理盐水血样将标本还原至原体积， 混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g离屯、20min;吸取分离液界面乳白色单个核细胞 层；离屯、洗涂2次并计数；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.OXlOVml。
[0035] 转入预先用抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶中刺激1化后，加 入 50ng/ml的比-2、50ng/ml的比-15 和 80ng/ml的SepulturinA继续培养 12h。
[0036] 此后用含有0.5%人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为IXioVml，补加 IL-2和IL-15至原浓度，转入细胞培养袋中培养，每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-15 的无血清培养基，维持细胞浓度在2XlOVml左右，14天后即可得到大量扩增的高纯度、高 毒性的NK细胞。
[0037] 实施例4 :实施例1的对比实施例
[0038] 预先在细胞培养瓶中加入含有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的包被液，室溫解 育比，抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的终浓度均为0. 15mg/ml。
[0039] 通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，将采集的血样转至离屯、管；700g 罔心分罔lOmin,吸取上层血浆抬养时备用；用0.9%生理盐水血样将柄;本还原至原体积， 混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g离屯、20min;吸取分离液界面乳白色单个核细胞 层；离屯、洗涂2次并计数；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.OXlOVml。
[0040] 转入预先用抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶中刺激1化后，加 入35ng/ml的比-2和35ng/ml的比-15继续培养72h。
[0041] 此后用含有0. 5 %人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为1XlOVml，补加 IL-2和IL-15至原浓度，转入细胞培养袋中培养，每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-15 的无血清培养基，维持细胞浓度在2XlOVml左右，14天后即可得到扩增的NK细胞。 阳0创实施例5 :实施例1与实施例4扩增倍数的比较
[0043] 分别在第0、7、14及21天从实施例1与实施例4取培养细胞，用台吩蓝染色后计 数，将计数当天的细胞总数除W培养前的细胞数（即第0天），数值即为细胞的扩增倍数。W此方法可W动态比较实施例1与实施例4细胞的扩增情况，结果如表1所示：在培养的第 7、14、21天，实施例1的NK细胞扩增倍数均显著高于实施例4,P< 0. 01。 W44] 表1中"**"指对于实施例4来说，P< 0.Ol。 W45] 表1实施例1与实施例4扩增倍数的比较
阳047] 实施例6 :实施例I与实施例4扩增细胞纯度的比较
[0048] 在第21天分别从实施例1与实施例4培养体系取细胞培养液，PBS洗涂两次， 洗涂后调整细胞浓度为2X1 〇5/ml，加入流式抗体，4 °C避光30min，洗掉多余抗体，PBS 重悬进行细胞表型的流式检测。所用抗体来自美国抓公司，结果发现实施例4扩增细 胞中CD3CD(16+56rNK细胞占 81.27 + 1. 12 %，实施例 1 中CD3CD(16+56rNK细胞占 91. 93 + 1. 91 %，两组无显著性差异（P> 0. 05)。
[0049] 实施例7 :实施例1与实施例4所得NK细胞对A549细胞杀伤活性的比较
[0050] W处于对数生长期的A549细胞作为祀细胞，将其调整为1XlOVmU将实施例1与 实施例4方法培养21天NK细胞作为效应细胞，按1 : 1和2 : 1和5 : 1和10:1的效祀 比将效应细胞和祀细胞混合，同时设效应细胞孔、祀细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终 体积为200y1，37°C、5%C〇2培养箱中解育，1化后每孔加入20y1CCK-8溶液，继续解育 地，用酶标仪检测450nm时的OD值，按W下公式计算杀伤率：
[0051] 杀伤率（％ ) = [ 1-(实验孔OD值-效应孔OD值/祀细胞孔OD值）]X100 %
[0052] 结果如表2所示，在不同效祀比，实施例1所得NK细胞对A549细胞的杀伤活性均 显著高于实施例4所得NK细胞（P< 0. 01)。 阳05引注："**，，指相对于实施例4来说，P< 0. 01。
[0054] 表2实施例1与实施例4所得NK细胞对A549细胞杀伤活性的比较
[0056] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种体外扩增NK细胞的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 将浓度为〇.Ol~3.Omg/ml的抗人⑶3单克隆抗体、0.Ol~3.Omg/ml的抗人⑶16 单克隆抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为室温，孵育时间为〇. 5~6h; (2) 将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在上述的细胞培养瓶 中，刺激12~24h; (3) 加入NK细胞培养用无血清培养液和浓度为20~50ng/ml的IL-2、浓度为20~ 50ng/ml的IL-15以及浓度为30~80ng/ml的SepulturinA，刺激12~84h，然后转入细 胞培养袋中继续培养； ⑷收获NK细胞。2. 根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述孵育时间为lh。3. 根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：包被在细胞培养瓶中 的抗人⑶3单克隆抗体浓度为0. 15mg/ml。4. 根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：包被在细胞培养瓶中 的抗人⑶16单克隆抗体浓度为0. 15mg/ml。5. 根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：将从外周血中分离获 得的单个核细胞用无血清培养液接种在包被有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的细胞培 养瓶中刺激16h。6. 根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述IL-2浓度为 35ng/ml〇7. 根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述IL-15浓度为 35ng/ml〇8. 根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述SepulturinA浓 度为 55ng/ml。9. 权利要求1-8任一所述的体外扩增NK细胞的方法制备的NK细胞。10. 权利要求9所述NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开用于肿瘤过继性免疫的高增殖力、高杀伤力NK细胞，制备方法包括以下步骤：(1)将浓度为0.01～3.0mg/ml的抗人CD3单克隆抗体、0.01～3.0mg/ml的抗人CD16单克隆抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为室温，孵育时间为0.5～6h；(2)将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在上述的细胞培养瓶中，刺激12～24h；(3)加入NK细胞培养用无血清培养液和浓度为20～50ng/ml的IL-2、浓度为20～50ng/ml的IL-15以及浓度为30～80ng/ml的SepulturinA，刺激12～84h，然后转入细胞培养袋中继续培养；(4)收获NK细胞。该方法可以获得高增殖力和高杀伤力的NK细胞，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。
【IPC分类】C12N5/0783, A61P35/00, A61K35/17
【公开号】CN105219713
【申请号】CN201510809118
【发明人】崔长友
【申请人】崔长友
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月20日