 通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，将采集的血样转至离屯、管；700g 离屯、分离lOmin，吸取上层血浆培养时备用；用0. 9%生理盐水血样将标本还原至原体积， 混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g离屯、20min;吸取分离液界面乳白色单个核细胞 层；离屯、洗涂2次并计数；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至I.OXlOVml。
[0030] 转入预先用抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶中刺激24h后，加 入 20ng/ml的]X-2、20ng/ml的]X-15 和 30ng/ml的SepulturinA继续培养 84h。
[0031] 此后用含有0.5%人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为IXlOVml，补加 IL-2和IL-15至原浓度，转入细胞培养袋中培养，每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-15 的无血清培养基，维持细胞浓度在2XlOVml左右，14天后即可得到大量扩增的高纯度、高 毒性的NK细胞。 阳〇巧实施例3 :本发明提供的体外扩增NK细胞的方法
[0033] 预先在细胞培养瓶中加入含有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的包被液，室溫解 育0.化，抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的终浓度均为3.Omg/ml。
[0034] 通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，将采集的血样转至离屯、管；700g 离屯、分离lOmin，吸取上层血浆培养时备用；用0. 9%生